引用本文
张晓旭, 林小仙, 张丹, 张琪, 尹雪峰, 阴佳璐, 张维悦, 李依璇, 王东亮, 孙亚楠. 基于傅里叶变换红外光谱技术解析鲜炖燕窝中功能因子与肠道菌群的关系[J]. 光谱学与光谱分析, 2023,43(8): 2452-2457.
ZHANG Xiao-xu, LIN Xiao-xian, ZHANG Dan, ZHANG Qi, YIN Xue-feng, YIN Jia-lu, ZHANG Wei-yue, LI Yi-xuan, WANG Dong-liang, SUN Ya-nan. Study on the Analysis of the Relationship Between Functional Factors and Intestinal Flora in Freshly Stewed Bird's Nest Based on Fourier Transform Infrared Spectroscopy[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(8): 2452-2457.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2023)08-2452-06  
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基于傅里叶变换红外光谱技术解析鲜炖燕窝中功能因子与肠道菌群的关系
张晓旭1, 林小仙3, 张丹2, 张琪1, 尹雪峰2, 阴佳璐3,4, 张维悦4, 李依璇1, 王东亮3,4,*, 孙亚楠1,*
1.中国农业大学营养与健康系, 北京 100193
2.中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京 100083
3.北京小仙炖生物科技有限公司, 北京 100020
4.河北省燕窝鲜炖技术创新中心, 河北 廊坊 065700
*通讯作者 e-mail: syn612@cau.edu.cn; dongliang.wang@xxdun.com

作者简介: 张晓旭, 女, 1989年生, 中国农业大学营养与健康系博士研究生 e-mail: XiaoxuZhang0220@cau.edu.cn

收稿日期: 2022-04-19 修回日期: 2022-06-20 接受日期: 2022-06-20
基金: 高等学校学科创新引智计划(111计划)—食品营养与健康创新引智基地(B18053)资助
摘要

食用燕窝可以调节肠道菌群, 改善人体免疫。 采用傅里叶变换红外光谱技术对鲜炖燕窝进行光谱扫描, 并用特征的光谱吸收峰与服用燕窝后的小鼠肠道菌群进行关联性分析, 解析燕窝中的功能因子与肠道菌群的关联, 为探讨燕窝调控肠道机理奠定研究基础。 结果表明, 服用仙炖燕窝后肠道菌在属水平上: 有益菌 Lactobacillus和 Lachnospiraceae_NK4 A136 _group呈现上升趋势, 有益菌 Faecalibaculum和 Akkermansia呈现下降趋势; 有害菌 Desulfovibrio、 Enterorhabdus和 Candidatus_Saccharimonas均呈现下降趋势。 两个产品燕窝的红外差异光谱主要集中在1 700~1 200 cm-1波段范围, 主要为酰胺键、 芳香C=C键以及羧基C=O基团的分布区, 这些官能团与有益菌 Lactobacillus和 Lachnospiraceae_NK4 A136 _group呈现正相关, 与有害菌 Desulfovibrio和 Enterorhabdus呈现负相关。 随后利用高分辨质谱对相应的鲜炖燕窝产品进行物质解析, 发现主要成分有氨基酸类, 脂类(磷酸酯类、 脂肪酰、 鞘氨醇等), 酯类和唾液酸等物质, 这些物质与肠道菌呈现不同的相关性, 总的来说脂类物质中特别是一些磷酸酯类(磷脂酸、 磷脂酰胆碱、 磷脂酰甘油、 磷脂酰乙醇胺)和脂肪酰类物质与有害菌呈现负相关, 与有益菌呈现正相关。 这些物质所含有的特征官能团也可以与红外结果相对应。 以上结果表明, 傅里叶变换红外光谱技术可为探讨燕窝中功能因子调控肠道菌群研究提供理论依据。

关键词: 鲜炖燕窝; 傅里叶变换红外光谱; 功能因子; 肠道菌群
中图分类号:O657.3 文献标志码:A
Study on the Analysis of the Relationship Between Functional Factors and Intestinal Flora in Freshly Stewed Bird's Nest Based on Fourier Transform Infrared Spectroscopy
ZHANG Xiao-xu1, LIN Xiao-xian3, ZHANG Dan2, ZHANG Qi1, YIN Xue-feng2, YIN Jia-lu3,4, ZHANG Wei-yue4, LI Yi-xuan1, WANG Dong-liang3,4,*, SUN Ya-nan1,*
1. Department of Nutrition and Health, China Agricultural University, Beijing 100193, China
2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China
3. Beijing Xiaoxiandun Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100020, China
4. Hebei Edible Bird's Nest Fresh Stew Technology Innovation Center, Langfang 065700, China
*Corresponding authors
Abstract

Eating bird's nest (EBN)can regulate intestinal flora and improve human immunity. Excavating the key nutrients and effective functional groups in fresh stewed bird's nest (FSBN)can lay a research foundation for exploring the mechanism of bird's nest regulating intestinal flora. The functional groups and material composition of the two brands of FSBN products were analyzed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS), respectively. In order to explore the effective functional groups and key regulatory substances in the regulation of intestinal flora after eating FSBN, the relationship between FTIR and HRMS results and the abundance of intestinal flora in C57BL/6N mice was established by correlation analysis. The results showed that after taking FSBN, the intestinal bacteria that differ greatly in the species level are as follows: beneficial bacteria Lactobacillus and Lachnospiraceae_NK4 A136 _group showed an upward trend, beneficial bacteria Faecalibaculumand Akkermansia showed a downward trend, and harmful bacteria Desulfovibrio, Enterorhabdus and Candidatus_Saccharimonas showed a downward trend. The infrared difference spectra of the two products were mainly concentrated in the 1 700~1 200 cm-1 band, which were mainly the distribution areas of the amide bond, aromatic C=C and carboxylic acid C=O group. These functional groups were positively correlated with beneficial bacteria Lactobacillus and Lachnospiraceae_NK4 A136 _group and negatively correlated with harmful bacteria Desulfovibrio and Enterorhabdus. After analysing small molecular substances in FSBN by metabolomics, it was found that the main components were amino acids, lipids, esters and sialic acids, which showed different correlations with intestinal bacteria. Generally speaking, lipids, especially some phosphate esters (Phosphate, Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol) and fatty acyl showed extremely significant negative correlation with harmful bacteria and a positive correlation with beneficial bacteria. The characteristic groups in these substances can also correspond to the FTIR results. The above results show that both Fourier transform infrared spectroscopy and metabolomics can provide a theoretical basis for studying nutrients on the regulation of intestinal flora.

Keyword: Fresh stewed bird's nest; Fourier transform infrared spectroscopy; Functional factors; Intestinal flora
引言

燕窝为雨燕科(Apodidase)金丝燕及多种同属燕类分泌的唾液与其绒羽混合凝结而筑成的巢窝。 自古燕窝被记载具有治疗肺部疾病例如痨瘵、 咳痰等疗效[1]。 燕窝含有丰富的蛋白质、 氨基酸、 多糖和唾液酸, 是一种滋补的高级食材, 因此食用燕窝已经成为当下保健养生的流行趋势[2, 3, 4, 5]。 大量的研究表明燕窝具有抗氧化、 改善记忆力、 提高免疫力和调节肠道菌群的功效[6, 7, 8]。 赵冉等人研究发现, 小鼠服用金丝燕窝后, 可提高小鼠肠道中的有益菌如双歧杆菌和乳杆菌, 降低有害菌如产气荚膜梭菌含量[8]。 虽然燕窝对肠道健康改善功效已被证实, 但并未解析燕窝中有调控作用的主要功能因子。

近年来, 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)技术已经广泛应用在食品品质分析和真伪鉴别中[9, 10, 11, 12]。 孙素琴[10]等采用FTIR光谱法, 绘制了干燕窝的“ 指纹图谱” , 结果显示干燕窝样品的吸收峰主要有亚甲基(2 935 cm-1)、 酰胺Ⅰ 带(1 651 cm-1)、 酰胺Ⅱ 带(1 538 cm-1)及多糖(1 047 cm-1)的吸收峰, 而当燕窝中添加了其他物质例如多糖和明胶使得其主峰发生了偏差。 可见FTIR技术可以通过吸收峰的响应以及波数变化来判断燕窝产品的品质, 以及成分的可能变化。

研究拟采用FTIR技术对鲜炖燕窝产品进行光谱轮廓绘制, 分析特征吸收峰强度与服用鲜炖燕窝后的小鼠肠道菌群进行关联性, 探讨鲜炖燕窝中影响肠道菌群变化的有效官能团, 预测燕窝中有效功能因子。 最后利用高分辨质谱解析燕窝中营养物质以验证红外技术对功能因子的推断, 为后续开展肠道菌群调控机制研究提供物质基础。

1 实验部分
1.1 材料与试剂

1.1.1 燕窝

鲜炖燕窝A(95 ℃杀菌)、 B(115 ℃杀菌)两个样品, 生产于2021年7月, 燕窝原料均为白燕盏, 产地印度尼西亚。 鲜炖燕窝放于-80 ℃冰箱冷冻24 h, 使用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥48 h, 用均质机对其进行均质为冻干粉。

1.1.2 实验动物

C57BL/6N小鼠7周龄, 体重20~24 g, 雄性, SPF级别, 购于北京维通利华实验动物有限公司, 按照《实验动物饲养环境与设施》(GB14295— 2010)中规定的国家标准进行饲养。 本研究符合动物福利标准并通过了普尼测试集团有限公司动物实验伦理委员会的认证, 伦理审查证明编号为PONY-2021-FL-18。

1.1.3 试剂

溴化钾粉末(光谱纯)购自美国PIKE公司, 甲酸和碳酸氢铵购于Sigma公司(LC-MS级, 美国), 甲醇和乙腈购于Fisher公司(LC-MS级, 美国), Milli-Q超纯水, 由Merck Millipore超纯水制备(德国)。

1.2 仪器与设备

傅里叶变换红外光谱仪(INVENIO S, Bruker公司), 高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-TOF 1290-6545, Agilent公司), 真空冷冻干燥机(LGJ-12A, 北京四环启航科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 试验分组与给药方式

小鼠适应性饲养1周后, 随机分成3组, 即正常对照组(CK), 鲜炖燕窝A组(A), 鲜炖燕窝B组(B), 每组6只。 称取2g鲜炖燕窝冻干粉, 用20 mL无菌生理盐水复溶, 配为燕窝溶液。 各组小鼠灌胃给药, 对照组每只灌胃0.2 mL生理盐水, 实验组每只灌胃0.2 mL燕窝溶液, 每日灌胃一次, 其他时间小鼠正常采食饮水, 连续90 d。

1.3.2 小鼠肠道菌群分析

收取第90天小鼠粪便于无菌冻存管, -80 ℃冰箱保存, 随后对其粪便进行16s rRNA高通量测序法对其微生物进行高通量测序文库的构建和Illumina Mi Seq 测序。 DNA 的提取及测序, 通过基因组DNA抽提, PCR扩增, 荧光定量, Illumina PE250测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接, 随后采用Majorbio Cloud平台(https://cloud.majorbio.com/)对样品进行OUT聚类与物种注释, Alpha多样性分析和物种组成分析。

1.3.3 傅里叶变换红外光谱分析鲜炖燕窝

称取2 mg干燥燕窝样品于玛瑙研钵中, 加入200 mg溴化钾粉末快速研磨20~30 s后置于压片模具中进行压片。 将压片放入仪器样品光路中, 开启自动分析系统进行扫描, 光谱扫描范围为4 000~400 cm-1, 分辨率为4 cm-1, 扫描次数为32次。 采用OMNIC软件(Thermo公司)对采集到的透射光谱图先进行吸收图转换, 随后进行自动平滑, 最后对谱图中的特征峰进行积分获得峰面积。

1.3.4 高分辨质谱分析鲜炖燕窝中小分子物质

前处理方法: 参考徐敦明等方法[13], 准确称取100 mg燕窝冻干粉, 加入100 mL 1%甲酸水溶液, 80 ℃水浴40 min, 冷却至室温, 提取液真空冷冻干燥, 提取物粉末保存于-80 ℃。 每种样品3个平行。 上机前, 准确称量10 mg的冻干样品, 用10 mL超纯水复溶, 15 000 r· min-1, 离心10 min, 取上清液置于进样瓶中, 待高分辨质谱信息采集。

色谱条件: 正模式: 色谱柱BEH C8(100 mm× 2.1 mm× 1.7 μ m, Waters, Miford, MA)。 流动相A: 0.1%甲酸水溶液, 流动相B: 0.1%甲酸乙腈溶液。 梯度洗脱: 初始流动相10% B, 保持1 min, 5 min时B升至40%, 17 min时B升至100%, 保持5 min, 随后B相迅速降至10%, 平衡2.9 min; 负模式: 色谱柱 HSS T3(100 mm× 2.1 mm× 1.8 μ m, Waters, Miford, MA)。 流动相A: 6.5 mmol· L-1碳酸氢铵/水溶液, 流动相B: 6.5 mmol· L-1碳酸氢铵甲醇/水溶液(体积比: 95:5, V/V)。 梯度洗脱: 初始流动相0% B保持1 min, 3 min时B升至40%, 16 min时B升至100%, 保持6 min, 随后B相迅速降至0%, 平衡2.9 min。

质谱条件: 离子源参数: 毛细管电压: 3 500 V(正模式)/3 000 V(负模式); 干燥气温度: 325 ℃; 干燥气流速: 7 L· min-1; 雾化气压力: 35 psi; 鞘气温度: 350 ℃; 鞘气流速: 11 L· min-1; 碎裂电压: 120 V。 质量扫描范围m/z 50~1 200, 采集频率 2.0 spectra· s-1。

采用MassHunter软件对采集数据进行分子特征提取, 并用Metlin数据库进行物质定性。

1.4 数据分析

采用OmicShare平台(https://www.omicshare.com/tools)对FTIR光谱获得的特征峰面积和质谱获得的物质响应分别与肠道菌群属水平菌丰度进行组间pearson相关性分析。 相关系数的绝对值在0.3以下表示无相关性, 在0.3~0.5之间为弱相关性, 0.5~0.8之间为强相关性, 0.8~1之间为极强相关性。

2 结果与讨论
2.1 鲜炖燕窝对肠道菌群的物种多样性及组成影响

生态学中通常用Alpha多样性来衡量个体内菌群的多样性, 通过多个指标反映出生境下的物种丰富度(richness)、 多样性(diversity)和均匀度(evenness)等方面。 肠道菌群的物种多样性主要由chao指数、 Shannon指数、 Simpson指数和Sobs指数反映。 如图1(a)所示, 服用鲜炖燕窝的两个组, Chao、 Shannon和Sobs指数均高于对照组(CK), 并且B组的Shannon指数与CK组存在显著差异(p< 0.05)。 而A和B组的Simpson指数与CK组比呈现降低, 而B组显著低于CK组(p< 0.05)。 结果表明服用鲜炖燕窝后小鼠的肠道菌群Alpha多样性有了提高。

图1 鲜炖燕窝对肠道菌群多样性(a)和组成(b)的影响Fig.1 Effects of fresh stewed bird's nest on species Alpha diversity (a) and composition of intestinal microflora (b)

从属水平对小鼠肠道菌群组成进行分析, 如图1(b)所示, 在CK 组、 A组和B组中占比最高的菌有Lactobacillus、 Desulfovibrio、 Lachnospiraceae_NK4A136_group、 Enterorhabdus、 Candidatus_Saccharimonas、 Lachnoclostridium、 Faecalibaculum和Akkermansia。 其中A组和B组与CK组相比, 有益菌Lactobacillus和Lachnospiraceae_NK4A136_group的丰度呈现上升趋势, 有益菌Faecalibaculum和Akkermansia呈现下降趋势; 有害菌Desulfovibrio、 Candidatus_Saccharimonas和Enterorhabdus均呈现下降趋势。 由此可见, 服用鲜炖燕窝后小鼠的肠道菌群结构和丰度会有所改变, 特别是有害菌群会降低, 而部分有益菌会上升。

2.2 鲜炖燕窝的FTIR光谱分析及与肠道菌群的关联

利用FTIR光谱对两个鲜炖燕窝样品进行分析检测, 结果如图2(a)所示。 由图可以看出鲜炖燕窝在1 700~1 200 cm-1波段内有较多的吸收峰, 这与孙素琴等[10]报道的干燕窝结果一致。 其中1 660~1 520 cm-1波段区间的峰体现了芳香环与杂环中C=C骨架、 C— N的伸缩振动以及含氮杂环的N— H弯曲振动, 与燕窝中具有酰胺键的物质有关, 例如蛋白质和氨基酸等。 波段1 440 cm-1下的峰体现了饱和碳氢键C— H的弯曲振动; 1 400~1 300 cm-1之间的吸收峰提示为羧酸盐的对称伸缩振动。

图2 傅里叶变换红外光谱对鲜炖燕窝的扫描光谱(a)和光谱结果与肠道菌群相关性分析(b)Fig.2 FTIR Spectrum of fresh stewed Bird's Nest (a) and its correlation with intestinal microflora (b)

采用OMNIC软件对采集这个波段下的两种鲜炖燕窝特征吸收峰进行积分。 随后用特征峰峰面积与服用对应燕窝样品的小鼠肠道菌群属水平的丰度进行相关性分析, 其结果如图2(b)所示。 全部特征吸收峰与有益Lachnospiraceae_NK4A136_group和Lactobacillus存在正相关, 相关系数分别在0.5~0.8和0.3~0. 5之间; 与有害菌Desulfovibrio和Enterorhabdus存在负相关, 相关系数均在-0.5~-0. 8之间。 由此可见, 一些具有酰胺键、 芳香C=C键、 以及羧酸盐结构的物质与肠道菌群存在一定的关联性, 且这些物质可以降低有害菌丰度, 提高有益菌丰度。

2.3 高分辨质谱对鲜炖燕窝功能因子验证

利用高分辨质谱对鲜炖燕窝中的小分子物质进行定性分析, 主要物质按峰响应强度为酰胺类(Amide)、 脂类(Lipid)、 氨基酸(Amino Acid)、 其他类物质、 多糖(Polysaccharide)和酯类(Ester), 其中在其他类物质中的主要组成物质为唾液酸(N-Acetylneuraminic Acid), 如图3(a)所示。 脂类主要由鞘氨醇(Sphingosine)、 脂肪酸(Fatty Acids)、 脂肪酰(Fatty Acyls)、 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)、 磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine, PC)、 乙醇胺(Ethanolamide)、 固醇类(Cholesterol)、 磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol, PG)、 磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PE)、 甘油二酯(Diglyceride, DG)和磷脂酸(Phosphate, PA)组成。 而脂类的物质的组成先前未在鲜炖燕窝中报道。

图3 鲜炖燕窝中小分子功能物质组成(a)和物质与肠道菌群相关性分析(b)Fig.3 The composition of main small molecular compounds in fresh stewed bird's nest (a) and its correlation with intestinal microflora (b)

对主要物质类别以及脂类中的各类物质与服用对应燕窝样品的小鼠肠道菌群的丰度进行相关性分析, 其结果如图3(b)所示, 加* 表示在p< 0.05水平上存在显著的正/负相关性。 含有酰胺键的氨基酸和羰基的羧酸类物质与有害菌Desulfovibrio和Enterorhabdus呈现正相关, 酸类物质与有益菌Lachnospiraceae_NK4A136_group和Lactobacillus呈现负相关, 与有益菌Faecalibaculum和Akkermansia呈现一定的正相关。 脂类物质与有害菌Desulfovibrio和Enterorhabdus呈现负相关, 与有益菌Lachnospiraceae_NK4A136_group特别是脂类中含有酰胺键的脂肪酰、 和羰基键的磷酸酯类PA、 PC、 PE和PG呈现较高的正相关性。 由此可见鲜炖燕窝中的物质对肠道中的有益菌和有害菌存在着不同的调控作用。

3 结论

小鼠在服用鲜炖燕窝后会对肠道菌群有一定的正向调节作用(有益菌水平上升, 有害菌水平下降)。 本研究采用FTIR技术对鲜炖燕窝进行光谱扫描并用特征峰面积与肠道菌群进行相关性分析, 结果发现一些具有酰胺键、 芳香C=C键以及羧酸盐结构的物质可以降低有害菌丰度, 提高有益菌丰度。 利用高分辨质谱对鲜炖燕窝进行小分子物质分析, 并与肠道菌群进行关联性分析, 发现脂类特别是一些磷酸酯类和脂肪酰类的物质与有益菌呈现正相关, 与有害菌呈现负相关, 而这些物质恰好具有芳香C=C双键, 羧酸键和酰胺键, 与红外结果相对应, 但是仍需要进一步实验验证FTIR特征峰所对应的具体小分子物质, 以及他们对肠道菌群的调控作用。

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