Antaris Ⅱ 傅里叶变换近红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific, USA), 附件配置: 漫反射积分球模块, 10 mm样品杯, RESULT-Integration近红外光谱采集软件; 分析天平BSA224S-CW(赛多利斯科学仪器有限公司); 电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240A(上海精宏实验设备有限公司)。

不同RA含量的甜菊糖样品由山东圣旺药业股份有限公司提供, 按照《中华人民共和国国家标准(GB 8270— 2014)》中甜菊糖苷检测方法测量得到RA的含量(质量分数, 以干基计), 样品为白色结晶性粉末, 规定含水量不得超过5.0%。

吸湿过程表征: 精密称定干燥至恒重的样品1 g(M₀)放入扁形称量瓶中, 称定称量瓶与样品的质量(M₁), 称量瓶盖打开并放置于恒温恒湿环境中模拟实际贮存环境进行吸湿, 此过程共持续4 h。 样品每隔10 min精密称定称量瓶与样品的质量(M_i), 根据不同时间点下的质量变化, 计算该时间点的吸湿率, 并以吸湿时间为横坐标, 吸湿百分率为纵坐标, 绘制吸湿动力学曲线^{[4, 5]}。 实验在3 d内重复3次, 取三次实验的平均值作为原始数据。 吸湿率计算如式(1)所示

吸湿百分率=(Mi-M1)M0×100%(1)

式(1)中, M₀为精密称定的初始干燥失重样品质量; M₁为称量瓶与初始样品的总质量; M_i为不同时间点称量瓶与样品的总质量, i=0, 10, 20, …, 240 min, i的间隔为10 min, 共持续4 h。

含量快速测定样品: 为了获得相似的预测精度, 高中低含量样品的均匀分布必不可少, 准备RA含量在90.26%~98.29%范围内的55份样品, 密封储存, 备用。

吸湿样品每隔10 min装于样品杯中(与重量法时间点相对应), 利用近红外光谱仪积分球模块采集样品近红外漫反射光谱, 每个样品重复采集3次, 取平均光谱作为样品原始光谱, 以空气为参比, 每小时采集一次背景光谱, 光谱采集参数设置: 扫描范围为10 000~4 000 cm^-1(在本研究中转化为波长), 分辨率8 cm^-1, 扫描次数32次, 增益2x。 用于含量测定的55份样品按照上述同样的仪器参数采集光谱。

对于甜菊糖吸湿过程, 本研究从吸湿开始到结束共得到25幅光谱, 分别利用二阶导数、 PCA和二维相关光谱分析(two-dimensional correlation spectroscopy, 2D-COS)进行吸湿过程水分的定性分析, 从而揭示水的吸附方式以及键合作用。

对于甜菊糖RA含量的快速测定, 本研究共得到55幅光谱, 利用偏最小二乘回归(portial least squares regiesscion, PLSR)算法, 将样品的近红外光谱数据与其对应的RA含量数据相关联, 建立RA的定量分析模型。 具体操作: (1)利用SPXY(sample set partitioning based on joint x-y distance)分类方法按照4∶ 1的比例将50幅光谱分为校正集、 验证集, 另有5份样品作为外部测试集; (2)使用EPO算法对光谱进行预处理, 通过第一部分吸湿过程的光谱构建干扰变量, 以消除吸湿水分的影响; (3)采用模型评价参数校正均方根误差(RMSEC)、 验证均方根误差(RMSEP)、 校正集决定系数 Rcal2、 验证集决定系数 Rval2对模型的预测能力进行评价, 通常RMSE值越小, R²越大, 说明模型越稳定, 模型预测的准确性和可靠性越好; (4)为进一步评价模型的预测能力, 采用预测相对标准偏差(residual prediction deviation, RPD), 通常RPD> 3表示模型预测准确性较高。

数据采用Matlab2016b(MathworksInc., 美国), SPSS Statistics 20.0(IBM, 美国)以及2D Shige软件(森田学理大学, 日本)进行处理。

1.4.1 EPO算法流程

EPO针对外部干扰变量如湿度、 温度等单独构建影响模型, 只对代表性样品进行测试, 从而大大降低模型建立的复杂度。 在本研究中, 主要运用此算法消除甜菊糖吸湿对光谱造成的影响^[6]。 在矩阵形式下, 原始光谱矩阵X(m× n)可以表示为式(2)

X=XC+XQ+R(2)

式(2)中, C为光谱有用部分的投影矩阵(n× n): 有用光谱矩阵X'=XC; Q为光谱中受水分影响的无用部分的投影矩阵(n× n): 无用光谱矩阵X″=XQ; R为残差矩阵(m× n)。

EPO的目的是获得有用的光谱X'=XC, 矩阵C的求取是关键, 具体方法为^[7]:

(1)计算外部参数的差异光谱矩阵D, D=X_i-X₀, 本研究利用第一部分吸湿全过程的光谱变化构建差异光谱矩阵, 克服了过去单一线性变化的局限;

(2)对D进行PCA分析, D=TP^T, P为载荷矩阵;

(3)定义因子个数c, 得到P_c子载荷矩阵, 原则上c为P的前几列, 占据总体的99%以上;

(4)通过PP^T计算Q无用信息投影矩阵;

(5)计算有用信息投影矩阵C=I-Q, I为单位矩阵;

(6)对原始光谱数据进行变换X'=XC。

2.1.1 吸湿曲线

甜菊糖的吸湿曲线如图1所示, 含水量随着时间延长逐渐增加并最终因饱和吸附而保持不变。 吸湿曲线在刚开始上升较陡, 吸湿速率较快; 之后曲线上升逐渐平缓, 吸湿速率较慢; 最后逐渐达到平衡状态。

图1

Fig.1

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	图1 甜菊糖的吸湿曲线Fig.1 Moisture absorption curve of stevia

2.1.2 吸湿模型

为了使吸湿数据更为直观准确, 利用SPSS 20.0软件对吸湿数据做二项式回归曲线拟合, 确定吸湿动力学模型^[8]。 得到的吸湿方程为F=at²+bt+c(a< 0), 决定系数R²越接近1, 说明模型拟合越好, 吸湿曲线适应性强^[9]。 对其进行两次一阶求导, 得到吸湿速度方程v=dF/dt=2at+b、 吸湿加速度方程v'=dv/vt=2a。

吸湿刚开始时t=0, v₀=b, 吸湿平衡时间t'=-b/2a, 由表1甜菊糖吸湿动力学模型可知, 甜菊糖吸湿作用在191 min达到平衡, 平衡含水量为7.538%。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 甜菊糖的吸湿动力学模型 Table 1 Moisture absorption kinetic model of stevia 样品 吸湿方程 R2 吸湿速度方程 吸湿初始速度 /(%· min-1) 吸湿加速度 /(%· min-1) 吸湿平衡 时间/min 平衡含水 率/% 甜菊糖 y=-0.000 2t2+0.076 4t+0.242 2 0.990 2 v=-0.000 4t+0.076 4 0.076 4 -0.000 4 191 7.538

表1 甜菊糖的吸湿动力学模型 Table 1 Moisture absorption kinetic model of stevia

2.2.1 吸湿过程光谱

在近红外区域, OH具有两个特征吸收带, 其峰值分别位于1 420 nm(第一倍频)和1 920 nm(组合频)左右, 这些吸收带较强, 尤其是OH的组合频区域, 其确切位置和宽度会随化学和物理环境而略有变化。 图2(a)为甜菊糖样品在吸湿过程中的原始光谱, 可以看出在不同的水分水平下, 样品的光谱特征有显著的差异。 图2(b)为原始光谱经多元散射校正(multiple scattering correction, MSC)处理后的光谱, 该方法可有效消除基线漂移, 消除因颗粒大小不同而对光谱引起的影响, 随后的数据均以此为基础进行分析。 图2(c)为OH的组合频区域局部放大图, 其峰值随着吸湿时间延长不断增加, 表明吸湿过程水分在不断增多。 图2(d)为其对应的二阶导数光谱, 1 911 nm主要与表面水有关, 而1 944 nm与结合水有关^[10], 表面水为直接吸附在物质上的水分子, 结合水为吸附在表面水之上的水分子。 吸湿前1 h, 1 911 nm处的表面水峰值(绝对值)迅速升高, 而在之后变化趋势不明显, 这可能意味着吸湿刚开始水分子迅速吸附在甜菊糖粉末表面; 之后, 表面吸附位点减少, 吸湿速率明显变慢; 已被吸附的水分子也具有吸附能力, 额外的水分子将同时在表面附加吸附, 形成不易消散的结合水, 结合吸湿曲线可知此过程持续2 h, 190 min以后甜菊糖总体吸附达到饱和, 吸湿量不再增加^[12]。

图2

Fig.2

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	图2 甜菊糖吸湿过程的光谱变化 (a): 原始光谱; (b): 多元散射校正的光谱; (c): OH的组合频区域局部放大图; (d): OH的组合频区域二阶导数光谱Fig.2 Spectral changes of stevia during moisture absorption (a): Raw spectra; (b): Multivariate scatter correction spectra; (c): A magnified plot at 1 850~2 050 nm; (d): Second derivative spectra of 1 850~2 050 nm

2.2.2 含量测定光谱

55份不同RA含量的甜菊糖光谱如图3所示, (a)为原始近红外光谱图, (b)为经过MSC处理之后的光谱图。

图3

Fig.3

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	图3 55份不同RA含量的甜菊糖样品光谱图 (a): 原始光谱; (b): MSC处理之后的光谱Fig.3 Spectra of 55 stevia samples with different RA content (a): Raw spectra; (b): Spectra after MSC processing

为了明确甜菊糖吸湿过程中水分子的变化情况, 对OH的组合频区域进行了PCA, 图4分别显示了吸湿过程光谱的前两个主成分的得分和载荷。

图4

Fig.4

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图4 OH的组合频区域吸湿过程前两个主成分的得分与载荷 (a): 第一主成分得分; (b): 第一主成分载荷; (c): 第二主成分得分; (d): 第二主成分载荷Fig.4 Scores and loadings of the first two principal components in the combination bands of OH in the moisture absorption process (a): Scores of the first principal component; (b): Loadings of the first principal component; (c): Scores of the second principal component; (d): Loadings of the second principal component

第一个主成分得分变化趋势如图4(a)所示为逐渐增加而后趋于平稳, 与吸湿曲线相吻合, 其载荷特征在图4(b)为以1 921 nm为中心的宽峰。 第一主成分贡献率为99.28%, 可以认为第一主成分解释为吸湿过程的含水量变化。

第二主成分得分如图4(c)所示, 有先降低再升高, 然后趋于稳定的趋势, 其载荷图4(d)在1 905 nm处以负峰为主, 在1 944 nm处以正峰为主, 其特征分别是氢键较弱的表面水和氢键较强的结合水。 第二个主成分贡献率为0.66%, 整个吸湿过程可分为三个区域, 前1 h和中间2 h以及最后1 h, 可以认为吸湿刚开始表面水较多, 随着吸湿进行, 结合水增多, 最后整体吸附达到饱和而趋于稳定。

为了进一步探究甜菊糖吸湿过程中水的细微变化, 在PCA得到的吸湿过程三阶段的基础上进行二维相关光谱(2D-COS)分析。

图5分别为吸湿1 h、 中间2 h以及最后1 h的同步谱与异步谱, 红色实线表示正号, 蓝色虚线表示负号。 在图5(a1)中, 同步光谱在1 911 nm左右出现自相关峰, 代表水的弱氢键; 在图5(b2)中, 自相关峰在1 936 nm 出现, 自相关峰红移表明形成了更多的氢键, 这代表更多的结合水发挥作用; 在图5(c1)中, 自相关峰位置不变, 提示吸附饱和。 与此同时在1 885和1 936 nm处出现了负交叉峰, 表明1 885 nm的自由水与1 936 nm的结合水变化趋势相反, 自由水随着吸湿不断减少, 而结合水增多。

图5

Fig.5

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	图5 甜菊糖吸湿的二维相关同步光谱(1)与异步光谱(2) (a1, a2): 吸湿前1 h; (b1, b2): 中间2 h; (c1, c2): 最后1 hFig.5 Synchronous (1) and asynchronous (2) 2D correlation spectra of the stevia moisture absorption process The first hour (a1, a2) the middle two hours (b1, b2) and the last hour (c1, c2)

根据Noda^[12]规则, 图5(a2)吸湿开始1 h和(b2)吸湿开始2 h中异步光谱显示的光谱变化序列如下: 吸湿1 h时1 911 nm> 1 890 nm, 相比于自由水, 水更容易与甜菊糖结合形成表面水; 吸湿中间2 h, 1 944 nm< 1 905 nm, 尽管此过程已有大量的结合水, 但水依然更容易与甜菊糖形成表面水, 表面水氢键作用力强于结合水。 随着吸湿进行, 甜菊糖表面吸附位点变少, 吸附速率明显变慢。 最后1 h的异步光谱图5(c2)吸湿最后1 h异步光谱显示噪声谱附近的零相关强度, 此过程甜菊糖整体吸附饱和。

EPO通过消减水分影响的光谱信息, 剔除吸湿对其近红外光谱的影响, 图6(b)为吸湿过程差异光谱图, 从图中可以看出, OH的组合频区域变化最为明显, 符合实际吸湿情况。 接着对其进行PCA投影无关的正交空间, 本模型中需要优化的参数是EPO因子个数c和PLSR的潜在变量数LVs, 通过样品集的交叉验证均方根误差(RMSECV)值进行优化以提高EPO-PLSR模型的预测精度, 不同c和LVs的组合所产生的交叉验证误差如图6(c)所示, 结果表明, 在1个因子作用下时RMSECV值最小, 所以最终选择c=1。 最后通过扣除无用矩阵, 得到的有用光谱如图6(d)所示, 与没有进行水分校正的光谱图6(a)相比, 水分引起的光谱变化减小, 光谱的重复性更好。

图6

Fig.6

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图6 外部参数正交化(EPO)算法的运行过程示意图 (a): EPO转换前的光谱; (b): 甜菊糖吸湿过程的差异光谱图; (c): 不同的c和LVs的组合所产生的交叉验证误差图; (d): EPO转换后的光谱Fig.6 Schematic diagram of the calculation process of the EPO algorithm (a): The spectra before EPO correction; (b): The difference spectra of the stevia moisture absorption process; (c): The cross-validation error graph generated by different combinations of c and LVs; (d): The spectra after EPO correction

2.5.1 模型建立

在RA的NIRS定量模型的建模过程中, RMSECV随着LVs的变化如图7(a)所示。 通过模型优化, 最终以EPO+MSC组合方法对样品的原始近红外光谱进行预处理, 选定最佳主成分数为5, 建立甜菊糖RA含量的NIRS定量分析模型, 模型结果图7(b)所示, 校正集和验证集的参考值与预测值在1∶ 1直线两侧对称且紧密分布, 且RMSEC, RMSEP, Rcal2, Rval2分别为0.278 9, 0.291 0, 0.988 7和0.989 5, 模型性能较好。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 (a)RMSECV随着LVs的变化情况; (b)甜菊糖RA的NIRS定量分析模型建模结果Fig.7 (a) LV-RMSECV curve; (b) NIRS quantitative analysis model of RA content in stevia

2.5.2 模型验证

选取不用于建模的外部测试集样品, 以建立的定量分析模型预测RA含量, 由表2可知, 与未使用水分校正方法相比, 使用EPO算法的RA定量分析模型预测值和参考值更为接近且两组数值之间无显著性差异, 预测误差明显更小, RPD值大于3, 以上结果说明EPO对水分有较好的校正效果, 可以用来消除吸湿对近红外光谱预测带来的影响, 提高模型预测的准确度。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 RA的NIRS定量分析模型外部测试集结果 Table 2 External test sets results of RA's NIRS quantitative analysis model 样本信息 None-EPO+MSC EPO+MSC 预测值/% 误差/% 预测值/% 误差/% 1#(90.27%) 98.46 8.19 91.49 1.22 2#(92.90%) 98.80 5.90 92.44 0.46 3#(95.32%) 101.02 5.70 95.61 0.29 4#(97.16%) 101.27 4.11 97.07 0.09 5#(98.23%) 103.18 4.95 98.19 0.04 平均误差/% 5.770 6 0.420 1 RMSEP/% 6.629 1 0.669 5 RP2 0.896 9 0.957 0 RPD 0.293 1 4.336 8

表2 RA的NIRS定量分析模型外部测试集结果 Table 2 External test sets results of RA's NIRS quantitative analysis model