表层获取的分层样品拉曼信号是有效深度下的各层物质信号的叠加贡献。 以两层样品为例, 识别拉曼信号归属要求在空间位置、 时间和激发光源条件改变时获取的混合信号中, 表层和次表层贡献呈现出差异性。 在均匀的浑浊介质检测中, 传统的后向散射拉曼在不同空间位置获取相同的混合信号^[5], 该混合光谱主要表现为表层物质的拉曼信号, 因此难以实现次表层信号的识别任务。 SORS技术[图1(a)]采集的拉曼光谱为表层(A)和次表层(B)的混合光谱, 将点激光激发位置(D₀)和探测采集位置(D_0~n)分布在一条直线上, 激发出的拉曼光子在物质中发生散射、 吸收和边界逸散。 随着光谱采集位置偏移激光入射点的距离增加, 探测到的表层和次表层光子数量也不断减少, 拉曼光谱整体强度衰减。 由于表层光子逸散损失远大于次表层造成表层光谱强度更快的衰减, 因此混合光谱中表层和次表层的贡献随偏移距离发生改变, 这种差异特性就是SORS技术进行次表层信号识别和增强的基础。

图1

Fig.1

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	图1 空间偏移拉曼技术机理及测量方式Fig.1 Mechanism and measurement modes of spatially offset Raman spectroscopy technique

通过SORS技术实现样本次表层检测的首要工作是将光源激发部件和信号采集部件以空间偏移的形式组装并采集光谱数据。 为实现多样化和高精度的检测需求, SORS测量发展为多种测量变体结构。 散焦SORS[图1(b)]在传统后向散射拉曼基础上, 调整样品偏离激光和探测器焦点而形成的一种微尺度SORS次表层信号增强技术。 该技术激光覆盖区域和拉曼采集区域较大, 通常不易受样本不同位置差异的影响。 散焦SORS的空间分辨率低于传统拉曼探测, 因其依赖于光的漫射分量, 其优势在于该技术可以在常规拉曼上实施, 允许分析薄而高度浑浊的分层样品^{[6, 7]}。 点状移动SORS[图1(c)]为简单的常规拉曼变体, 将检测探头与激光入射点按特定距离分布进行光谱数据测量, 该技术可以调整探头位置和角度沿特定路径采集一个或多个点的拉曼光谱并记录空间偏移距离, 具有非常高的灵活性^[8]。 点状SORS被应用在便携式拉曼检测设备上, 针对行业的不同需求制定探头和数据处理策略, 但是由于每次采集单点的拉曼光谱, 信号噪声相对较大, 多次采集耗费时间较长。 环状采集SORS[图1(d)]使用常规拉曼点激光作为激发部件, 光谱采集一般通过透镜在样品表面形成环状探测。 激光入射点为环状探测的中心, 空间偏移距离为探测环的半径。 对于探测不同的对象, 需要根据该测量方式下的最佳偏移距离来调整探测镜头或透镜聚焦位置^[9]。 环状采集相当于相同偏移距离下多点采集的集合, 在信号质量上优于点状移动SORS, 对于样本存在分布不均匀情况具有良好的适应能力^[10]。 环状采集SORS的数据分析通常采用取均值的策略, 也可通过各采集位置的光谱差异评估样本的横向异质性。 环状照明SORS[图1(e)]与环状采集非常相似, 其中探测部件和激发部件发生位置置换。 拉曼信号通过散射成环状的激光激发, 光子朝各个方向传递, 探测器仅收集中心位置的拉曼光谱信号。 空间偏移距离 (环状光源的半径)随着光源的变化而改变。 该技术通常应用在对激光功率敏感的样品, 这些样本不能采用增大激光功率来增强拉曼信号, 环形照明的低功率积累保证样品在激光入射后保持理化品质的稳定^[11]。 同时有效增加空间偏移距离, 解决了空间偏移距离较短时内部探测能力不足的问题。 线状移动SORS[图1(f)]融合了环状采集和环状照明SORS的优点, 形成一种拉曼信号激发累计和拉曼信号采集累计的双重叠加技术来提升信噪比^[12]。 该技术能在低曝光下获取同质量的拉曼光谱, 显著提升检测速度, 同时通过线扫描获取整个样本的图像, 具有次表层物质可视化的潜力。 目前, 线状移动SORS的系统构造比较简单, 通过分束器(beamsplitter)产生线光源和CCD狭缝进行均质样品的线扫描采集, 然后将扫描线上所有像素点取均值后进行数据分析工作^[13]。

上述SORS数据测量技术是在特定任务下(确定最佳偏移距离)的分层样品次表层检测, 然而最佳偏移距离随样品的光学特性和测量设备参数的变化而动态变化。 工程应用的系统应具有个体差异的适应能力, 不应把偏移距离的确定和后续检测任务隔离开。 虽然可以通过多次调整拉曼激发和探测的相对位置实现不同偏移距离的数据采集, 但是考虑到时间损耗、 信号质量、 调整难度及数据分析的需要, 同时获取包括不同偏移距离的混合拉曼信号是一种最佳的选择。 在同一条线集成多个光纤探头的分布式SORS[图1(g)]和CCD狭缝采集的线扫描SORS[图1(h)]保证了同时采集激光入射点和规律性偏移位置的拉曼光谱, 在待测物拉曼光学特性未知的前提下, 这些光谱形成的拉曼散射图像(Raman scattering image)能适应个体差异和丰富的检测需求。 基于点光源线扫描SORS测量技术的空间分辨率较高, 获取的信息更丰富, 但其本质也是由每个偏移位置采集的拉曼光谱的拼接图像, 可以通过合适数据分析技术自适应的分析和纯化次表层物质拉曼光谱。

2.1.1 专家经验

在SORS技术探测未知的分层物质时, 通过反复试验获取不同偏移距离的拉曼光谱, 以特定光谱峰或光谱均值为基准进行标准化, 进而突出次表层拉曼光谱峰的贡献。 可以发现随着偏移距离增加, 达到探测器的光子减少, 随机噪声保持不变, 因而信噪比降低。 研究学者直接观察处理后的不同偏移距离的拉曼光谱, 综合考虑次表层信号强度和信噪比, 确定最佳偏移距离。 由于操作简单, 这种通过专家经验确定最佳偏移的方法以被用于分析SORS数据中^{[14, 15]}, 然而专家需求和人为误差也限制了该技术的推广应用。

2.1.2 信噪比

为保证在一致性的基础上自动确定最佳偏移距离, 将专家经验转化为两个目标进行数据化: 减少表层信号干扰和保证次表层信噪比。 如图2(a)所示, 将SORS理解为表层谱峰[t(ν~)]和次表层谱峰[b(ν~)]及图2(b)所示为随偏移距离对应的表层贡献[T(s)]和次表层贡献[B(s)]。 最佳偏移的选择不仅追求大的B(s)/T(s), 还要考虑到表层散射噪声。 Jason^[16]等在散射噪声限制(shot-noise-limited)检测下, 通过式(1)度量次表层信噪比。

图2

Fig.2

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	图2 (a)表层t(Δ ν~)和次表层b(Δ ν~)拉曼光谱及典型谱峰; (b)偏移相关拟合系数T(s)、 B(s)和(c)两个次表层峰值的归一化SNR与偏移量的关系[16]Fig.2 (a) Raman spectra and typical peaks of surface t(Δ ν~) and subsurface b(Δ ν~); (b) offset dependent fit coefficients T(s), B(s); (c) normalized SNR versus offset for two bottom-layer peaks

SNR(Δν~, s)=b(Δν~)B(s)[t(Δν~)T(s)+b(Δν~)B(s)]1/2(1)

次表层拉曼光谱的每个谱峰的信噪比[图2(c)]所示(SNR)对空间偏移量的依赖是唯一的, 并且在特定偏移距离下达到峰值。 典型光谱峰的偏移量通常作为检测过程的最佳偏移距离来获取光谱, 然后进行次表层物质成分的评估。

缩放减法(scaled subtraction)可进一步获得纯净的双层样品拉曼光谱。 首先提取零空间偏移光谱(相当于传统的后向散射拉曼光谱)和信噪比确定的最佳偏移处采集的拉曼光谱, 通过普通最小二乘(ordinary least squares, OLS)拟合, 获得两层光谱的贡献倍增因子, 按照比例相减剔除不需要的层的贡献, 实现特定层样本光谱数值恢复。

最佳偏移距离受待测物的光学特性、 表层厚度、 激光功率和曝光时间及仪器噪声的影响, 无论人为或自动信噪比识别的方法都存在误差, 同时最佳偏移距离虽然增加了次表层的光谱贡献, 但没有完全剔除表层光谱的干扰。 考虑到拉曼光谱的分子特异性, 通过拉曼谱峰的位置、 强度、 半峰全宽(full width at half maxima, FWHM)等特征可实现物质成分的定性和定量表征, 因此确定典型光谱峰的归属进而重建次表层拉曼光谱是一种保存主要特征进行次表层评估的有效方法。

2.2.1 二维相关光谱法

二维相关分析是一种用于解释在特定外部扰动下获得光谱数据的分析技术。 Kim^[17]等首次提出了广义二维相关分析方法将该技术推广到包括光谱学在内的各个领域。 该技术将原始光谱延伸到二维空间, 提高谱图分辨率, 通过谱峰的相关性可估计成分的相互作用, 异步谱图中交叉峰的信号可以辅助判别谱峰的归属。 图3(a—e)分别为高密度聚乙烯瓶中葡萄糖在零偏移和偏移距离3~7 mm的异步二维相关谱, 图3(a, b)和(c, d)分别为识别谱峰重构的高密度聚乙烯瓶和葡萄糖谱。 根据正交叉峰和负交叉峰判断高密度聚乙烯瓶子分子振动引起的峰强度降低比葡萄糖变化更快, 判断谱峰归属后从SORS中重构分层样品原始光谱。

图3

Fig.3

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	图3 (a)高密度聚乙烯瓶中葡萄糖的异步二维相关谱, 红色和蓝色的线分别代表正交叉峰和负交叉峰; (b, e)空瓶和葡萄糖粉末的拉曼光谱; (c, d)识别谱峰重构的高密度聚乙烯瓶和葡萄糖的谱[17]Fig.3 (a) Asynchronous 2D correlation spectrum of SORS results of Glu in a HDPE bottle. The red and blue lines represent positive and negative cross peaks, respectively; (b, e) Raman spectra of the vacant bottle and Glu powder; (c, d) Reconstructed spectra of the HDPE bottle and Glu[17]

2.2.2 广义高斯拟合法

广义高斯拟合法是Liu^[18]等为实现食品次表层拉曼谱峰信号识别提出的一种典型峰偏移特性拟合方法。 根据拉曼光谱传输及散射特性, 区分表层和内部食品对拉曼谱峰的敏感性差异, 进而实现双层样品的拉曼光谱峰归属鉴别。 首先将线扫描拉曼成像系统采集的散射图像处理后自动提取典型拉曼谱峰, 并将偏移激光点谱峰的衰减信息标准化; 然后将衰减特征输入构建的广义高斯拟合模型 Pnorm(Xi|α, β, μ, τ)=αe[-(β|Xi-μ|)τ], 其中 α表示尺度参数, β表示形状参数, μ表示平均值参数, τ表示统计参数, 通过基于Levenberg-Marquardt算法的非线性最小二乘法优化模型中的四个参数, 可以很好地表征材料的拉曼峰强度与激光入射点距离之间的关系; 最后分析光谱峰对应的残差分布直方图并选择合适的阈值识别次表层物质光谱峰, 进而重构分层样品拉曼光谱。 次表层信号识别方法是在典型谱峰上判断其归属, 对于微弱谱峰、 重叠峰, 该方法难以实现有效的识别。

为充分利用光谱曲线中的有效信息, 同时降低表层物质拉曼光谱的干扰, 实现内部食品完整拉曼光谱(包括弱峰、 重叠峰、 背景信息)分离是必要的。 SORS检测数据是空间条件变换下分层样本的拉曼光子分布响应。 图4(a)为双层样品表面上收集的偏移激光入射点不同位置的光谱曲线组成的拉曼散射图像。 表层和次表层的混合散射图像可以理解为两层物质(x₁, x₂)的散射图像的叠加。 每层散射图像的横向是光谱通道, 纵向是该位置探测器信号的贡献(a₁, a₂)。 将分层物质的光谱和贡献重新组合为双线性加法模型, 该模型统一为 X=AST+N, 其中X为混合散射图像, N为环境变化、设备不稳定、人为操作等引起的随机噪声干扰, S和A被理解为源信号和混合矩阵。 次表层信号分离要求在采集散射图像X已知的条件下, 通过不同的信号分解策略和约束, 估计并优化源信号S和混合矩阵A。 最后根据分离的拉曼全谱, 通过常规光学建模分析技术, 预测内部食品品质和安全特性。

图4

Fig.4

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	图4 双层样品拉曼散射图像对应的双线性模型及信号分离方法Fig.4 Bilinear model and signal separation methods corresponding to Raman scattering image of double-layer samples

2.3.1 多元曲线分辨

多元曲线分辨(multivariate curve resolution, MCR)或自模型曲线分辨率(self-modeling curve resolution, SMCR)起源于求解加性双线性混合模型, 根据两种物质具有物理和化学意义的特性选择合适的约束来分解和优化源信号^[19]。 由于多元曲线分辨解释了实际物质的预期自然属性, 该模型已逐渐发展成为解决混合物信号分解问题的通用方法。 在拉曼光谱检测领域, 特定的约束主要包括光谱的非负性、 单峰性、 谱峰形态、 混合矩阵的单调性等。 拉曼检测系统获得的先验信息决定了能否在双线性模型中找到可行解, 最终影响MCR信号分离的效果^[20]。 通常采用非负矩阵分解(NMF)作为MCR信号分离的前处理手段以确保光谱的非负性。 如图4(b)所示, MCR-ALS是一种在约束条件下对完整的A和S矩阵同时进行交替最小二乘优化的方法。 该方法通过多组分析计算双线性模型的两个矩阵, 所使用的补充信息量大大减少了最终MCR的模糊性。

自建模混合物分析(self-modeling mixture analysis, SMA)旨在选择单个数据矩阵或多集结构中最不同的行或列, 提供光谱或浓度曲线的初步估计^[21]。 SMA通过最小二乘算法将光谱混合物数据解析(分解)为纯成分光谱$S=X^{T}A(A^{T}A)^{-1}$及其贡献$A^{*}=XS(S^{T}S)^{-1}$,而无需使用有关混合物的先验信息。 Qin等采用SMA对双层样品的SORS进行分析, 成功分离了表层(即塑料片和胡萝卜)和次表层(即蔗糖和三聚氰胺)的拉曼光谱, 验证该方法的可行性^{[13, 22]}。

目标波段熵最小化(band-target entropy minimization, BTEM)在无参考光谱先验信息前提下重建单个层的真实光谱。 该算法首先应用奇异值分解(SVD)处理空间偏移混合光谱为多个基向量, 然后在保留特定谱峰的基础上通过熵最小化方法获取拉曼全谱^[23]。 自适应目标波段熵最小化(ABTEM)通过光谱库拟合的过约束提取算法来执行光谱解混, 解决了传统BTEM在高频信号重叠、 共线性、 强噪声等信号分离问题[图4(c)]。 该算法在迭代搜索真实谱图的过程中动态适应收敛参数^[24], 借助元启发优化策略来增加光谱估计的准确性和稳定性。

2.3.2 独立成分分析

独立成分分析(independent component analysis, ICA)不需要源信号和混合矩阵的先验信息, 而要求源信号具有统计独立性。 由于独立性度量复杂, 通常采用非高斯性替代独立性作为约束条件。 快速独立分量分析(FastICA)是一种基于非线性函数的不动点迭代最大化非高斯算法, 具有收敛速度快、 易于寻找和优化非高斯分布的独立分量等优点^[25]。 快速独立分量分析算法构造了分离矩阵W[图4(d)], 以最大化两个分离谱的非高斯性为目标优化分离矩阵。 分离矩阵的优化过程通过式(2)和式(3)执行。

W←E{XG(WTX)}-E{G'(WTX)}W(2)

W←(WWT)-12W(3)

其中G(x)为负熵近似函数, 即非高斯测度。 计算分离矩阵之前通常采用PCA白化数据矩阵以简化计算过程。 该算法不需要在两层样品被称为两个独立组分的基础上确定初始光谱和混合矩阵的值。 该算法不依赖专家经验, 已被应用在带包装食品散射图像的次表层信号分离中^[26]。

由于只能获得观测矩阵的信息, 而混合矩阵和源光谱是未知的, 次表层信号分离方法都存在排列模糊和强度模糊的不确定性。 这种模糊性意味着双线性模型中两个源信号和混合矩阵的不同组合能以相同的拟合质量再现原始观测矩阵^[27]。