本研究通过东部战区总医院伦理委员会批准[批件号: 2021DZGZR-YBB-066]。 本研究内容及方法均符合《赫尔辛基宣言》的原则。 回顾性分析2023年1月至2024年1月于东部战区总医院行手术切除的胶质瘤患者, 将经病理证实为胶质瘤者纳入研究。 共纳入53例, 其中男32例, 女21例, 年龄(44.72± 14.49)岁。 新鲜脑组织样本随脑胶质瘤手术取材离体后立即存入液氮, 并于离体后48 h内制作冰冻切片(德国, Leica CM 1950)。 从每个样品中, 切割一个厚度为8 μ m的切片并安装在不锈钢载玻片上进行拉曼光谱检测, 切割一个3 μ m切片并安装在标准载玻片上进行H& E染色, 两个切片是相邻的。

采用In Via显微聚焦拉曼光谱仪(英国, Renishaw公司)进行冰冻切片样本拉曼光谱信号检测。 在本次数据采集工作中, 采用波长785 nm激光光源进行样本扫描, 将激光功率设置为90 mW, 积分时间设置为10 s, L× 50物镜, 光斑直径约1.2 μ m。 使用硅片(520 cm^-1)进行光谱校准, 每个光谱信号累积3次。 对每个组织样品选择三个不同的位置进行测量, 扫描范围是400~1 800 cm^-1。 由于胶质瘤组织的异质性和复杂性, 从每个组织样品表面随机选择的点收集50个光谱。 因此, 总共收集了2 650个单独的光谱, 其中高级别1 650个, 低级别1 000个。 所有光谱均从肿瘤样本中确认的癌变的最典型处获得, 这些区域由常驻病理学家在拉曼测量之前定位。

采集后的光谱数据使用WIRE(version 4.3 64-bit)软件去除宇宙尖峰, 采用Savitzky-Golay(SG)算法去除由机械振动和背景噪声产生的干扰信号, 平滑光谱曲线以提高信噪比。 经过前期预实验结果, 我们对SG算法的窗口长度和多项式阶数进行了调试。 最终选择了最佳参数组合可以在平滑噪声的同时, 能够较好地保留与胶质瘤分级相关的重要光谱特征。 然后使用最大最小归一化(max-min normalization)来减少信号强度对分析结果的干扰, 将所有光谱强度范围所见到[0, 1]之间。 由于不同样本间的光谱测量存在一定的波动, 通过SG平滑处理可以在一定程度上消除这种随机波动, 使得各样本之间的数据更具一致性和可比性。 这不仅有助于减少因测量波动带来的分类误差, 也提升了模型的鲁棒性和泛化能力。 本研究采用 Savitzky-Golay(SG)算法进行平滑、 基线校正和最大最小归一化(max-min normalization) 作为光谱数据的主要预处理方法。 对于SG平滑算法, 该方法因其能够有效去除随机噪声, 同时保留关键光谱特征, 在拉曼光谱分析中被广泛应用。 在实验初期为证实该方法的可行性, 我们对SG算法中多项式拟合阶数(degree)和滑动窗口大小(size)两个参数进行了优化。 根据信噪比(SNR)和均方根误差(RMSE)判断预处理后数据的质量。 特征峰的查找采用LabSpec6(HORIBA Scientific, Kyoto, Japan) 进行自动检测与拟合, 拟合过程使用Gauss-Loren函数, 参数设定为Level=15%, Size=20。 所有预处理流程均使用Python(version 3.7.1)完成。

基于预处理后的拉曼光谱, 本研究使用了四种经典机器学习算法支持向量机(support vector machine, SVM)、 随机森林(random forest, RF)、 决策树(decision tree, DT), 和深度学习算法卷积神经网络(convolutional neural network, CNN)。 鉴于胶质瘤拉曼光谱数据的复杂性, 目前尚不清楚哪种建模技术能实现对本研究疾病类别的区分, 因此, 本研究旨在通过对比人工智能算法, 构建最优智能诊断模型。 模型性能的好坏取决于模型参数的选择, 因此, 我们使用网格搜索算法, 为每个机器学习模型预先设置尽可能全面的超参数范围, 通过Gridsearch CV函数计算每一种参数组合的准确率; 对CNN模型使用hyperopt进行参数优化。 最终选出最佳参数组合用于模型的训练和验证。 在算法获取拉曼矩阵之前, 我们将输入矩阵按6∶ 2∶ 2的比例划分为训练集、 验证集和测试集。 其中训练集和验证集用于模型构建过程中的校正。 测试集不参与模型的训练, 仅用于测试模型在未知数据中的表现。

本研究所使用的CNN模型的结构如图1所示。 该模型主要由输入层、 卷积层、 池化层和全连接层组成。 输入层用于读取输入矩阵, 分析特征维度, 所使用的信号维度input_shape=(1 376, 1)。 卷积层(Conv1D)用于提取输入层提供的数据特征, 通过滑动滤波器(Filter=8, 16, 32, 64)对输入进行扫描, 捕获数据中的局部模式和结构, 本研究共使用6个卷积层。 为提高模型的表达能力, 在每一个卷积层中我们嵌入一个ReLU激活函数, 用于引入非线性变化, 使得模型能够更好地适应不同类型的数据分布和模式。 在每两层卷积层后, 我们引入一层最大池化层(pool_size=2), 减少冗余信息的传递, 提高模型的泛化能力。 在最后一层池化层, 所有数据特征使用扁平层函数进行“ 拉伸” , 将数据平铺输入全连接层, 本研究仅使用一层全连接层, 在该层中使用sigmoid函数对数据特征进行判别和分类, 给出最终鉴定结果。

图1

Fig.1

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	图1 基于Lenet-5的深度学习模型的架构Fig.1 The architecture of a deep learning model based on LeNet-5

采用IBM SPSS 25.0软件进行数据分析, 2组间比较采用独立样本t检验; 定性资料的比较采用χ ²检验。 为了评估四种算法的分类和预测能力, 我们使用了四种评价指标, 即准确率、 精确度、 召回率和5折交叉验证(5Fold), 以及两种可视化方式ROC和混淆矩阵来综合评估模型性能。

53例胶质瘤患者中, 高级别胶质瘤(Ⅲ — Ⅳ 级33例), 低级别胶质瘤(WHO Ⅰ — Ⅱ 级20例)。 高级别胶质瘤患者中男19例、 女14例, 年龄(44.30± 14.41)岁; 低级别胶质瘤患者中男13例、 女7例, 年龄(45.40± 14.96)岁, 2组患者年龄(t=-0.265, p=0.792)、 性别(χ ²=0.287, p=0.592)差异无统计学意义。

表1提供了每个参数组合下所获取的光谱数据质量, 可以看到当size=7, degree=3时, 光谱质量最佳, SNR=31.932 009 5, RMSE=30.105 000 86。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 SG参数优化 Table 1 SG parameter optimization Window size Poly degree SNR RMSE 5 2 30.443 311 25 35.733 335 48 5 3 30.443 618 24 35.732 072 57 7 2 31.929 906 00 30.112 292 40 7 3 31.932 009 50 30.105 000 86 7 4 30.676 217 94 34.787 900 73 7 5 30.676 561 61 34.786 524 31 9 2 30.295 370 61 36.347 168 86 9 3 30.301 812 92 36.320 220 22 9 4 32.431 574 07 28.422 378 32 9 5 32.431 932 04 28.421 206 97 11 2 31.045 234 43 33.340 906 05 11 3 31.052 790 66 33.311 913 97 11 4 30.537 923 68 35.346 216 66 11 5 30.540 798 38 35.334 520 33 13 2 30.240 923 79 36.575 723 84 13 3 30.244 645 47 36.560 055 45 13 4 31.366 208 57 32.131 329 13 13 5 31.361 788 08 32.147 685 82 15 2 30.662 570 51 34.842 603 09 15 3 30.667 558 22 34.822 601 11 15 4 30.445 534 76 35.724 189 21 15 5 30.450 280 08 35.704 677 54

表1 SG参数优化 Table 1 SG parameter optimization

归一化操作能够确保所有拉曼信号在同一量纲下进行分析, 有效提高模型的拟合速度。 最大最小归一化能够不改变数据的相对分布, 保持数据的原始形状和特征。 在这里提供了最优模型CNN在归一化前后性能的变化, 可以发现归一化后的模型准确率得到有效提升(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 CNN归一化前后性能 Table 2 CNN performance before and after normalization 准确率 精确度 召回率 5-Fold CNN-raw 88.08% 91.56% 88.34% 72.00% CNN-norm 98.15% 98.40% 96.76% 97.17%

表2 CNN归一化前后性能 Table 2 CNN performance before and after normalization

图2(a)显示了从低级别胶质瘤(n=1 000, 黄线)和高级别胶质瘤(n=1 650, 蓝线)获得的平均标准化拉曼光谱图。 尽管两种类型的组织具有几乎相似的模式, 但拉曼位移的强度存在差异。 高级别胶质瘤组和低级别胶质瘤组拉曼信号强度的主要差异在于大多数氨基酸、 脂质和核酸相关峰(758、 828、 1 172、 1 265、 1 309、 1 556和1 606 cm^-1)在高级别胶质瘤组中明显更高。 相比之下, 而少数氨基酸相关峰如1 002和1 659 cm^-1, 在低级别胶质瘤组中更高[图2(b)]。 根据现有文献, 本研究胶质瘤组织拉曼峰的位置和主要归属列在表3 中。

图2

Fig.2

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	图2 (a)高级别和低级别胶质瘤组织样本的平均拉曼光谱, 阴影区域表示均值的标准差; (b)高级别胶质瘤拉曼光谱减去低级别胶质瘤组织样本的拉曼光谱; N代表个数Fig.2 (a) Average Raman spectra of high-grade and low-grade glioma tissue samples, shaded areas indicate the standard deviation of the mean; (b) Raman spectra of high-grade glioma minus Raman spectra of low-grade glioma tissue samples; N represents the number of samples

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 脑胶质瘤组织切片拉曼峰归属表 Table 3 The Raman peak positions and major assignments in glioma tissue sections Raman shift/cm-1 Major assignment 622 Phenylalanine 643 Proline 667 Cystine 758 Tryptophan 828 Glutathione 852 Glycogen 928 Cystine, Collagen 958 Proline 1 002 Phenylalanine 1 031 Phenylalanine 1 124 Protein 1 172 Saturated fatty acid 1 265 Unsaturated fatty acid 1 309 Triglyceride 1 556 Tryptophan 1 606 Tyrosine 1 659 Lipid, Protein

表3 脑胶质瘤组织切片拉曼峰归属表 Table 3 The Raman peak positions and major assignments in glioma tissue sections

各种光谱分类器(CNN、 SVM、 RF、 DT)的分类结果如表4所示。 从表4中可以看出, CNN对高低级别胶质瘤组织样本光谱数据所建模型分类正确率为(98.15%)、 精确度(98.40%)和召回率(96.76%), SVM对高低级别胶质瘤组织样本光谱数据所建模型分类正确率为(90.34%)、 精确度(94.20%)和召回率(82.63%), RF对高低级别胶质瘤组织样本光谱数据所建模型分类正确率为(88.64%)、 精确度(83.10%)和召回率(86.29%), DT对高低级别胶质瘤组织样本光谱数据所建模型分类正确率为(80.83%)、 精确度(82.20%)和召回率(71.35%)。 显然, CNN模型均优于其他三种传统分类方法。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同算法分类结果对比 Table 4 Comparison of classification results using different algorithms 准确率 精确度 召回率 5fold CNN 98.15%(2 601/2 650) 98.40%(984/1 000) 96.76%(984/1 017) 97.17% SVM 90.34%(2 394/2 650) 94.20%(942/1 000) 82.63%(942/1 140) 95.32% RF 88.64%(2 349/2 650) 83.10%(831/1 000) 86.29%(831/963) 92.21% DT 80.83%(2 142/2 650) 82.20%(822/1 000) 71.35%(822/1 152) 79.15% 注: CNN为卷积神经网络, SVM为支持向量机, RF为随机森林, DT为决策树; 5Fold为5折交叉验证; 括号中为例数比 Note: CNN is convolutional neural network, SVM is support vector machine, RF is random forest, DT is decision tree; 5Fold is 5-fold cross-validation; numbers in parentheses is the ratio of cases

表4 不同算法分类结果对比 Table 4 Comparison of classification results using different algorithms

为了进一步比较CNN模型和传统算法对高低级别胶质瘤的鉴别能力, 分别得到CNN, SVM, RF和DT模型的混淆矩阵, 如图3所示。 从图3中可以看出, 基于CNN方法所建模型的误判个数最少, 同时CNN模型对鉴别高低级别胶质瘤的灵敏度和特异性均高于其他算法所建模型, 结果表明CNN模型相比传统算法模型在鉴别高低级别胶质瘤方面具有明显优势。

图3

Fig.3

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图3 不同算法的混淆矩阵对比 注: 各图第1行两个色块区代表真阴性、 假阳性例数, 第2行两个色块区代表假阴性、 真阳性例数; CNN为卷积神经网络, SVM为支持向量机, RF为随机森林, DT为决策树Fig.3 Comparison of confusion matrices for different algorithms Note: The two coloured areas in row 1 of each figure represent the number of true negative and false positive cases, and the two coloured areas in row 2 represent the number of false negative and true positive cases; CNN is convolutional neural network, SVM is support vector machine, RF is random forest, DT is decision tree

为了定量评估各分类器的性能, 本研究采用了ROC曲线(receiver operating characteristic curve)分析。 ROC曲线是评估二分类器在不同决策阈值下表现的常用工具, 它通过绘制真阳性率(true positive rate, TPR)与假阳性率(false positive rate, FPR)之间的关系, 直观反映了分类器在敏感性(sensitivity)和特异性(specificity)之间的权衡情况。 与此同时, 曲线下面积(area under the curve, AUC)作为综合评价指标, 其数值介于0与1之间, AUC值越高表明分类器整体性能越好, 能够更有效地区分正负样本。 在本研究中, 我们绘制了CNN、 SVM、 RF和DT四种算法的ROC曲线(见图4), 并计算了各自的AUC值, 分别为0.983 9、 0.915 7、 0.903 1和0.780 9。 可以看出, CNN的AUC值最高, 显示出极高的敏感性和特异性, 证明其在胶质瘤高低级别的鉴别上具有显著优势。 相比之下, 其他传统分类方法虽然也表现出较好的分类能力, 但在性能上仍不及CNN。 因此, CNN 在该任务中表现更优, 验证了深度学习联合拉曼光谱在胶质瘤分级中的应用潜力。

图4

Fig.4

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	图4 不同算法ROC曲线对比 注: CNN为卷积神经网络, SVM为支持向量机, RF为随机森林, DT为决策树Fig.4 Comparison of ROC curves of different algorithms Note: CNN is convolutional neural network, SVM is support vector machine, RF is random forest and DT is decision tree

脑胶质瘤的组织学分级是评估肿瘤生物学行为的关键指标之一, 同时也是制定临床治疗方案的重要依据。 低级别胶质瘤侵袭性较低, 通常可以进行较大范围的切除, 从而减少复发的风险。 高级别胶质瘤由于其边界模糊和高侵袭性, 在保留功能的前提下应尽量彻底和更扩大范围切除包括一些非功能区的水肿带。 近年来, 拉曼光谱分子成像技术凭借其出色的化学特异性, 可以提供生物样品微观生化信息的变化, 为肿瘤的分类提供支持。 已有研究结合拉曼光谱与传统机器学习方法, 用于肿瘤分级和边界识别, 并取得了一定成效。 既往研究中, Hollon等^[10]使用受激拉曼组织学(stimulated Raman histology, SRH)结合人工智能开发DeepGlioma系统, 实现了IDH突变、 1p19q共缺失和ATRX 突变 的快速预测。 余新光等^[11]利用便携式拉曼光谱仪结合主成分分析-支持向量机(PCA-SVM)进行了胶质瘤分级研究, 展示了较好的边界识别能力。 尽管这些研究验证了拉曼光谱在胶质瘤诊断中的潜力, 但其主要依赖于传统机器学习方法, 仍面临一定局限。 由于拉曼光谱较高的特征维度和非线性分布, 这可能使得传统方法很难获得令人满意的结果。 而深度学习算法作为机器学习算法的先进迭代, 拥有强大的非线性建模能力, 通过多层神经网络组合的非线性模式, 能够学习到更复杂的规则和关系。 因此, 本研究基于CNN进行端到端学习, 能够自动提取光谱特征并建立更稳定的分类边界, 从而在胶质瘤分级任务中取得更优的分类效果。

实验结果表明, 在高级别胶质瘤中, 大部分蛋白质相关峰(758、 1 309、 1 556和1 606 cm^-1)的强度更高, 而仅有少部分蛋白质相关峰(1 002、 1 659 cm^-1)在低级别胶质瘤中强度更高。 这些特征峰的变化主要反映了胶质瘤组织在不同分级状态下的生化成分差异。 这与组织病理学结果一致, 显示随着胶质瘤的进展, 源自蛋白质的峰值在拉曼光谱中变得更加明显。 这是因为蛋白质在细胞增殖和侵袭迁移过程中发挥着重要作用^{[12, 13]}。 此外, 在高级别胶质瘤中, 核酸相关峰和脂质相关峰(828、 1 265和1 172 cm^-1)的强度也更高, 这是由于脂质和核酸是维持肿瘤细胞快速增殖所必需的重要物质^{[14, 15]}。 这些生化特征的变化为基于拉曼光谱的分类模型提供了重要信息, 也进一步支持了本研究的实验结果。

CNN模型在本研究中的分类准确率达到98.15%, 显著高于 SVM(90.34%)、 RF(88.64%)和 DT(80.83%)。 相比传统方法, CNN具备强大的自动特征学习能力, 能够直接从原始光谱数据中提取关键模式, 而无需依赖人工特征选择。 SVM依赖于超平面进行分类, 适用于低维、 线性可分的数据, 面对复杂光谱特征时表现不稳定; RF和DT通过特征分裂进行决策, 但容易受到数据噪声影响, 泛化能力相对较弱。 相比之下CNN通过卷积运算逐步提取局部和全局特征, 并结合池化层减少数据冗余, 使得模型能够在高噪声数据中保持较好的分类稳定性。 这一特性使得CNN在拉曼光谱分类任务中展现出更强的适应性, 能够更精准地识别光谱模式, 提高分类精度。