在本地养殖场购买鲜活小龙虾, 在实验室中模拟长途物流运输过程。 将小龙虾分成5批放置于水产塑料箱中, 分别在0, 4, 10, 20和30 ℃下保存。 每隔2 h收集小龙虾样品(优先收集受伤、 死亡、 活性低的个体), 采集小龙虾可食用部分(虾尾)用于后续分析。 整个过程持续48 h, 共采集120份样品, 其中0和4 ℃下分别采集到6个样品, 10和20 ℃下分别采集到48个样品, 30 ℃采集到12个样品。 将采集到的样品组成训练集, 用于建立定量分析模型。 同时, 分别在湖北、 安徽、 江苏和湖南的主要产区订购小龙虾, 通过传统的物流方式运输到实验室, 物流运输时间为1~2 d。 采集样品的可使用部分(虾尾)用于后续分析, 共采集60份样品组成预测集, 用于对定量分析模型进行验证。

使用GB5009.228— 2016中的自动凯氏定氮法对训练集和预测集样品中的挥发性盐基氮进行测定。 实验所用氧化镁、 硼酸、 盐酸、 甲基红指示剂、 溴甲酚绿指示剂和95%乙醇均购置于阿拉丁试剂公司。 表1中列出了检测结果的详细信息。 从表1中可以看到, 训练集样品挥发性盐基氮的浓度分布范围广于预测集样品挥发性盐基氮的浓度分布范围, 两个样品集合中样品挥发性盐基氮最高浓度均超过了鲜、 冻动物性水产卫生标准(GB2733— 2005)中规定的最高浓度[20 mg· (100 g)^-1], 说明在实际运输过程中确实存在新鲜度不合格的风险。 训练集样品中不合格样品数量高达60个, 不合格率为50.0%, 说明高温环境不适合小龙虾保存; 预测集样品不合格率为33.3%, 明显低于训练集。 训练集和预测集样品挥发性盐基氮浓度的平均值与标准偏差均较为接近, 说明经过模拟运输过程产生的训练集样品基本能够覆盖不同运输距离的小龙虾物流运输状况。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 训练集、 预测集样品挥发性盐基氮检测结果 Table 1 Analysis results of TVBN in calibration and prediction set 范围/ [mg· (100 g)-1] 平均值/ [mg· (100 g)-1] 标准偏差/ [mg· (100 g)-1] 不合格 样品数 训练集 5.696~34.306 19.723 6.575 60 预测集 9.042~29.164 18.044 5.226 20

表1 训练集、 预测集样品挥发性盐基氮检测结果 Table 1 Analysis results of TVBN in calibration and prediction set

使用ThermoFisher公司的Antaris Ⅱ 型近红外光谱仪采集小龙虾可食用部分(虾尾)的漫反射光谱。 将小龙虾虾尾平铺置于石英培养皿上, 然后将培养皿放置在近红外光谱仪积分球配件的光斑上, 同时保证虾尾完全遮挡光斑, 采集虾尾的近红外光谱。 光谱波长范围为4 000~10 000 cm^-1, 采集间隔1 cm^-1, 每条光谱包含6 001个数据点。 扫描次数为64, 实验时环境温度为4 ℃, 仪器工作温度25 ℃。 虾尾的光谱图如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 小龙虾虾尾光谱Fig.1 Spectra of crayfish tails

分别使用MSC, SNV, CWT和1st对训练集和预测集样品的光谱进行处理。 其中, CWT处理时选择Haar小波为小波基, 尺度系数为20; 1st处理时尺度系数为19。 使用偏最小二乘法, 利用训练集样品的原始光谱和不同预处理方法处理之后的光谱分别建立挥发性盐基氮定量分析模型, 建模过程中所需的模型因子数通过蒙特卡洛交叉验证法(Monte Carlo cross validation, MCCV)确定^[13]。 为了对不同的模型进行验证, 使用留一交叉验证法(leave one out cross validation, LOOCV)计算训练集样品的挥发性盐基氮浓度, 然后与国标方法的分析结果进行比较, 计算预测浓度的交叉验证均方根误差(root mean square error of cross validation, RMSECV)和相关系数(R_训练), 通过比较不同模型的RMSECV和R_训练值确定最优的光谱预处理方法。 为进一步优化模型, 分别使用蒙特卡洛-无信息变量消除法和随机检测法^[14]对最优光谱预处理方法处理之后的光谱进行波长筛选, 选择重要变量重新建立PLS定量分析模型。 再次使用留一交叉验证法计算训练集样品的挥发性盐基氮浓度, 同时计算预测结果的RMSECV和R_训练值对不同模型进行验证, 确定最优的光谱预处理和波长筛选方法组合。 在确定最优组合之后, 使用预测集光谱和最优化模型计算预测集样品中挥发性盐基氮含量, 并与国标方法的分析结果进行比较, 通过计算预测均方根误差(root mean square error of prediction, RMSEP)和相关系数(R_预测)评价模型实际预测能力。 所有建模及计算过程均在个人电脑上使用Matlab 2020a完成。

有研究表明光谱预处理技术可以有效扣除光谱中的背景信息, 使用经光谱预处理技术处理之后的光谱建模可以有效提高模型的预测能力。 本研究使用四种常见的光谱预处理技术对分别对原始光谱进行处理, 并使用处理之后的光谱建立PLS模型, 使用留一交叉验证法计算训练集样品的挥发性盐基氮浓度, 然后与国标方法的分析结果进行比较, 结果如表2所示。 从表2可以看到, 光谱预处理方法可以显著提高模型的预测能力。 原始光谱建立PLS模型预测结果的RMSECV值为4.138, R_训练仅为0.776, 而原始光谱经过MSC和SNV处理之后, 对应光谱建立PLS模型预测结果的RMSECV值下降到2.363和2.576, R_训练提升到0.933和0.920。 如果使用小波变换和1阶导数对光谱进行处理, 可以得到更好的结果, 对应PLS模型预测结果的RMSECV值可以下降到1.709和1.712, R_训练提升到0.965。 经小波变换和1阶导数处理之后光谱所建立PLS模型预测结果的RMSECV值和R_训练优于经MSC和SNV方法处理之后光谱所建立PLS模型预测结果的RMSECV值和R_训练。 而小波变换和1阶导数两种方法处理光谱之后对于模型预测能力的提升效果接近。 因此, 选择使用小波变换和1阶导数优化之后的光谱进行波长筛选, 做进一步优化。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同光谱预处理方法处理光谱建立 PLS模型的预测结果 Table 2 Prediction results of PLS models optimized by different spectral preprocessing methods 建模光谱 因子数 训练集 预测集 RMSECV R训练 RMSEP R预测 原始光谱 7 4.138 0.776 3.299 0.779 MSC 6 2.363 0.933 3.056 0.907 SNV 6 2.576 0.920 3.434 0.811 WT 5 1.709 0.965 1.944 0.931 1st 5 1.712 0.965 1.984 0.929

表2 不同光谱预处理方法处理光谱建立 PLS模型的预测结果 Table 2 Prediction results of PLS models optimized by different spectral preprocessing methods

为了进一步提高模型的预测能力, 使用MC-UVE和RT算法分别对经过小波变换和1阶导数处理之后的光谱进行波长筛选, 不同光谱的筛选结果如图2(a)和(b)所示。 从图中可以看到, 经过筛选之后的光谱呈现高度集中的趋势, 对于经小波变换处理后的光谱, 从图2(a)中可以看到, 两种波长筛选方法所处理得到的变量较为相似, 大部分变量集中在5 300, 7 200, 7 600~7 700和8 800 cm^-1四个区域, 少部分使用RT算法选择的变量位于4 600 cm^-1。 根据Jerry Workman所著的《Practical Guide to Interpretive Near-Infrared Spectroscopy》, 位于5 300 cm^-1附近的波段属于N— H伸缩振动和弯曲振动的组合频吸收峰; 7 200和7 600~7 700 cm^-1两个波段分别属于伯酰胺和伯芳胺中N— H的2ν 反对称吸收峰; 8 800 cm^-1波段属于N— H溶液中3ν 反对称吸收峰; 4 600 cm^-1波段属于N— H反对称振动和NH₂摇摆振动的组合频吸收峰。 可以看到, 筛选得到的波长均与胺基基团相关, 相较于使用全波长建立的定量模型, 筛选后的波长所建立的模型具有更好的解释能力。 对于经过1阶导数处理之后的光谱, 图2(b)中大部分经两种方法筛选得到的光谱与图2(a)中的区域相似, 不同之处仅在于MC-UVE算法未筛选出波长范围5 300 cm^-1的变量, 而筛选出了波长范围4 600 cm^-1处的变量。

图2

Fig.2

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	图2 不同光谱波长筛选结果 (a): 小波变换; (b): 1阶导数Fig.2 Selected variables by using MC-UVE and RT methods for the spectra preprocessed (a): WT; (b): 1st

使用筛选出的波长重新建立PLS模型, 利用留一交叉验证法计算训练集样品挥发性盐基氮浓度, 同时计算RMSECV值和R_训练对新模型进行验证, 结果列于表3。 比较表2与表3中数据可以看出, 波长筛选可以进一步提升模型的预测能力。 对于经过小波变换处理之后的光谱, 表2中经全波段光谱所建立PLS模型预测结果的RMSECV值为1.709, R_训练为0.965, 当使用MC-UVE算法选择其中318个有效变量重新建立PLS模型之后, 模型预测结果的RMSECV值降低至1.525, R_训练提升至0.973。 如果使用RT算法选择其中235个有效变量建立PLS模型, 则对应模型预测结果的RMSECV值降至1.529, R_训练升至0.972, 提升幅度与经MC-UVE算法选择之后的变量所建立的PLS模型类似。 对于经过1阶导数处理之后的光谱, 两种波长筛选同样获得了提升模型预测能力的效果。 综合来看, 1阶导数和MC-UVE的组合略微优于其他3种组合, 具有相对较低的RMSECV值(1.464)和较高的R_训练值(0.975)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同光谱预处理方法结合波长筛选方法 处理光谱建立PLS模型的预测结果 Table 3 Prediction results of PLS models optimized by spectral preprocessing method coupled with wavelength selection method 方法组合 因子数 选择波 长数量 训练集 预测集 RMSECV R训练 RMSEP R预测 WT+MC-UVE 5 318 1.525 0.973 1.647 0.949 WT+RT 5 235 1.529 0.972 1.649 0.949 1st+MC-UVE 5 269 1.464 0.975 1.626 0.950 1st+RT 5 286 1.702 0.966 1.921 0.930

表3 不同光谱预处理方法结合波长筛选方法 处理光谱建立PLS模型的预测结果 Table 3 Prediction results of PLS models optimized by spectral preprocessing method coupled with wavelength selection method

为了验证不同PLS模型的实际预测效果, 使用PLS模型结合预测集样品光谱计算对应样品中挥发性盐基氮含量, 并与标准方法计算得到的参考值进行比较, 不同模型的计算结果分别列于表2和表3之中。 通过比较可以发现, 表2和表3中RMSECV值和RMSEP值、 R_训练和R_预测的差值较小, 大部分RMSECV值小于对应的RMSEP值, 而R_训练值大于对应R_预测值, 说明模型不存在过拟合的风险。 同时, 与训练集的结果类似, 在对实际样品的预测之中, 光谱预处理和波长筛选技术有效提高了模型的预测能力。 在表2中, 原始光谱所建立的PLS模型预测结果的RMSEP值高达3.299, R_预测仅为0.779; 当使用WT和1st对光谱进行处理之后, 对应光谱所建立PLS模型预测结果的RMSEP值降低至1.944和1.984, R_预测值提升至0.931和0.929。 MSC和SNV两种方法处理光谱同样可以提升模型的预测能力, 但提升幅度不如前两种方法明显。 表3中可见, MC-UVE和RT两种波长筛选技术可以进一步提升模型的预测能力。 与训练集结果类似, 使用MC-UVE方法从经过1st处理之后的光谱中选择得到269个变量, 利用这269个变量建立PLS模型的预测结果可以将RMSEP值进一步降低至1.626, R_预测值提高到0.950, 优于其他组合的预测结果。

为了更直观地说明优化后模型的预测能力, 图3中画出了使用最优方法组合(1st+MC-UVE)处理光谱之后建立PLS模型对训练集和预测集样品中挥发性盐基氮含量的计算结果散点图。 从图3中可以看出, 大部分训练集(深蓝)和预测集(橙)样品沿对角线(黑线)均匀分布, PLS模型计算得到的挥发性盐基氮含量和使用国标方法检测得到的挥发性盐基氮含量之间的差异较小, 且差异与浓度大小无明显的关系。 分别使用训练集样品和预测集样品计算拟合直线(深蓝线和橙线), 可以发现两条直线与对角线的重合度较好, 偏差值较小。 研究结果表明该PLS模型对于实际样品有较好能预测能力, 能够用于相关样品中挥发性盐基氮的快速检测。

图3

Fig.3

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	图3 优化后PLS模型的预测结果Fig.3 Prediction results obtained by the optimized PLS model