新鲜鸡蛋购于洛阳大张超市; 儿茶素(AR)购自合肥博美生物科技有限公司; LB培养基购自青岛海博生物技术有限公司; 试验所需菌种均为河南科技大学食品学院实验室提供。

TDZ5-BP高速冷冻离心机, 长沙湘锐有限公司; LGJ-10D真空冷冻干燥机, 上海旦鼎国际贸易有限公司; UV-2600紫外-分光光度计, 日本日立公司; Cary eclpise荧光分光光度计, 美国Aglient Cary elipse公司; VERTEX70傅里叶红外光谱仪, 德国Bruker公司。

1.3.1 IgY、 混合物及复合物的制备

IgY的分离与纯化按照张曼等^[12]的方法并加以改进, 将硫酸铵沉淀法制得的IgY溶液在4 ℃条件下透析(截留分子量为8 000~14 000 Da)48 h除盐。 经真空冷冻干燥制得IgY冻干粉。 将IgY与儿茶素按照质量浓度为1∶ 1混合, 一份不做任何处理, 另一份室温下于磁力搅拌器中搅拌6 h, 经真空冷冻干燥制得混合物及复合物微粒。

1.3.2 紫外可见光谱法测定儿茶素与IgY的相互作用

参考文献[13]的方法并加以改进, 将IgY配制成0.5 mg· mL^-1的溶液, 分别移取4 mL于编号1— 5的离心管中, 加入50 μ L不同质量浓度的儿茶素溶液, 使其终浓度分别为0, 6.25, 12.5, 18.75和25 μ g· mL^-1。 充分混匀后静置20 min, 扫描波长: 250~350 nm。

1.3.3 荧光光谱法测定儿茶素与IgY的相互作用

按照1.3.2方法制备3组样品溶液, 分别在291, 298和310 K条件下恒温水浴5 min。 测定条件为: 激发波长(280 nm), 激发和发射狭缝(10 nm), 扫描范围(300~500 nm)。

1.3.4 傅里叶红外光谱法测定儿茶素与IgY的相互作用

将IgY与复合物分别与干燥后的溴化钾粉末按照1∶ 100(m/m)混匀研细后压片, 分辨率为4 cm^-1, 扫描范围: 4 000~400 cm^-1。 用Peak Fit v4. 12软件分析IgY与复合物酰胺Ⅰ 带蛋白质二级结构相对含量变化。

1.3.5 菌悬液制备及抑菌活性的测定

参考文献[14]的方法制备菌悬液并调整菌液浓度至10⁶~10⁸ CFU· mL^-1, 将菌悬液与灭菌后的固体培养基按照1∶ 100的比例混匀后铺于平板。 采用打孔法测定抑菌活性。 每孔加入200 μ L的5 mg· mL^-1的样品, 恒温培养箱中37 ℃培养24 h。

1.3.6 IgY、 混合物、 复合物的抑菌率测定

参照文献[15]方法并加以改进, 取7只试管分别加入4 mL液体培养基灭菌后备用, 向灭菌后的1— 5号试管中加入100 μ L菌液及1 mL一定浓度的样品溶液使其终浓度分别为0.025, 0.05, 0.1, 0.15和0.2 mg· mL^-1, 6号试管加入1 mL灭菌后的蒸馏水及100 μ L菌液作为阳性对照, 7号试管只加培养基作为阴性对照, 置于恒温摇床中37℃培养12 h后600 nm下测定光密度(optical density, OD)值。

抑菌率=阳性对照OD值-试验OD值阳性对照OD值-阴性对照OD值×100%(1)

每组试验均做3次平行, 利用Origin 9.0软件对紫外光谱、 荧光光谱数据进行平滑预处理及作图, 利用DPS 7.05软件进行显著性分析。

小分子物质与蛋白质结合后会引起蛋白质结构发生改变, 紫外-可见光谱可通过峰强度及峰位的变化反映其如何进行相互作用。 峰强度及峰位的变化分别反映两者相互作用的强弱及蛋白质大分子疏水氨基酸残基所处的微环境是否发生了改变^[16]。 蛋白质中的色氨酸及酪氨酸残基在紫外-可见光谱中吸收峰出现在280 nm附近^[13]。 设定IgY浓度为0.5 mg· mL^-1, 向其中加入不同浓度的儿茶素后观察两者结合的紫外吸收光谱, 其光谱变化如图1所示。 儿茶素浓度越大, 紫外吸收峰值越高, 且随其浓度增强依次增大。 最大吸收峰波长从279 nm蓝移至276 nm, 说明IgY的构象发生了改变。 原因可能是儿茶素的加入能够使IgY中肽链发生改变, 使其更加舒展, 有助于蛋白质释放出分子内部的发色基团残基中的芳香杂环, 进而使其紫外吸收强度增加。

图1

Fig.1

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	图1 不同质量浓度的儿茶素与IgY结合的紫外光谱图 IgY质量浓度为0.5 mg· mL-1; 1— 5儿茶素的质量浓度分别为0, 6.25, 12.5, 18.75, 25μ g· mL-1, 图2同Fig.1 Ultraviolet-visible spectrum of different concentrations of catechins binding to IgY The mass concentration of IgY was 0.5 mg· mL-1; The mass concentrations of 1 to 5 catechins were 0, 6.25, 12.5, 18.75, 25 μ g· mL-1, respectively, as shown in Figure 2

2.2.1 儿茶素与IgY结合的荧光光谱分析

蛋白质分子中的生色基团可以在特定波长下产生特征峰, 除去生色基团中自身发射荧光较弱且很容易被猝灭剂猝灭的氨基酸残基, 主要研究色氨酸(348 nm)的荧光光谱变化^[17]。 以280 nm为激发波长, 研究不同质量浓度的儿茶素在18, 25和37 ℃与IgY结合的荧光光谱, 结果如图2(a, b, c)所示。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 不同温度和质量浓度的儿茶素与IgY结合的荧光光谱图 (a): 18 ℃; (b): 25 ℃; (c): 37 ℃Fig.2 Fluorescence spectra of different concentrations of catechins and different temperature binding to IgY (a): 18 ℃; (b): 25 ℃; (c): 37 ℃

儿茶素作为一种小分子物质与IgY结合, 降低了蛋白质分子中发射荧光物质的量子产率, 使得其荧光强度降低, 产生荧光猝灭现象。 图2显示了不同温度处理下不同质量浓度的儿茶素与IgY结合的荧光光谱图。 由图2可知, 在同一温度下, 随着儿茶素浓度的增加, IgY的荧光猝灭效果均呈现增强趋势, 并发生红移现象。 进一步表明两者之间产生了相互作用, 且在这种相互作用的促进下形成了荧光强度较低的复合物。 原因可能是儿茶素的加入导致IgY中色氨酸周围微环境发生变化, 促进两者之间疏水相互作用及氢键的形成。 文鹏程等^[18]研究了茶多酚对牛奶蛋白结构的影响, 结果与本文相似。 热处理对IgY的荧光强度也有影响, 在291~310 K温度范围内, 随着温度的升高, IgY荧光强度呈现逐渐降低的趋势, 儿茶素存在时荧光猝灭效果也有类似的变化。

2.2.2 荧光猝灭机理的判定

猝灭剂对蛋白质分子的荧光猝灭类型分为两种。 一种是由于离子扩散导致猝灭常数随温度的升高而增大的动态猝灭; 另一种为形成了复合物而导致猝灭常数变化趋势与其相反的静态猝灭。 在多酚与蛋白质相互作用的研究中, 常用Stern-Volmer方程判断其猝灭类型。

F0F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q](2)

式(2)中: F₀和F分别为未添加儿茶素和儿茶素浓度为Q时IgY的荧光强度, [Q]为儿茶素的浓度(mol· L^-1), 式(3)同; K_q为猝灭速率常数, K_sv为动态猝灭常数; τ ₀为猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命, 约为10^-8 s。

以F₀/F为因变量, 对[Q]进行线性拟合, 结果如图3所示, 进而通过式(2)得出K_q及K_sv, 结果如表1所示。 由图3及表1可知, 儿茶素与IgY的Stern-Volmer曲线具有良好的线性关系。 K_sv随着温度的升高呈现降低趋势, 这表明儿茶素与IgY相互作用的猝灭机制可能是静态猝灭。 经研究表明, 各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0× 10¹⁰ mol· (L· s)^-1。 由表1可知, 291, 298和310 K条件下K_q均远远大于2.0× 10¹⁰ mol· (L· s)^-1, 进一步表明两者相互作用的猝灭机制主要为儿茶素与IgY结合形成了基态稳定复合物而导致的静态猝灭。 王晨等^[19]在花青素与小麦蛋白相互作用研究中发现花青素与麦谷蛋白相互作用的荧光猝灭方式为静态猝灭。 与本研究结果相似。

图3

Fig.3

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	图3 不同温度条件下儿茶素猝灭IgY的Stern-Volmer图Fig.3 Stern-Volmer plots of IgY quenched by catechinat different temperatures

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 儿茶素-IgY复合物的荧光猝灭常数及线性相关系数 Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of catechin and IgY 温度/ K Ksv/ (L· mol-1) Kq/ [L· (mol· s)-1] R2 291 1.053× 104 1.053× 1012 0.989 9 298 0.934× 104 0.934× 1012 0.982 0 310 0.818× 104 0.818× 1012 0.992 6

表1 儿茶素-IgY复合物的荧光猝灭常数及线性相关系数 Table 1 Quenching rate constants and correlation coefficients of catechin and IgY

2.2.3 结合常数和结合位点的计算

对于猝灭类型为静态猝灭的小分子与蛋白质的相互作用, 可采用式(3)计算其结合常数K_A及结合位点n。

lgF0-FF=lgKA+nlg[Q](3)

根据式(3)将数据经拟合后绘制双对数图, 并计算出K_A和n, 结果如图4和表2所示。 由表2可知, 3个温度下, 儿茶素与IgY均存在着强烈的相互作用。 均形成了结合位点数接近于1的静态复合物, 即二者结合比例接近1∶ 1。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 不同温度条件下IgY-儿茶素复合物的双对数图Fig.4 Logarithmic diagram of IgY-catechin complexes at different temperatures

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 儿茶素-IgY复合物的表观结合常数、 结合位点数及线性相关系数 Table 2 Apparent binding constant, number of binding sites and linear correlation coefficient of catechin-IgY complex 温度/K KA/(L· mol-1) n R2 291 2.455× 104 1.089 0.979 298 1.694× 104 1.067 0.961 310 1.183× 104 1.042 0.984

表2 儿茶素-IgY复合物的表观结合常数、 结合位点数及线性相关系数 Table 2 Apparent binding constant, number of binding sites and linear correlation coefficient of catechin-IgY complex

2.2.4 热力学参数及相互作用力类型判定

热力学参数焓变Δ H、 吉布斯自由能变化Δ G、 熵变Δ S根据刘建垒^[20]等的方法进行计算并进行作用力类型判断, 结果如表3所示。 由表3可知, 儿茶素与IgY互作结合可自发进行, 且该过程为放热反应, 这与2.2.3中K_A随温度变化的趋势结果一致。 由Δ H及Δ S均小于0可以得出, 范德华力及氢键作用力是儿茶素与IgY互作结合形成复合物的主要作用力类型。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 儿茶素-IgY复合物的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of catechin-IgY complex 温度/ K Δ H/ (kJ· mol-1) Δ G/ (kJ· mol-1) Δ S/ (J· K-1) 291 -24.456 -47.282 298 -38.215 -24.125 -47.282 310 -24.171 -45.303

表3 儿茶素-IgY复合物的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of catechin-IgY complex

通过傅里叶变换红外光谱进一步研究IgY与复合物蛋白质构象的变化, 结果如图5所示。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 IgY和IgY-儿茶素复合物的傅里叶变换红外光谱图Fig.5 Fourier transform infrared spectra of IgY and IgY-catechins complex

由图5可知, 相较于IgY, 复合物酰胺Ⅰ 带的峰位从1 646.90 cm^-1蓝移至1 631.14 cm^-1。 酰胺Ⅱ 带从1 529.49 cm^-1蓝移至1 520.94 cm^-1, 说明儿茶素的引入使IgY的二级结构发生了变化。 刘勤勤等^[21]研究发现茶多酚与大豆分离蛋白相互作用也引起其酰胺Ⅰ 带和酰胺Ⅱ 带发生蓝移, 与本研究结果一致。 3 500~3 200 cm^-1范围内的吸收峰为O— H的特征峰, 由图5可以看出, 复合物此范围内的峰形较IgY变宽, 说明复合物形成了新的氢键, 相比于IgY, 其缔合程度增大。 对酰胺I带进行去卷积处理, 通过Gaussian拟合计算峰面积进而得出各类二级结构的相对百分含量, 结果如表4所示。 由表4可知, 相较于IgY, 复合物β -折叠、 β -转角含量变化不明显, α -螺旋含量升高, 无规卷曲含量降低。 α -螺旋是蛋白质二级结构中的主要有序结构, 与β -折叠相同, 二者皆通过分子内氢键维持。 α -螺旋含量的升高表明儿茶素的引入促进蛋白质分子内新的氢键的形成, 推测新的氢键可能为儿茶素的酚羟基与IgY中的羰基结合导致氢键的重排所致。 与上述结果一致。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 IgY与IgY-儿茶素复合物酰胺Ⅰ 带蛋白质二级结构相对含量 Table 4 The relative content of secondary structure of protein in amide Ⅰ band of IgY and IgY-catechin complex 样品 β -折叠 /% 无规卷曲 /% α -螺旋 /% β -转角 /% IgY 42.81 23.12 19.68 14.39 复合物 42.53 17.84 25.16 14.47

表4 IgY与IgY-儿茶素复合物酰胺Ⅰ 带蛋白质二级结构相对含量 Table 4 The relative content of secondary structure of protein in amide Ⅰ band of IgY and IgY-catechin complex

有研究表明, 鸡卵黄免疫球蛋白IgY能够使细胞聚集, 通过降低细菌细胞膜表面疏水性及粘附性进而抑制多种病原微生物的生长和繁殖^[22]。 其抑菌活性具有重要的生理意义, 尤其当这种抑制作用发生在肠道消化过程时, IgY有利于抑制有害菌的生长并将其排除体外, 这也使得其有望成为抗生素的理想替代品之一。 本研究将儿茶素与IgY进行相互作用制备其复合物并以IgY与儿茶素的混合物为对照组, 对其抑菌性能进行了研究。 结果如图6及表5所示。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 IgY、 混合物与IgY-儿茶素复合物的抑菌效果图Fig.6 Antibacterial effect of IgY, mixture and IgY-catechin complex

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 IgY、 混合物与IgY-儿茶素复合物的抑菌率 Table 5 Bacteriostatic rate of IgY, mixture and IgY-catechin complex 菌种 样品 抑菌率/% 0.025 mg· mL-1 0.05 mg· mL-1 0.1 mg· mL-1 0.15 mg· mL-1 0.2 mg· mL-1 IgY 22.08± 0.86 b 23.98± 0.44 b 29.88± 0.21 b 30.75± 0.11 b 32.11± 1.15 b 大肠杆菌 混合物 27.60± 0.68 a 29.07± 1.03 a 29.48± 0.73 b 31.17± 0.17 b 34.26± 0.40 b 复合物 22.33± 0.86 b 24.38± 0.82 b 34.14± 0.21 a 35.41± 0.62 a 37.83± 0.76 a IgY 24.97± 1.27 c 24.85± 0.91 c 26.99± 1.13 c 41.85± 1.86 c 54.49± 1.53 c 金黄色葡萄球菌 混合物 61.58± 1.20 b 67.19± 0.29 b 68.01± 0.13 b 70.46± 1.16 b 74.12± 0.25 b 复合物 68.29± 0.30 a 72.16± 0.83 a 75.06± 0.49 a 79.15± 0.29 a 80.79± 1.12 a 注: 同列字母a, b, c表示在p< 0.05水平上差异显著 Note: Significant differences (a, b, c) at p< 0.05 is indicated by different letters in the same group

表5 IgY、 混合物与IgY-儿茶素复合物的抑菌率 Table 5 Bacteriostatic rate of IgY, mixture and IgY-catechin complex

由表5结果可知, IgY、 混合物及复合物浓度与其对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌率呈现正相关, 当浓度小于0.05 mg· mL^-1时, 对大肠杆菌的抑制率从大到小表现为混合物> 复合物> IgY; 而当浓度大于0.05 mg· mL^-1时, 复合物表现出最好的抑制作用, 对大肠杆菌的抑菌率较IgY和混合物分别平均提高了15.74%和13.27%。 对于金黄色葡萄球菌, 抑菌率表现为复合物> 混合物> IgY, 复合物较IgY和混合物抑菌率分别平均提高了135.8%和9.95%。 图6为三种样品浓度为5 mg· mL^-1时的抑菌圈结果, 在培养24 h的情况下, IgY抑菌圈较小, 原因可能是培养时间较长, 菌浓度较大, IgY部分成为了氮源导致的。 结合图6可以看出, 复合物的抑菌效果最好。 以混合物为对照进一步证实了复合物的形成, 且表明抑菌效果的提升来源于复合物。