E-lite便携式X射线荧光光谱仪(苏州佳谱科技有限公司, 中国), 激发源为X射线管, 靶材为Cr, 工作电压25 kV, 工作电流0.4 mA, 优化后测试时间为300 s。

ICAP PRO X DUO电感耦合等离子体发射光谱仪(Thermo Fisher公司, 美国); ICAP RQ电感耦合等离子体质谱仪(Thermo Fisher公司, 美国)。

铝标准溶液(国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院, 批号: 22033135, 浓度: 1 000 μ g· mL^-1; 介质: 10%HNO₃), 钪标准溶液(国家钢铁材料测试中心, 批号: 22070435, 浓度: 1 000 μ g· mL^-1; 介质: 10%HNO₃), 硝酸(优级纯, 广州化学试剂厂); 磷酸(分析纯, 广州化学试剂厂); 盐酸(分析纯, 广州化学试剂厂); 纯水(Milli-Q 制备); 聚丙烯薄膜(4 μ m、 12 μ m, 美国Chemplex公司); 疫苗样品来源于国内5家疫苗生产企业, 包括17批次新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)、 14批次重组戊型肝炎疫苗(大肠埃希菌)、 12批次双价人乳头瘤病毒疫苗(大肠杆菌)、 16批次重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)、 3批次吸附无细胞百白破联合疫苗、 8批次流感病毒裂解疫苗。

1.3.1 标准工作溶液的配制

分别精密量取1 000 μ g· mL^-1铝标准溶液0.25、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0 mL于5 mL容量瓶中, 用阴性疫苗基质(流感病毒裂解疫苗)溶液稀释并定容至刻度, 配制成含铝浓度为50、 100、 200、 300和400 μ g· mL^-1的系列标准工作溶液。

1.3.2 基本参数法及工作曲线

按照MED-XRF设定的参数, 对标准工作溶液进行测定。 根据基本参数法对光管的原始谱、 探测器的探测效率进行理论数据拟合(包括元素拟合、 荧光产额、 康普顿和瑞利散射、 逃逸峰、 叠加峰、 质量吸收系数等参数), 再通过少量的标准工作溶液对理论参数进行迭代处理, 直到测量含量和标准含量线性回归方程接近y=x。 绘制标准曲线, 并将标准曲线内置到XRF测量软件中, 用于实际样品检测。

1.3.3 样品制备

取预混的疫苗样品1.0 mL于离心管中, 加入1.0 mL 30%硝酸溶液, 涡旋混匀, 于40 ℃水浴25 min, 取出冷却至室温, 作为待测样品溶液。 待测样品溶液从套装样品杯硅胶阀处装入样品杯, 放入仪器测量, 获得X射线荧光强度, 通过内置的标准曲线计算得到样品中铝含量。

1.3.4 ICP-OES法与ICP-MS法

精密量取铝标准溶液适量, 用0.1 mol· L^-1盐酸溶液逐级稀释配制为1~20 μ g· mL^-1浓度的系列标准溶液。 精密量取0.2 mL疫苗试样置于塑料离心管中, 加入0.2 mL 5 mol· L^-1盐酸溶液, 室温下放置0.5 h, 待试样完全溶解至溶液澄清后, 加水至10 mL, 即得待测样品溶液。 系列标准溶液和待测样品溶液经ICP-OES测定, 通过标准曲线计算样品中铝含量。

精密量取铝标准溶液适量, 用5%硝酸溶液逐级稀释配制为2.5~80 ng· mL^-1浓度的系列标准溶液。 用5%硝酸溶液配制的50 ng· mL^-1钪单元素标准溶液, 作为内标溶液。 精密量取0.05 mL疫苗试样置于塑料离心管中, 加入5 mL硝酸, 涡旋混匀, 室温下放置0.5 h, 再取0.05 mL上述溶液用5%硝酸稀释至10 mL, 即得待测样品溶液。 系列标准溶液和待测样品溶液经ICP-MS采用内标法测定, 通过标准曲线计算样品中铝含量。

靶材的原子序数越大, X光管压越高, 连续谱强度越大。 因此, 对于轻元素的分析, 通常使用原子序数较小的铬靶。 疫苗样品为液体基质, 由轻基体组成, 辐射的穿透深度可能超过样品的厚度。 为满足液体样品测量的无限厚要求, 一般选择元素的低能辐射作为分析线, 并在低电压(25 kV)下操作^[14]。 铝属于第三周期元素, 光谱简单, 谱线数量少, 选取强度较高的Kα 1特征谱线, 其光子能量为1.49keV^[14]。 空白样品和样品加标溶液XRF典型图谱见图1。

图1

Fig.1

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	图1 空白样品、 标准工作溶液X射线荧光光谱图Fig.1 X-ray fluorescence spectrum of blank matrix and standard samples

2.2.1 测试时间的选择

由于MED-XRF的测量时间与样品的测试计数率之间并非存在线性关系, 不同的测试时间对结果的稳定性和准确性有较显著的影响。 本研究考察了测试时间为30、 60、 100、 200、 300和600 s时, 浓度为250 μ g· mL^-1的铝标准溶液6次平行检测结果的重复性, 结果见图2。 结果表明, 当测试时间为30~100 s时, 测量结果RSD较大, 重复性较差; 测试时间大于100 s后, 测量结果与实际理论值接近, 各次测量结果分布集中, 重现性较好, 且200、 300和600 s的测定结果无显著差异。 兼顾检验准确度和检验效率, 本研究的测试时间为300 s。

图2

Fig.2

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	图2 不同测试时间测定结果比较图Fig.2 Comparison of determination results of various measurement times

2.2.2 封底薄膜厚度

铝为低原子序数元素, 其K系平均荧光产额只有0.026, 荧光强度低^[14], 薄膜的厚度直接影响辐射的透过率。 本研究以浓度为400 μ g· mL^-1的标准溶液, 比较了不同膜厚的聚丙烯膜对铝特征荧光谱线强度的影响。 如图3所示, 厚度为12 μ m的薄膜对铝元素分析线的信号强度有显著影响, 测量重复性较差。 为提高分析线的强度, 兼顾防漏能力, 本研究以4 μ m聚丙烯膜为封底材料。

图3

Fig.3

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	图3 不同封底膜厚度测定结果比较图Fig.3 Comparison of determination results of various film thicknesses

微-痕量轻元素的定量分析是EDXRF分析中最薄弱的方面, 受基体的影响显著^[15]。 本研究以基本参数法校正基体吸收-增强效应, 主要包括元素拟合、 荧光产额、 背景拟合、 逃逸峰、 叠加峰、 质量吸收系数等参数。 尽管本研究采用的单色聚焦X射线荧光光谱通过DCC分光、 聚焦后大幅降低了散射背景, 但仍不能获得一条固定波长的谱线, 而是具有一定光谱宽度的谱带; 另外, 样品自身的散射也不容忽视, 因此背景拟合至关重要。 本研究采用康普顿散射和瑞利散射两种散射模型进行的拟合, 准确扣除元素峰的背景信号, 提高信噪比。

本文以重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)(rHB Vac. (S.c.))、 重组戊型肝炎疫苗(大肠埃希菌)(rHE Vac. (E. coli))、 双价人乳头瘤病毒疫苗(大肠杆菌)(2vHPV Vac. (E. coli))、 新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)(ICV (Vero))、 吸附无细胞百白破联合疫苗(DTaP)、 流感病毒裂解疫苗(IIV)为典型代表评价基本参数法对不同疫苗基质的校正效果。 疫苗样品按“ 1.3.3” 处理, 通过稀释或加标配制成铝浓度为0、 50、 100、 200、 300和400 μ g· mL^-1的系列标准工作溶液。 铝的理论数据与实际数据的比较结果见图4和表1。 从结果可知, 当铝含量在0~400 μ g· mL^-1范围内, 不同疫苗基质中铝含量的实际值和测量值拟合方程线性关系良好, 相关系数r的范围为0.998 2~0.999 9, 回归方程的斜率范围为0.990 5~1.012 4, 数据点基本集中在y=x线上, 不同疫苗基质的均方根误差均小于7 μ g· mL^-1, 各测量值的相对误差均小于6%, 测量准确度较高, 说明根据基本参数法拟合的定量模型能有效校正基体吸收-增强效应, 在不同类型的疫苗样品中具有较好的通用性。

图4

Fig.4

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	图4 不同疫苗基质中铝的标准值与回归计算值相关曲线Fig.4 Calculated value versus standard value of Aluminum in different vaccines

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同疫苗基质中铝含量的测量准确度 Table 1 The goodness of fit of measurement results of the Aluminum content in different vaccines 基质名称 辅料 回归方程 相关系数r 重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母) 等渗溶液(氯化钠) y=1.012 4x+3.390 2 0.998 9 重组戊型肝炎疫苗(大肠埃希菌) 防腐剂(硫柳汞)、 缓冲盐溶液(磷酸盐) y=1.005 4x+1.059 7 0.999 3 双价人乳头瘤病毒疫苗(大肠杆菌) 助溶剂(聚山梨酯80)、 缓冲盐溶液(磷酸盐) y=0.992 1x+1.825 3 0.999 9 新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞) 缓冲盐溶液(磷酸盐) y=0.990 5x-2.273 0 0.999 8 吸附无细胞百白破联合疫苗 防腐剂(硫柳汞)、 残留溶剂(甲醛、 戊二醛)、 缓冲盐溶液(磷酸盐) y=0.991 9x+1.837 1 0.998 6 流感病毒裂解疫苗 缓冲盐溶液(磷酸盐) y=1.008 8x-1.771 7 0.998 2

表1 不同疫苗基质中铝含量的测量准确度 Table 1 The goodness of fit of measurement results of the Aluminum content in different vaccines

2.4.1 预处理试剂的选择

疫苗制品常为非均匀态的悬浊液, 其中铝佐剂通常与抗原吸附结合, 主要通过静电力、 疏水作用及配基交换等方式来实现, 在疫苗中以沉淀形式存在^[16]。 对于非均相样品, 其颗粒度及化学组成的不均匀都会发生偏析, 导致样品发射的特征X射线强度的严重偏差, 直接影响分析线的测量强度与浓度的定量关系, 用数学校正的方法难以消除这种影响^[14], 有必要对样品进行适当的处理。

本文比较了以水、 硝酸、 磷酸、 盐酸对样品进行预处理的效果。 水作为预处理试剂时, 只对疫苗样品起分散、 稀释的作用, 并未破坏铝佐剂与抗原的吸附, 样品处理液仍呈悬浊态, 导致测量结果显著偏低。 磷酸为《中国药典》三部中铝含量测定选用的预处理试剂, 对于不同吸附类型的疫苗, 磷酸处理方法在酸的浓度、 预处理时间、 预处理温度等方面有较大差异, 且个别品种需要通过煮沸来实现对铝的解吸附, 实验条件较为苛刻。 盐酸作为预处理试剂, 在ICP-OES检测中较为常用, 但在MED-XRF测试中发现, 经盐酸溶液预处理的样品铝含量偏高, 这主要是因为与水和硝酸相比, 盐酸对初级辐射的散射强度差异非常显著^[14], 导致分析背景远超数学校正的范围。 采用硝酸作为预处理试剂时, 背景干扰小, 在40 ℃预处理25 min后, 即可实现样品中铝佐剂与抗原充分解离, 样品处理液均匀澄清, 且试验条件温和, 因此本文以硝酸作为预处理试剂。

2.4.2 预处理条件的优化

对疫苗样品的预处理, 硝酸浓度、 反应时间和反应温度是影响试验结果的因素, 可通过正交试验法得到最优的试验结果。 为给正交试验提供一个合理的数据范围, 本文对主要因素硝酸浓度进行单因素试验, 比较了硝酸浓度为2%、 5%、 10%、 20%、 30%、 50%、 80%、 100%对实际样品(重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母), 参考值为0.45 mg· mL^-1)测定的影响。 由表2可知, 随硝酸浓度增大, 检测结果及RSD均呈下降趋势, 当硝酸浓度为20%、 30%和50%时, 相对误差绝对值均小于5%, RSD均不大于2%, 测量准确度和精密度较好。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 硝酸浓度对铝含量测定的影响 Table 2 The influence of HNO3 concentration on the quantitative determination of Aluminum 硝酸浓度 /% 铝含量 /(mg· mL-1) 相对误差 /% RSD (n=6, %) 2 0.49 8.0 9.9 5 0.49 8.3 9.3 10 0.49 8.1 6.0 20 0.46 1.6 2.0 30 0.44 -1.3 1.9 50 0.43 -4.5 0.8 80 0.41 -9.1 1.6 100 0.42 -7.7 0.6

表2 硝酸浓度对铝含量测定的影响 Table 2 The influence of HNO3 concentration on the quantitative determination of Aluminum

在单因素实验的基础上, 以硝酸浓度、 反应时间和反应温度为因素, 设计了3因素3水平正交试验L9(3⁴), 以准确度为评价指标, 优化预处理条件。 试验因素、 水平和结果见表3。 通过直观分析结果可以看出, 硝酸浓度对结果的影响最大, 硝酸浓度为30%, 40 ℃处理25 min是较好的预处理条件。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 正交实验方案及直观分析表 Table 3 Orthogonal test plan and visual analysis 硝酸酸度 /% 反应时间 /min 反应温度 /℃ 准确度 /% 1 20 5 30 100.8 2 20 15 40 102.9 3 20 25 50 109.7 4 30 5 40 98.4 5 30 15 50 93.2 6 30 25 30 96.9 7 50 5 50 89.0 8 50 15 30 91.4 9 50 25 40 92.7 k1 104.467 96.067 96.367 k2 96.167 95.833 98.000 k3 91.033 99.767 97.300 R 13.343 3.934 1.633

表3 正交实验方案及直观分析表 Table 3 Orthogonal test plan and visual analysis

2.5.1 检测限和定量限

XRF测量值属于泊松分布, 检出限计算方法和分析领域中常用的计算方法不同。 一般来说, 常用的检出限计算方法有两种, 分别为峰背景计数法和重复测定法^[17]。 对于轻元素, 峰背景计数法受样品基体与谱线重叠干扰等影响, 计算的方法检出限和实际检出限有效大差别^[18]。 本文采用重复测定法确定方法检测限和定量限, 即在相同实验条件下重复测定低含量样品溶液11次, 以测定值的3倍标准偏差作为检测限, 10倍标准偏差作为定量限, 结果见表4。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 方法检测限、 定量限、 回收率和重复性 Table 4 Limit of detection, limit of quantitation, recoveries and precisions 仪器检测限 /(mg· mL-1) 仪器定量限 /(mg· mL-1) 方法检测限 /(mg· mL-1) 方法定量限 /(mg· mL-1) 平均回收率(%)与RSD(n=6) 加标水平/(mg· mL-1) 0.3 0.5 0.7 0.014 0.045 0.027 0.090 98.8(6.7) 97.6(3.8) 102(2.4)

表4 方法检测限、 定量限、 回收率和重复性 Table 4 Limit of detection, limit of quantitation, recoveries and precisions

2.5.2 回收率和重复性

对不含铝佐剂的疫苗样品在0.3、 0.5和0.7 mg· mL^-1三个水平进行加标回收试验, 各水平制样6份, 结果见表4。 结果表明, 在加标水平内, 平均回收率为97.6%~102%, 精密度RSD(n=6)为2.4%~6.7%, 回收率和重复性良好。

2.5.3 日间精密度

MED-XRF定量采用无标物分析法, 仪器测量的稳定性对结果非常重要。 本文在90天内对实际样品(重组戊型肝炎疫苗(大肠埃希菌), 参考值为0.54 mg· mL^-1)进行多次测量, 结果见表5。 结果表明, 90天内对同一样品多次测量的变异系数为4.7%, 数据集中, 方法稳定可靠。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 方法日间精密度 Table 5 Intra-day precision of this method 序号 测试结果/(mg· mL-1) 变异系数 CV/% 第1天 第2天 第3天 第30天 第60天 第90天 平均值 1 0.50 0.50 0.50 0.54 0.56 0.52 0.50 4.7 2 0.52 0.47 0.50 0.47 0.48 0.51 3 0.52 0.50 0.51 0.53 0.48 0.50 4 0.53 0.48 0.51 0.52 0.49 0.51 5 0.47 0.49 0.49 0.46 0.48 0.50 6 0.48 0.47 0.47 0.48 0.49 0.44 平均值 0.50 0.49 0.50 0.50 0.50 0.50 / / RSD/% 5.2 2.7 3.3 6.6 6.6 6.0 / /

表5 方法日间精密度 Table 5 Intra-day precision of this method

对ICP-OES、 ICP-MS两法的测定结果进行显著性检验(t检验法), 取两者结果不存在显著性差异的样品(t_{0.1, 4}< 2.13)为代表, 两法结果的平均值作为参考值, 考察MED-XRF法的准确度。 结果表明, MED-XRF法对6个品种70批疫苗的测定结果与参考值具有较好的一致性, 相对误差绝对值均不超过10%, 上四分位数、 中位数和下四分位数分别为2.3%、 4.8%和7.6%, 满足不同疫苗中铝含量快速定量分析的要求。