实验涉及铜绿假单胞菌三种: 标准株ATCC 27853、 临床分离株38388、 38714(菌株来自于南方医科大学珠江医院)。

实验所用的试剂、 药物及来源如表1所示。 三种抗生素为: 美罗培南(Meropenem, MEM)、 头孢吡肟(Cefepime, FEP)、 头孢他啶(Ceftazidime, CAZ)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实验试剂及药物 Table 1 The list of drugs and reagents 耗材名称 厂家 重水 上海麦克林生物科技有限公司 MUELLER-HINTONBROTH 培养基(细菌MHB培养基) 北京拜尔迪生物技术有限公司 北京拜尔迪生物技术有限公司 美罗培南(95%)100 mg· 瓶-1 中国食品药品检定研究院 头孢他啶(98%)100 mg· 瓶-1 北京索莱宝科技有限公司 头孢吡肟(100%)100 mg· 瓶-1 中国食品药品检定研究院

表1 实验试剂及药物 Table 1 The list of drugs and reagents

实验菌株的培养: 将铜绿假单胞菌用接种环在哥伦比亚血平板中三区划线接种, 37 ℃培养箱过夜培养16~18 h。 取3个单克隆接种于MHB培养基中, 于37 ℃恒温培养箱中培养2~3 h, 备用。

将实验菌株 ATCC 27853 接种于含不同浓度(0%、 30%、 50%)重水的培养基中(0%为对照组), 培养6 h。 在不同时间点(0、 1、 2、 3、 4、 5、 6 h)分别取样进行拉曼技术检测, 以评价该菌株对重水的吸收规律, 探究最优的孵育条件实现快速药敏检测。

取恒温培养箱中培养2~3 h的实验菌株(ATCC 27853)菌液少许, 置于2 mL MHB培养基中, 调整菌密度至0.5麦氏浓度, 稀释10倍, 调至菌的浓度为1× 10⁷ CFU· mL^-1。 实验设置空白对照组: 只含培养基, 以排除培养基污染的可能性; 阴性对照组: 含有培养基+实验菌, 以证明实验菌株可以在培养基中生长良好; 实验组: 含有培养基+实验菌+不同浓度的抗生素。 实验组中, 通过调整培养基和不同抗生素配比, 使美罗培南的浓度最终为2、 1、 0.5、 0.25、 0.12、 0 mg· L^-1; 头孢吡肟的浓度最终为12、 6、 4、 2、 1、 0.1、 0.05和0 mg· L^-1; 头孢他啶的浓度最终为32、 16、 8、 4、 2和0 mg· L^-1。 37 ℃温度下培育24 h, 观察实验结果。

对于分离株38388、 38714分别进行和标准菌株相同的实验方法进行实验。

将实验菌株(ATCC 27853)分别接种至含美罗培南(浓度: 2、 1、 0.5、 0.25、 0.12和0 mg· L^-1), 头孢吡肟(浓度: 12、 6、 4、 2、 1、 0.1、 0.05和0 mg· L^-1)、 头孢他啶(浓度: 32、 16、 8、 4、 2和0 mg· L^-1)的MHB培养基中, 实验体系中具体成分含量如表2所示。 37 ℃培养1 h后取出加30%重水, 加重水后继续37 ℃培养2 h, 取样0.2 μ L测量样品点在疏水石英玻片上, 风干, 做三个生物学重复。 利用临床单细胞拉曼耐药性快检仪(CAST-R, 青岛星赛)采集拉曼光谱。 系统采用波长为532 nm的Nd:YAG 激光作为激发光源。 激光经过100倍物镜(N.A.=0.95, Olympus, Japan)聚焦后进行单细胞拉曼光谱激发, 产生的拉曼信号通过物镜进入光谱仪。 信号经过600 grooves· mm^-1光栅分光后, 进入EMCCD探测器(Newton 970, Andor, UK), 从而获得单细胞的拉曼光谱信号。 系统同时具有显微成像功能, 可实现单个细胞的精准定位。 单细胞拉曼实验参数: 激光功率为60 mW(物镜之前), 采集时间为1.5 s, 拉曼光谱范围 500~3 200 cm^-1, 在不同视野中随机采集50~75个单细胞的拉曼图谱。 获得的单细胞光谱经过减背景、 减基线、 归一化和最大值标准化处理后计算出Δ CDR值[培养时间与0 h的CDR的差值, Δ CDR=(CDR_{2 h}-CDR_{0 h})/(CD + CH)]^[18]。 整个单细胞重水拉曼药敏实验时间约为3~4 h, 包括重水孵育(2 h), 菌株手动清洗和氟化钙玻片制片(0.5 h)以及后续的单细胞拉曼光谱采集和数据处理(约1 h)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 药敏实验中培养基的具体成分用量 Table 2 The dosage of the medium in ASTs 名称 含量 2× MHB/μ L 500 500 500 500 500 500 Bacteria/μ L 100 100 100 100 100 100 ddH2O/μ L 100 50 50 50 50 50 Antibiotics/μ L 0 50 50 50 50 50 D2O/μ L 300 300 300 300 300 300

表2 药敏实验中培养基的具体成分用量 Table 2 The dosage of the medium in ASTs

对于分离株38388、 38714分别进行和标准菌株相同的实验方法进行实验。

将铜绿假单胞菌株ATCC 27853在不同浓度的重水环境下培养6 h, 在不同时间点进行拉曼检测, 获得的不同浓度重水环境下铜绿假单胞菌拉曼光谱的CDR 随时间的变化结果(图1)。 可以发现, 与对照组相比, 在30%和50% D₂O环境中, 从1 h开始就可以看到CDR值有明显的升高, 而且从3 h开始CDR 值逐渐趋于平稳, 说明铜绿假单胞菌生长过程中可以很容易吸收重水。 同时由30%重水环境下铜绿假单胞菌ATCC 27853随时间变化的单细胞拉曼谱图(图2)和图1(b)中的差异性分析结果可以看出, 从1 h时出现重水峰(C-D峰, 2 040~2 300 cm^-1), 在2 h时C-D峰强度明显增加, 并且重水孵育2与1 h的差异性明显高于其他时间。 因此本研究选择不影响实验菌株生长又能产生明显C-D拉曼峰的重水浓度, 即30%重水作为后续实验的默认重水浓度, 后续药物敏感实验中采用2 h进行重水孵育。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 不同浓度重水环境下铜绿假单胞菌拉曼光谱的CDR随时间的变化 (a): 0%; (b): 30%; (c): 50%Fig.1 Temporal change of CDR curve for P. aeruginosa under different D2O concentration (a): 0%; (b): 30%; (c): 50%

图2

Fig.2

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	图2 30%重水环境下铜绿假单胞菌ATCC 27853随时间变化的单细胞拉曼光谱 2.2 不同药物对铜绿假单胞菌的MIC测定结果Fig.2 Temporal change of single cell Raman spectrum for P. aeruginosa ATCC 27853 under 30% D2O

采用测量最低抑制浓度的金标准方法(肉汤稀释法)^[4], 测定不同铜绿假单胞菌菌株对美罗培南、 头孢吡肟和头孢他啶这三种药物的敏感性, 实验获得的MIC如表3所示。 最低抑菌浓度实验结果的MIC值与M100抗微生物药物敏感性试验标准相比较, 可判断菌株对该抗生素的药物敏感性^[17]。 通过表3和表4比较发现, 铜绿假单胞菌标准株ATCC 27853、 分离株38714对美罗培南、 头孢吡肟、 头孢他啶均敏感; 分离株38388对美罗培南耐药, 对头孢吡肟、 头孢他啶敏感。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 试验获得的铜绿假单胞菌对抗生素的MIC折点 Table 3 The MIC breakpoints of antibiotics in P. aeruginosa Strain MIC Breakpoints/(mg· L-1) MEM FEP CAZ ATCC 27853 0.5 1 8 38388 32 4 8 38714 1 2 2

表3 试验获得的铜绿假单胞菌对抗生素的MIC折点 Table 3 The MIC breakpoints of antibiotics in P. aeruginosa

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 M100药敏标准中铜绿假单胞菌的MIC折点及药敏判定标准[19] Table 4 The interpretive categories and MIC Breakpoints for P. aeruginosa in M100[19] Antibiotics Interpretive categories and MIC breakpoints/(mg· L-1) S I R MEM ≤ 4 8 ≥ 16 FEP ≤ 8 16 ≥ 32 CAZ ≤ 8 16 ≥ 32

表4 M100药敏标准中铜绿假单胞菌的MIC折点及药敏判定标准[19] Table 4 The interpretive categories and MIC Breakpoints for P. aeruginosa in M100[19]

通过拉曼光谱技术检测单个病原菌细胞吸收重水之后拉曼光谱的变化, 能够检测细胞在抗生素处理下的代谢活性^[10]。 拉曼光谱检测技术相对于采用肉眼观察的最低抑菌浓度实验更加精确, 且能从微观上反映不同浓度抗生素对菌株的抑制效果。 为了评估重水拉曼光谱技术用于铜绿假单胞菌药敏实验的可行性, 我们进行铜绿假单胞菌与美罗培南、 头孢吡肟、 头孢他啶三种抗生素药物作用下的药敏实验, 测定不同药物浓度下单细胞的拉曼光谱, 获得Δ CDR随药物浓度的变化曲线(图3), 其中红线是通过Loess回归生成的^[19], 代表随着药物浓度的Δ CDR变化趋势。 从图中可以发现, 随着抗生素浓度的增加Δ CDR的值逐渐降低, 当抗生素达到一定浓度后, Δ CDR的值几乎不再变化, 趋于平稳。 当Δ CDR< 0且标准差< 0.005时, 可认为此浓度下的菌已经全部被抑制杀死不再进行生长代谢, 此标准下的抗生素浓度即为基于代谢的最低抑菌浓度(MIC-MA)^[10]。 基于此获得重水拉曼技术测得的最低抑制浓度结果(表5), 与肉汤稀释法获得的MIC(表3)对比发现, 铜绿假单胞菌采用两种方法获得的最低抑制浓度不大于2倍, 且, MIC-MA对应的药物浓度等于或者大于MIC, 表明微生物的生长受到抑制时, 细胞代谢活性仍可以得到保留。

图3

Fig.3

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	图3 铜绿假单胞菌在美罗培南、 头孢吡肟、 头孢他啶环境下随药物浓度的Δ CDR的变化曲线 (a): ATCC 27853; (b): 38388; (c): 38714Fig.3 Drug concentration-dependent Δ CDR of P. aeruginosa (a): ATCC 27853; (b): 38388; (c): 38714

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 重水拉曼技术测得的铜绿假单胞菌的最低抑制浓度 Table 5 The MIC-MA breakpoints of antibiotics in P. aeruginosa using CAST-R Strain MIC-MA Breakpoints/(mg· L-1) MEM FEP CAZ ATCC 27853 1 2 16 38388 64 16 8 38714 1 4 4

表5 重水拉曼技术测得的铜绿假单胞菌的最低抑制浓度 Table 5 The MIC-MA breakpoints of antibiotics in P. aeruginosa using CAST-R

最终对比CLSI药敏判定标准(表4), 获得3株铜绿假单胞菌肉汤稀释法和重水拉曼方法的药敏分类对比结果(图4)。 结果发现采用重水拉曼方法测得的药敏鉴定结果与肉汤稀释法高度一致, 分类一致率达到100%(9/9耐药与非耐药判别)。 同时可以发现, 实验中几乎所有的MIC-MA值都与肉汤稀释法获得的MIC相同或在± 1倍稀释范围内(图4 中红色和绿色阴影区域), 只有菌株ATCC 27853对头孢吡肟为2倍稀释差, 基于前期研究MIC-MA与MIC值相同或者在± 1倍稀释范围内认为结果一致^[17], 获得MIC-MA与MIC的基本一致率为88.9%(8/9)。 因此, 此结果证明MIC-MA可作为铜绿假单胞菌药敏鉴定结果的有效参数。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 不同抗生素作用下三株铜绿假单胞菌的MIC与MIC-MA的结果对比 (a): 美罗培南; (b): 头孢吡肟; (c): 头孢他啶Fig.4 Comparison of MIC and MIC-MA of the P. aeruginosa with different Antibiotics (a): MEM; (b): FEP; (c): CAZ

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 肉汤稀释法和重水拉曼方法的药敏鉴定对比结果 Table 6 Comparative results of ASTs by BMD and CAST-R ATCC 27853 38388 38714 BMD CAST-R BMD CAST-R BMD CAST-R MEM S R S FEP S S I S CAZ S S S

表6 肉汤稀释法和重水拉曼方法的药敏鉴定对比结果 Table 6 Comparative results of ASTs by BMD and CAST-R