5.0 mmol· L^-1TMB储备液: 准确称取0.060 0 g TMB于50 mL容量瓶中, 溶于25 mL无水乙醇, 用超纯水定容。 0.10 mmol· L^-1TMB工作液: 准确移取1.0 mL TMB储备液至50 mL容量瓶中, 先加入25 mL无水乙醇, 再用超纯水定容。 pH 5.0 NaAc-HCl缓冲液: 0.20 mol· L^-1 NaAc和0.10 mol· L^-1 HCl在pH计上配制而成。 LVF工作液: 0.20 mmol· L^-1。 AO(分子式: C₁₇H₂₀ClN₃· 1/2ZnCl₂)储备液: 1.0 mmol· L^-1。 AO工作液: 0.50 mmol· L^-1。 除LVF为标准品外, 实验所用试剂均为分析纯(AR), 实验用水均为超纯(UP)水(18.25 MΩ cm 25 ℃)。 盐酸左氧氟沙星胶囊、 盐酸左氧氟沙星片、 盐酸左氧氟沙星滴眼液均购自内江某药店。

用F-4600型的荧光分光光度计(日本日立)扫描并记录样品的荧光光谱, 测定参数: 激发狭缝为2.5 nm, 发射狭缝为5 nm, 光电倍增管(PMT)电压为700 V。 采用U-3010型的紫外可见分光光度计(日本日立)扫描并记录样品的紫外吸收光谱。 用pHS-3E的pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)调节溶液的pH值。

1.2.1 FRET体系的构建

分别移取不同体积的TMB工作液(0~1.5 mL)于10 mL比色管中, 依次加入1.0 mL pH 5.0NaAc-HCl缓冲液和0.80 mL AO工作液, 定容至5 mL, 摇匀, 在室温下静置7 min。 待体系反应完全后, 以310 nm为激发波长, 在荧光分光光度计上扫描并记录330~630 nm范围内的荧光光谱。

依次移取1.0 mL TMB工作液和1.0 mL pH 5.0 NaAc-HCl缓冲液于10 mL比色管中, 分别加入不同体积(0~0.80 mL)的AO工作液, 定容至5 mL, 摇匀, 在室温下静置7 min。 在相同激发波长下, 用荧光分光光度计扫描并记录相同波长范围内的荧光光谱。

1.2.2 LVF的比率荧光传感器的构建

依次准确移取1.0 mL TMB工作液、 1.0 mL pH 5.0 NaAc-HCl缓冲液于10 mL比色管中, 向其中加入不同体积的LVF工作液, 随后加入0.80 mL AO工作液, 定容至5 mL, 摇匀, 室温下静置反应9 min。 在310 nm激发波长下, 在荧光分光光度计上扫描并记录其330~630 nm范围内的荧光光谱。 计算402和546 nm处的荧光强度比值F_{546 nm}/F_{402 nm}, 以F_{546 nm}/F_{402 nm}为纵坐标, LVF浓度为横坐标, 绘制工作曲线。

1.2.3 样品的处理与分析

盐酸左氧氟沙星滴眼液: 5 mL· 支^-1, 含LVF(以C₁₈H₂₀FN₃O₄计)15 mg, 即3 mg· mL^-1。 使用时移取1.2 mL, 用超纯水定容至50 mL, 稀释至与LVF工作液相当的浓度。

盐酸左氧氟沙星胶囊: 20粒· 盒^-1, 0.1 g· 粒^-1(以C₁₈H₂₀FN₃O₄计)。 参照参考文献[24, 25], 随机取5粒胶囊, 用研钵将其中的粉末研细。 称取适量粉末, 约含LVF 0.1 g, 用适量0.1 mol· L^-1 HCl溶解, 定容100 mL。 用0.22 μm的针头过滤器过滤, 用超纯水稀释至与LVF工作液相当的浓度。

盐酸左氧氟沙星片剂: 10片· 盒^-1, 0.2 g· 片^-1(以C₁₈H₂₀FN₃O₄计)。 处理方法与盐酸左氧氟沙星胶囊相同。

准确移取各样品溶液0.70 mL, 按1.2.2的方法测定LVF含量, 并做加标回收实验。

TMB的荧光光谱和AO的吸收光谱有相当程度的重叠, 且TMB的荧光峰和AO的荧光峰可以明显分开[图1(a)], 说明TMB和AO之间理论上可以发生FRET。 进一步研究发现, 在pH 5.0 NaAc-HCl缓冲溶液中, 保持TMB浓度不变, 以310 nm的波长激发, 增加AO浓度, AO荧光强度依次增加, TMB荧光强度则依次降低[图1(b)]。 在相同实验条件下, 保持AO浓度不变, 增加TMB浓度, TMB和AO的荧光强度均依次增大[图1(c)]。 这充分证明了能量供体TMB和能量受体AO之间可以建立FRET体系。 为了得到较强的FRET效率, 选择80 μmol· L^-1 AO和20 μmol· L^-1 TMB构建FRET体系。

图1

Fig.1

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图1 (a) TMB的荧光光谱(λ ex =310 nm) (a), AO的吸收光谱(b), 发射光谱(λ ex=405 nm) (c)和(λ ex=505 nm)(d), LVF的吸收光谱(e)和发射光谱(λ ex =390 nm)(f); AO浓度(b)和TMB浓度(c)对FRET体系的影响 2.2 TMB荧光量子产率的检测Fig.1 (a) Fluorescence spectrum of TMB (λ ex=310 nm) (a), absorption spectrum (b), emission spectrum (λ ex=405 nm) (c) and (λ ex=505 nm) (d) of AO, LVF absorption spectrum (e) emission spectrum (λ ex=390 nm) of LVF (f) effects of AO concentraction

以溶解在0.1 mol· L^-1 NaOH中的荧光素(荧光量子产率为0.91)^[26]为标准物质, 用origin做图求斜率[图2(a)], 再根据式(1)进行计算, 得TMB的荧光量子产率23.6%。

φ=φsAsAxIxIsnx2ns2(1)

式(1)中, φ 为TMB的荧光量子产率; φ _s为荧光素的荧光量子产率; A_s为荧光素在激发波长490 nm下的荧光积分面积, 积分范围为470~650 nm; A_x为TMB在激发波长310 nm下的荧光积分面积, 积分范围为330~530 nm; I_x为TMB在310 nm波长处的吸光强度; I_s为荧光素在490 nm波长下的吸光强度; n为溶剂折射率, 在水中n_x= ns^[27]。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 (a) TMB的荧光量子产率图; (b) LVF浓度对FRET体系的影响Fig.2 (a) Fluorescence quantum yield of TMB; (b) Effect of LVF concentraction on FRET system

根据能量转移理论, 通过如式(2)— 式(5)计算供体-受体之间距离

J=∑F(λ)ε(λ)λ4Δλ∑F(λ)Δλ(2)

R06=8.8×10-25K2N-4φJ(3)

E=1-FF0(4)

E=R06R06+r6(5)

式中, F(λ )为供体在λ 处的荧光强度, ε (λ )为受体在处的摩尔吸收系数, J即表示供体荧光光谱和受体吸收光谱之间重叠部分的积分面积; K²为偶极空间取向因子, 因为能量供体和受体的空间分布可以被认为是随机且均等的, 故取2/3; N取水和有机溶剂平均折射率1.37; φ 为供体的荧光量子产率; R₀表示E=50%时, 供体和受体之间的距离; r是供体和受体之间的能量转移距离; F表示加入受体后供体的荧光强度, F₀表示不加入受体时供体的荧光强度, E表示能量转移效率^{[28, 29]}。 计算结果为: J=4.48× 10^-15 cm³· L· mol^-1, R₀=2.37 nm, E=62.5%, r=2.17 nm。 R₀和r均小于7 nm, 进一步表明TMB和AO之间确实能发生FRET。

当体系中加入适量LVF后, TMB荧光强度降低, AO荧光强度增加, 体系的FRET效率明显增大[图2(b)], 且AO在546 nm处的荧光强度和TMB在402 nm处的荧光强度之比F_{546 nm}/F_{402 nm}与LVF浓度之间存在线性关系。 由此可以建立一种测定LVF含量的新型比率型荧光传感器。

在酸性介质中, TMB中氨基质子化而带正电荷, 且AO和LVF均以阳离子形式存在, 故三者之间不易发生静电作用, 且各有机分子也不易发生化学反应。 LVF的吸收光谱和TMB的荧光光谱在350~400 nm之间有相当程度重叠[图1(a)], 固定TMB的浓度, 增加LVF的浓度, TMB的荧光依次减弱, LVF的荧光依次增强[图3(a)]; 固定LVF的浓度, 增加TMB的浓度, TMB和LVF的荧光皆依次增强[图3(b)], 说明供体TMB和受体LVF之间发生了FRET。 此外, AO的吸收光谱和LVF的荧光光谱在450~550 nm之间有相当程度重叠[图1(a)], 固定AO的浓度, 增加LVF的浓度, LVF和AO的荧光均依次增加[图3(c)]; 固定LVF的浓度, 增加AO的浓度, LVF的荧光依次减弱, AO的荧光则依次增强[图3(d)], 说明LVF作为供体将荧光能量转移给受体AO。 由此说明, LVF在TMB和AO间起桥梁作用, 其将吸收的TMB的荧光能量转移给AO, 从而提高了体系的FRET效率, 故可根据TMB和AO荧光强度比值建立测定LVF含量的比率型荧光传感器。 体系的荧光共振能量转移的机理如示意图2。

图3

Fig.3

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	图3 LVF浓度(a); TMB浓度(b); LVF浓度(c)和AO浓度(d)对FRET体系的影响Fig.3 (a) Effect of LVF concentration; (b) TMB concentration; (c) AO concentration; (d) FRET system

示意图2

Scheme 2

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	示意图2 基于TMB和AO之间FRET的LVF比率荧光传感器示意图Scheme 2 Schematic illustration of LVF ratiometric fluorescence sensor based on FRET between TMB and AO

2.6.1 缓冲介质及酸度的选择

pH对TMB的荧光强度影响较大, 在酸性条件下TMB荧光较强, 碱性条件下荧光减弱甚至趋于0, 故考察了不同缓冲介质及酸度对FRET体系的影响。 分别比较了5种不同的缓冲溶液(PBS、 Tris-HCl、 B-R、 NaAc-HCl、 NaAc-HAc)对LVF比率荧光传感器的灵敏度和线性关系的影响, 结果表明, 在NaAc-HCl缓冲溶液中, 传感器的线性范围最宽、 灵敏度和线性关系最好, 故选择NaAc-HCl缓冲溶液作为介质。 研究了不同pH值对体系灵敏度的影响, 结果表明, 在NaAc-HCl缓冲溶液中, 当pH 5.0或5.5时, 体系的灵敏度都比较好, 如图4(a)所示。 而pH 5.0时, 体系的线性关系更好、 线性范围更宽[图4(b), (c)], 故选择pH 5.0的缓冲溶液。 研究了缓冲溶液不同用量对体系灵敏度的影响, 缓冲溶液的用量对体系影响不大, 综合考虑体系灵敏度和样品溶液体积, 选择1.0 mL缓冲溶液最适宜。 故选择1.0 mL pH 5.0的NaAc-HCl缓冲溶液作为反应介质。

图4

Fig.4

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	图4 (a) pH值及pH 5.0 (b)和pH 5.5(c)的缓冲介质对FRET体系的影响Fig.4 (a) Effect of pH value on FRET systems (b) pH 5.5 (c) on FRET systems

2.6.2 稳定性

在最优实验条件下, 探究了反应时间对荧光共振能量转移体系的影响。 结果表明, 当反应时间达到7 min时, 体系基本反应完全, 连续扫描1 h, 体系的荧光强度基本不变, 说明该体系较稳定[图5(a)]。 为使反应充分进行, 选择反应时间为9 min。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 (a)时间对FRET体系的影响; (b)线性回归方程Fig.5 (a) Effect of time on FRET system; (b) Linear regression equation

在优化实验条件下, 以LVF浓度(mmol· L^-1)为横坐标, F_{546 nm}/F_{402 nm}为纵坐标绘制工作曲线。 如图5(b), 当LVF浓度在2~80 μmol· L^-1范围内, 体系的F_{546 nm}/F_{402 nm}与LVF浓度之间存在良好的线性关系。 其线性回归方程为F_{546 nm}/F_{402 nm}=87.92c+3.108, 相关系数R为0.999 3, 检出限为15.7 nmol· L^-1(3s/k, s为11次空白平行样的标准偏差, k为线性回归方程的斜率)。 与文献已报道的分析方法相比(表1), 本研究设计的比率型荧光探针具有灵敏度高、 选择性好等特点。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同方法检测LVF的性能比较 Table 1 Comparison of different methods for detection of LVF 分析方法 检测样品 线性范围 检出限 响应时间 参考文献 微分脉冲伏安法 药物和尿液 7.0~30 μmol· L-1 1.45 μmol· L-1 90 s [2] 方波伏安法 药物和尿液 17~70 μmol· L-1 1.19 μmol· L-1 60 s [2] 流动注射法 药物和尿液 10~50 μmol· L-1 1.90 μmol· L-1 - [2] 光传感器 (PGr-GQDs-MIP-Fe3O4@SiO2) 牛奶 0.1~25.0 μ g· L-1 0.03 μ g· L-1 12 min [3] 高效液相色谱法 血浆 2.7~13.0 μ g· mL-1 0.05 μ g· mL-1 5min [30] 电化学传感器(CPEs) 血清、 尿液和药物 1.0× 10-2~1.0× 10-5 mol· L-1 1.0× 10-5 mol· L-1 < 1 min [4] 压电免疫传感器(MWCNTs) 牛奶 30~650 ng· mL-1 25 ng· mL-1 20 min [31] 电化学传感器(PCY/CPE) 血清 0.2~5.0 μmol· L-1 17.1 nmol· L-1 30 s [6] 比率型荧光探针 药物 2~80 μmol· L-1 15.7 nmol· L-1 9 min 本工作

表1 不同方法检测LVF的性能比较 Table 1 Comparison of different methods for detection of LVF

在最优条件下, 考察了该比率型荧光传感器对测定40μmol· L^-1 LVF的选择性。 如图6所示, 1.0 mmol· L^-1 SO42-、 SO32-、 S^2-、 NO3-、 F^-、 Br^-、 K⁺, 0.50 mmol· L^-1 I^-, 0.20 mmol· L^-1 Ag⁺、 Fe³⁺, 0.10 mmol· L^-1 CO32-、 ClO3-、 IO3-、 SCN^-、 Mg²⁺、 Ca²⁺、 Ba²⁺、 Cu²⁺、 MoO42-、 Hg²⁺、 Cd²⁺、 Mn²⁺、 Zn²⁺、 Co²⁺、 Pb²⁺、 Ni²⁺、 Cr³⁺、 Al³⁺, 20 mmol· L^-1 H₂P O4-, 0.23 mmol· L^-1抗坏血酸 (Vc), 0.26 mmol· L^-1谷胱甘肽 (GSH), 0.54 mmol· L^-1甘氨酸 (Gly), 0.56 mmol· L^-1 N-乙酰-L-半胱氨酸 (NAC), 0.58 mmol· L^-1异烟肼 (INH), 0.60 mmol· L^-1L-亮氨酸 (Leu), 0.90 mmol· L^-1丙氨酸 (Ala), 10 mmol· L^-1蔗糖 (SUC)、 葡萄糖 (Glu), 0.05%淀粉(Amy)均对测定LVF不影响, 说明该体系选择性较好。

图6

Fig.6

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	图6 共存物质对FRET体系的影响Fig.6 Effects of coexistence substances on the FRET system

按照1.2.3方法分别对盐酸左氧氟沙星胶囊、 盐酸左氧氟沙星片、 盐酸左氧氟沙星滴眼液3种商业LVF药物制剂进行处理, 得到3种不同的样品溶液。 准确移取一定量的不同样品溶液, 按照1.2.2对其中的LVF含量分析测定, 并进行加标回收实验。 结果表明, 3种样品的回收率均在93%~97%之间, RSD%均小于5%, 且3种样品中LVF含量的测定值与实际药品的标示值基本吻合, 说明基于TMB和AO间FRET体系的比率型荧光探针用于实际药品中LVF含量的测定, 方法可靠。 分析结果如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 样品分析结果(n=5) Table 2 Sample analysis results (n=5) 样品 标示含量/ (g· 粒-1或 g· 片-1 或mg· mL-1) 测得含量/ (g· 粒-1或 g· 片-1 或mg· mL-1) 测得值/ (μmol· L-1) 平均值/ (μmol· L-1) RSD/ % 加标值/ (μmol· L-1) 加标测定值/ (μmol· L-1) 平均值/ (μmol· L-1) 回收率 /% RSD /% 胶囊 0.10 0.13 35.1, 36.2, 35.9, 33.6, 36.8 35.5 3.1 32.0 28.8, 30.8, 27.2, 31.6, 30.9 29.9 93.4 2.5 片剂 0.20 0.23 33.4, 31.4, 31.4, 30.9, 34.2 32.3 4.1 32.0 29.0, 30.8, 32.0, 31.2, 31.3 30.8 96.3 1.6 滴眼液 3.0 3.6 34.2, 33.7, 32.4, 33.1, 34.5 33.6 2.2 32.0 30.4, 30.5, 31.7, 29.9, 32.1 30.9 96.6 1.3

表2 样品分析结果(n=5) Table 2 Sample analysis results (n=5)