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李月, 林义利, 周云云, 杨信廷, 王增利, 刘欢. 基于同步荧光技术的牛肉中掺杂猪肉鉴别方法研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2024,44(10): 2968-2972.
LI Yue, LIN Yi-li, ZHOU Yun-yun, YANG Xin-ting, WANG Zeng-li, LIU Huan. Potentiality of Synchronous Fluorescence Technology for Identification of Pork Adulteration in Beef[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2024,44(10): 2968-2972.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2024)10-2968-05  
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基于同步荧光技术的牛肉中掺杂猪肉鉴别方法研究
李月1,2,3, 林义利4, 周云云1,2,3, 杨信廷2,3, 王增利1,*, 刘欢2,3,*
1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院食品营养与安全系, 北京 100083
2. 北京市农林科学院信息技术研究中心, 北京 100097
3. 农产品质量安全追溯技术及应用国家工程研究中心, 北京 100097
4. 中关村科技园区平谷园管理委员会, 北京 101200
*通讯作者 e-mail: wangzengli@cau.edu.cn; liuhuan@nercita.org.cn

作者简介: 李 月, 女, 1999年生, 中国农业大学食品科学与营养工程学院及北京市农林科学院信息技术研究中心, 农产品质量安全追溯技术及应用国家工程研究中心硕士研究生 e-mail: lyy1231232021@126.com

收稿日期: 2023-07-21 修回日期: 2024-01-15
基金: 国家自然科学基金项目(32001775)资助
摘要

牛肉是我国重要的食用肉品类, 近年来随着人们对牛肉需求的不断增加, 将猪肉冒充或添加在牛肉中出售的现象也日益严重, 亟需简单、 快速的检测肉品掺假的方法。 首先分析了牛肉和猪肉的三维荧光光谱特征差异, 确定同步荧光的波长差; 采用激发-发射固定波长差为160 nm的同步荧光光谱, 对牛肉掺杂猪肉的情况进行了定性判别和定量分析。 以测试集、 验证集和预测集样本的判别正确率作为定性判别模型的评价指标; 以相关系数( r)、 校正均方根误差(RMSEC)和预测均方根误差(RMSEP)作为定量分析模型的评价指标。 实验结果表明: 牛肉和猪肉的三维荧光光谱有显著差异, 牛肉在Ex/Em为270/320、 330/400、 350/500、 430/515和410/570 nm处有荧光峰, 猪肉的三个荧光峰分别在Ex/Em为270/320、 330/400和430/515 nm处。 设置同步荧光波长差为160 nm, 能采集到牛肉的3个荧光峰, 且其中两个位于峰顶。 牛肉、 猪肉、 掺假肉SVM定性判别模型的校正集准确率为97.56%, 预测准确率可达92.31%。 对比了无处理、 MSC处理和SNV处理的牛肉中猪肉掺加量PLS预测模型, 无处理的PLS模型最优, 其 rc、 rp、 RMSEC和RMSEP分别达到0.978 6、 0.959 0、 0.059 7和0.092 7。 基于同步荧光技术结合SVM和PLS的牛肉掺假猪肉定性判别和定量分析检测模型具有较高识别率和检测精度, 可以较为准确、 快速地检测牛肉中是否掺杂猪肉。

关键词: 牛肉; 掺假; 猪肉; 同步荧光
中图分类号:TS207.3 文献标志码:A
Potentiality of Synchronous Fluorescence Technology for Identification of Pork Adulteration in Beef
LI Yue1,2,3, LIN Yi-li4, ZHOU Yun-yun1,2,3, YANG Xin-ting2,3, WANG Zeng-li1,*, LIU Huan2,3,*
1. Department of Food Nutrition and Safety, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China
2. Information Technology Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China
3. National Engineering Research Center for Agri-Product Quality and Safety Traceability, Beijing 100097, China
4. Pinggu Garden Management Committee of Zhongguancun Science and Technology Park, Beijing 101200, China
*Corresponding authors
Abstract

Beef is an important edible meat in China. In recent years, with the increasing demand for beef, the phenomenon of pork being impersonated or added to beef for sale has become increasingly serious, and there is an urgent need for simple and rapid detection methods to monitor adulteration behavior. This study analyzed the three-dimensional fluorescence spectra of beef and pork to determine the wavelength difference of synchronous fluorescence. A synchronous fluorescence spectrum with a fixed wavelength difference of 160 nm was used to qualitatively distinguish and quantitatively analyze the doping of beef with pork. The discriminant accuracy of the test set, verification set, and prediction set samples are taken as the evaluation index of the qualitative Discriminative model: Correlation coefficient ( r), corrected Root-mean-square deviation (RMSEC) and predicted Root-mean-square deviation (RMSEP) were used as the evaluation indicators of the quantitative analysis model. The experimental results show a significant difference in the three-dimensional fluorescence spectra between beef and pork. Beef has fluorescence peaks at Ex/Em values of 270/320, 330/400, 350/500, 430/515 and 410/570 nm, while pork has three fluorescence peaks at Ex/Em values of 270/320, 330/400 and 430/515 nm. By setting the synchronous fluorescence wavelength difference to 160 nm, three fluorescence peaks of beef can be collected, with two of them located at the peak. The correction set accuracy of the SVM qualitative Discriminative model for beef, pork, and adulterated meat was 97.56%, and the prediction accuracy was 92.31%. The PLS prediction model for pork addition in beef without treatment, MSC treatment, and SNV treatment was compared. The PLS model without treatment was the best, with rc, rp, RMSEC, and REMSP reaching 0.978 6, 0.959 0, 0.059 7, and 0.092 7, respectively. Therefore, the qualitative discrimination and quantitative analysis detection model for beef adulterated pork based on synchronous fluorescence technology combined with SVM and PLS has a high recognition rate and detection accuracy, which can accurately and quickly detect whether pork is adulterated in beef.

Keyword: Beef; Adulteration; Pork; Synchronous fluorescence technology
引言

我国牛肉年产量达718.26万吨, 近五年产量稳步增长。 牛肉含有丰富的蛋白质、 多种维生素和必需氨基酸, 营养丰富, 风味鲜美; 牛肉中含有大量的硒、 铁、 铜等微量元素及人体日常所需的脂肪酸。 牛肉可参与人体内的生化反应, 产生促进人体新陈代谢的肽类物质, 使人体保持健康。 随着人们对于健康饮食认识的不断加强, 牛肉逐渐成为众多消费者的热门选择。 牛肉和猪肉都是红肉, 部分肉品企业因为牛肉的供应不足, 将价格较低的猪肉掺入到牛肉中销售, 这种行为侵害了消费者的知情权, 损害了消费者的实际利益。 从宗教和道德角度, 部分消费者对于肉类有不同的偏好, 掺假肉会导致消费者对牛肉丧失信任。

目前国内外对于掺假肉鉴定的传统方法包括聚合酶链式反应(PCR)法、 质谱法(MS)、 酶联免疫吸附法[1, 2, 3]等。 PCR法是目前肉质鉴定的最通用方法, 相应的国家标准包括GB/T 39517— 2018《常见动物源性成分快速测定膜芯片法》、 GB/T 35918— 2018《动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法》、 SB/T 10923— 2012 《肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光PCR法》等。 DNA试剂盒昂贵, 前处理繁琐耗时, 另外肉类加工过程中DNA易遭破坏, 限制了该方法使用[4]。 质谱法检测准确率高, 但是设备成本较高, 且样品前处理复杂。 酶联免疫吸附法成本低、 通量高, 但加工类肉制品的抗原易溶解, 不能同时分析多种成分[5]。 这些方法操作步骤繁琐, 检测时间长, 不适用于快速实时检测。 亟需一种新的快速、 无损检测方法对牛肉的真假进行检测和鉴别。

荧光光谱法是一种高灵敏度的快速检测技术, 此方法相较于上述检测方法具有简便、 无破坏性、 无需使用化学试剂等优势。 Petter Vejle Andersen[6]等使用荧光光谱结合PLS分析, 预测猪死后4~5 d腰最长肌的肉质变化, 结果表明, 肉pH和肌内脂肪含量(IMF)在激发波长322 nm处存在联系, 并捕获了蛋白中中荧光最强的氨基酸色氨酸的发射。 Zhuang[7]等使用便携式荧光光谱, 以-14、 -24和-80 ℃条件下的冻猪肉总挥发性碱态氮(TVB-N)和pH为研究对象, 建立的偏最小二乘回归(PLSR)模型具有较好的预测效果。 在以往研究中, 采用同步荧光光谱法无损检测牛肉的化学和微生物腐败指标, 结果表明, 氨基酸和共轭席夫碱化合物的荧光峰分别与挥发性盐基氮(TVB-N)和硫代巴比妥酸反应物(TBARS)值强相关, 氨基酸与胶原蛋白的荧光峰与TVC值强相关[8]。 同步荧光扫描技术与常规荧光方法最大的区别是同时扫描激发和发射两个单色器波长, 具有简化图谱、 提高选择性、 减少光散射干扰等特点[9]。 本研究提出一种用于牛肉掺杂猪肉检测的同步荧光光谱法, 判断牛肉中是否有猪肉的掺入以及掺入的比例, 为肉品质量监管提供技术支持。

1 实验部分
1.1 肉品及试剂

牛里脊和猪里脊是从盒马日日鲜购买的冰鲜产品, 不含肥肉。 使用的试剂为水(分析纯)。

1.2 样品制备

肉糜的制备: 取出包装内的冰鲜里脊肉, 去除可见的脂肪和结缔组织, 使用绞肉机搅打成均匀的糊状。 将牛肉糜与猪肉糜按照一定比例混合, 配置成猪肉含量为2%, 5%, 10%, 15%, 20%、 30%和50%的掺假肉糜。

肉浸液的制备: 称取4 g肉糜/掺假肉糜至离心管中, 加入36 mL水(分析纯), 置于振荡器中震荡30 min。 静置离心管1 h, 过滤内容物得到上清液, 即为肉浸液/掺假肉浸液。

1.3 数据采集

使用日立F-7000荧光分光光度计测定了牛肉样品的同步荧光光谱和三维荧光光谱。

同步荧光光谱: 激发波长240~600 nm, 步长为5 nm, Δ λ 设置为160 nm, 将肉浸液放入5 mL的四面通光的石英比色皿中, 再放入液体样品池进行同步荧光扫描。 每组掺假比例的样品制备样品6个, 每个样品进行3次平行测定。

三维荧光光谱: 激发波长为200~710 nm, 发射波长为210~800 nm, 每间隔5 nm采集一个数据点, 狭缝宽度5 nm, 扫描速度30 000 nm· min-1。

1.4 数据处理及软件应用

SVM是一种基于统计学习理论的机器学习方法, 常用于非线性关系的关联, 属于神经网络和非线性建模的范畴, 一般分为支持向量分类(support vector classification, SVC)和支持向量回归(support vector regression, SVR)两种。 SVM具有全局优化、 泛用性能好、 可以避免神经网络中的局部极小值等优点, 已成为目前国内、 国际研究的热点[10]。 本研究使用SVC分类鉴别牛肉、 猪肉和掺假肉。

PLS回归用于确定荧光光谱与掺假浓度之间的定量关系。 收集到的数据被分为校正集和验证集, 通过留一交叉法对预测模型进行了验证。 为了比较所建立PLS模型的性能, 分别计算了相关系数的平方(R2)、 校准均方根误差(RMSEC)和预测均方根误差(RMSEP)。 良好的PLS模型应同时具有高R2, 低RMSEC和低RMSEP[11]。 RMSEC和RMSEP计算公式如式(1)

RMSEC=∑i=1nc(y'i-yi)2ncRMSEP=∑i=1np(y'i-yi)2np(1)

式(1)中, y'i是第i次实验的预测值, yi是第i次实验的真实值, nc是校正集中的实验次数, np是预测集中的实验次数。

使用The Unscrambler X10.4运行支持向量机分类(SVC)进行定性分析; 运行偏最小二乘回归(PLSR), 进行定量分析; 使用Origin 8.5作图。

2 结果与讨论
2.1 同步荧光波长差Δ λ 的确定

恒波长同步荧光技术中, 波长间隔λ 的选择将直接影响同步荧光光谱的形状、 带宽和信号强度[12]。 三维荧光光谱能一次测量多个激发-发射波长组合, 获得全面的样品荧光信息。 虽然两者有所差异, 但在某些情况下, 混合物体系的三维荧光光谱可以从理论上预测同步扫描时的Δ λ 值[13]。 同步荧光激发波长和发射波长的波长差恒定(λ Em=λ Ex+Δ λ ), 可在三维荧光光谱图中标示, 以模拟同步荧光扫描结果。

测定了猪肉浸液和牛肉浸液的三维荧光光谱见图1(a, b), 结果显示, 牛肉和猪肉的三维荧光光谱有明显差异。 图1(a)牛肉样品的三维荧光光谱在Ex/Em为270/320、 330/400、 350/500、 430/515和410/570 nm处有荧光峰, 图1(b)猪肉的三个荧光峰分别在Ex/Em为270/320、 330/400和430/515 nm处。 牛肉相比猪肉多出的350/500 nm峰是NADH产生的, 410/570 nm峰是锌原卟啉(ZnPP)产生的。 这表明牛肉的三维荧光指纹图谱较猪肉有明显差异, 使用荧光技术区分牛肉中是否掺假猪肉是可行的。

图1 牛肉(a)和猪肉(b)的三维荧光光谱图Fig.1 3-D fluorescence spectra of beef (a) and pork (b)

同步荧光扫描的结果越靠近三维荧光光谱图样品特征峰的峰顶, 同步荧光结果的相应特征峰就越宽, 荧光强度越强, 对荧光物质描述的准确性越高。 当Δ λ =160 nm时, 对于λ Em=λ Ex+Δ λ (160 nm)直线, 能采集到牛肉中激发波长为280、 350和420 nm的荧光特征峰, 其中两个峰的位置接近峰顶; 图1(a)只采集到猪肉中激发波长为280 nm的特征峰[见图1(b)]。 因此, 选用Δ λ =160 nm作为同步荧光光谱测定的波长差。

2.2 同步图谱的特征分析

如图2所示, 在波长差为160 nm时, 牛肉和掺假肉在激发波长为290、 360、 430 nm处存在荧光峰, 猪肉样品仅在290 nm处存在荧光峰。 牛肉和掺假肉在310 nm处存在肩峰, 且随着掺假比例的升高, 肩峰的高度越低。 纯猪肉在此激发波长下无肩峰。 牛肉和猪肉在290 nm的激发波长处均有较高的荧光强度, 360和430 nm激发波长下的牛肉荧光强度远强于猪肉。 290 nm的荧光峰由色氨酸发出, 360 nm处的荧光峰由NADH发出, 430 nm处的荧光峰由锌原卟啉(ZnPP)发出[14]。 不同掺假比例的肉样品的同步荧光光谱的差异和变化趋势证明了该光谱具有鉴别掺假肉的可行性。

图2 不同掺假比例样品的同步荧光光谱图(Δ λ =160 nm)Fig.2 Synchronous fluorescence spectra of samples with different adulteration ratios(Δ λ =160 nm)

2.3 牛肉、 猪肉和掺假肉的定性判别

按照3∶ 1的比例, 将54个样品随机分为41个校正集和13个预测集, 样本中添加的猪肉含量包括0%、 2%、 5%、 10%、 15%、 20%、 30%、 50%、 100%。 在激发波长240~600 nm范围内, 对添加了不同比例猪肉的牛肉建立SVM分类模型, 将类别划分为牛肉、 掺假肉、 猪肉三类, 分别以0、 1、 2表示其类别。 设置模型参数如下: 核函数Polynomial, degree设置为3, 校正集使用K-CV交叉验证, 使用网格搜索法确定最佳的nu值为0.12。 Gamma值为0.003。 该模型的训练集分类准确率为97.56%, 验证集准确率为92.68%, 预测集准确率为92.31%。 SVM结果如图3所示, SVM分类模型对于牛肉、 猪肉和掺假肉有良好的区分度。

图3 SVM鉴别牛肉、 猪肉和掺假肉的定性判别结果(Δ λ =160 nm)Fig.3 SVM identification of beef, pork, and adulterated meat results(Δ λ =160 nm)

2.4 掺假肉中猪肉含量的定量分析

对添加了不同比例猪肉的牛肉光谱建立PLS模型, 建模结果如表1所示。 验证结果表明, 所建的牛肉掺假定量模型有良好的预测性能。 由表1可知, 基于不同预处理方法处理后的光谱信息建立牛肉中掺假猪肉含量的PLSR模型时, 原始光谱模型效果最优, 其校正集和验证集的r最大, 分别为0.978 6和0.959 0; RMSE最小, 分别为0.059 7和0.092 7, 相比于MSC和SNV处理的光谱模型有显著优势。

表1 不同光谱预处理PLSR建模结果 Table 1 PLSR modeling results of different spectral preprocessing
3 结论

利用同步荧光技术进行牛肉掺假猪肉研究, 通过分析三维荧光光谱确定同步荧光的波长差为160 nm。 使用不同的光谱预处理方法, 建立牛肉、 猪肉和掺假肉的SVM定性判别模型和不同比例掺假肉的PLS定量分析模型。 对于SVM分类模型训练集分类准确率为97.56%, 验证集准确率为92.68%, 预测集准确率为92.31%。 对于最优PLS定量模型rc、 rp、 RMSEC和RMSEP分别为0.978 6、 0.959 0、 0.059 7和0.092 7, 均取得了良好的建模效果, 研究表明同步荧光技术可以实现牛肉中掺假猪肉的定性鉴别和定量检测, 可为快速检测牛肉的真实性提供理论依据和技术支撑。

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