实验用仪器及生产厂家见表2, 其所对应的部分实物见图5。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 实验仪器 Table 2 Experimental instruments 仪器名称 厂家 二两密封性高速中药粉碎机(LG-02) 瑞安市百信制药有限公司 天然玛瑙研钵(HW-6) 上海力辰科技仪器有限公司 天平(XP-05) 上海舜宇恒平仪器公司 粉末压片机(YP-15) 天津市托普科技有限公司 傅里叶变换红外色谱仪(TJ270-30A) 美国PerkinElmer

表2 实验仪器 Table 2 Experimental instruments

图5

Fig.5

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	图5 实验仪器 (a): 二两密封性高速中药粉碎机; (b): 天然玛瑙研钵; (c): 分析天平; (d): 粉末压片机Fig.5 Experimental instruments (a): Dual-jar sealed high-speed Chinese herbal grinder; (b): Natural agate mortar; (c): Analytical balance; (d): Powder tablet press

首先对灵芝样品进行编号, 按顺序进行清洗, 清洗过后放入50 ℃真空干燥箱干燥6 h, 再通过中药粉碎机将样品粉碎, 取3 g用于建立灵芝的近红外图谱库。 根据灵芝的不同来源与性质, 粉碎可采用单独粉碎、 混合粉碎、 干/湿法粉碎等方法。 本实验采用的是单独粉碎法, 以确保实验的结果准确性。 在样品粉碎前先对样品进行清洗、 烘干、 切碎成小块, 在粉碎过程中要注意不能掺杂金属物, 否则容易起火。 使用分析天平过程中, 为了保证称量结果的准确, 对使用环境有严格要求, 远离通风口, 周围没有高压线变压器, 同时保证天平处于水平位置。 粉末压片机工作流程: 填充— 计量— 压片— 成品收集, 将灵芝粉末填入模孔, 保证每个模孔中填充的灵芝重量一致, 通过上下压轮将灵芝压成片, 最后将压成片的灵芝收集。 参考已有的相关灵芝文献^{[10, 11]}, 确定灵芝的采集参数, 使用傅里叶红外色谱仪采用高密度接触式反射探头直接照射样品, 扫描波长范围为350~2 500 nm, 分辨率为3 cm^-1, 扫描64次, 每个样品进行3次测量, 并最后取平均光谱。

近红外光谱广泛应用于化学分析^{[12, 13]}、 药品检测^[14]等多个领域。 其原理是: 当近红外光照射到样品上时, 部分光被样品吸收, 部分光被散射, 根据吸收光谱的特征, 可以推断出样品的化学成分, 详见图6。

图6

Fig.6

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	图6 近红外光谱基本原理图Fig.6 Basic principle of near-infrared spectroscopy

近红外光谱数据分析方法常用于鉴定和解析样品的特性。 在灵芝的产地鉴别方面, 它提供了一种高效的途径。 其近红外光谱分析过程见图7。

图7

Fig.7

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	图7 近红外光谱分析过程Fig.7 Process of near-infrared spectroscopy analysis

1.3.1 光谱预处理方法的选择

由于实验所得光谱数据容易受到噪声、 背景、 散光等^{[15, 16, 17]}干扰, 会导致实验误差增加或分析效果不佳, 影响数据质量与结果的准确性, 因此要对实验数据进行预处理, 方法详见表3。 预处理的步骤是由基线校正、 散射校正、 平滑处理和尺度缩放^{[18, 19, 20]}四部分完成, 处理后将有助于提高光谱数据的质量, 使得后续的分析工作更加准确和有效。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 光谱预处理方法 Table 3 Spectral preprocessing methods 基线校正 散射校正 平滑处理 尺度缩放 一阶导 多元散射校正 Savitzky-Golay平滑 中心化 二阶导 标准正态变量 尺度化 连续小波变换 最大最小归一化

表3 光谱预处理方法 Table 3 Spectral preprocessing methods

基线校正主要包括一、 二阶导数以及连续小波变换(continuous wavelet transform, CWT)。 基线校正可以有效地控制仪器背景与基线漂移带来的影响, 一阶导与二阶导可以消除曲线背景, 使光谱的分辨率更高; CWT可以将曲线背景矫正同时还能去除噪声, 使光谱图像更光滑。 一阶导和二阶导对数据的平滑和去除噪声有一定的鲁棒性, 并且对数据的平稳性要求相对较低。 CWT对数据的噪声和平稳性要求较高, 如果数据存在噪声或不平稳性, 连续小波变换可能会产生不准确或混乱的结果, 因此基线校正采用一阶导与二阶导方法。 散射校正包括多元散射校正(multivariate scatter correction, MSC)、 标准正态变量(standard normal variate, SNV), 这两种方法主要是消除实验样品因其大小, 形状, 分布不均等因素对模型的影响, 其中MSC是对所有样本进行数据处理, 将得到的数据平均值作为标准进行比较, SNV是对一组数据进行数据分析, 通过标准差对所有光谱数据进行纠正, 两种都是光谱数据预处理中消除散射常用的方法, 可以通过实际效果选择更合适的消除散射方法。 平滑处理一般采用S-G平滑(多项式平滑法), 在光谱预处理步骤中, 所有平滑处理方法都是为了消除光谱图中的随机噪声, 我们可以通过周期性改变原始窗口数量对数据拟合以提高样本的信噪比。 尺度缩放可以消除数据尺度差距过大带来的影响, 最大最小归一化是把每组光谱中去掉最小值后与最大最小值的差值之比。 实验所得的灵芝近红外光谱数据有明确边界和范围, 采用最大最小归一化方法更合适, 且最大最小归一化适用于大规模数据集。

1.3.2 光谱预处理结果分析

将各样本的吸光度数据导入光谱分析软件, 并对原始数据进行S-G平滑处理, 绘制的波长-吸光度百分比图, 详见图8。

图8

Fig.8

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	图8 原始图谱(a); 平滑处理图(b)Fig.8 Original spectra (a) and Smoothed spectra (b)

在光谱采集过程中, 数据质量受到多种因素的影响, 包括随机噪声^[21]和基线漂移^[22], 这些因素可能会降低后续分析模型的准确性。 为了改善数据质量, 我们对原始光谱数据进行了平滑处理, 如图8(b)所示。 通过平滑处理, 灵芝在440、 1 320、 1 447、 1 921和2 236 nm处的吸收峰变得明显。 特别在520~1 380 nm波长范围内, 野生金边灵芝的菌柄和菌盖吸光度高于人工金边灵芝, 这可能与其独特的生长环境和地理位置有关, 为区分野生与人工金边灵芝提供了科学依据。

为了进一步消除样品间由于光程长度或样品浓度差异引起的光谱强度变化, 我们对灵芝样本数据进行了最大最小归一化处理, 将所有光谱数据缩放到0到1的范围内, 如图9所示。 归一化处理有助于在同一尺度上比较不同样品的光谱, 图9中经过处理的数据在1 450~2 500 nm波长范围内样品被明显分离, 尤其是在1 670、 1 863和2 019 nm处的峰值变得更加明显。 人工金边灵芝在该波长范围内的吸光度远高于其他灵芝样品, 表明这些波长范围可以作为人工金边灵芝与其他灵芝鉴别的特征波段。

图9

Fig.9

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	图9 灵芝最大最小归一化处理后的光谱Fig.9 Normalization of ganoderma lucidum spectra(maximum-minimum method)

为了深入探究光谱数据中的细微变化和吸收峰的精确位置, 对平滑处理后的数据进行了一阶导数^[23]计算, 结果如图10所示。 一阶导数处理显著增强了光谱中的吸收峰差异, 使得原本不明显的光谱特征得到突出, 从而更清晰地识别和解析重叠峰。 图10显示, 野生金边灵芝在360、 454、 603、 1 801和2 064 nm处的吸收峰相较于其他灵芝更为突出, 这不仅验证了平滑处理后的结论, 而且进一步验证了野生金边灵芝中的相关药用成分要高于其他灵芝。

图10

Fig.10

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	图10 灵芝的一阶导数光谱图Fig.10 First derivative spectra of ganoderma lucidum samples

考虑到灵芝化学结构的复杂性和成分的多样性, 常常出现多种成分吸收峰的叠加现象。 因此, 在一阶导数的基础上, 我们进一步进行了二阶导数计算, 以使峰值更加突出和清晰, 如图11所示。 二阶导数处理后, 2 450 nm波长处的特征峰变得更加明显, 进一步突出了野生金边灵芝与其他灵芝的差异性。 然而, 在400和1 800 nm处的特征峰形状相似, 二阶导数处理未能提供足够的信息来区分它们, 这可能是由于原始数据信噪比较低, 二阶导数处理放大了噪声, 掩盖了光谱的真实特征。

图11

Fig.11

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	图11 灵芝的二阶导数光谱图Fig.11 Second derivative spectra of ganoderma lucidum samples

灵芝的红外光谱原始数据可能受到颗粒大小、 密度和生长环境等多种因素的影响, 导致光谱中的散射效应和基线漂移。 这一现象在何晋浙^[24]等的研究中得到了验证。 他们对不同地区的灵芝的红外光谱数据进行了分析, 发现不同地区的灵芝在光谱峰值有明显的差异。 为了提高光谱数据的信噪比并确保分析结果的精确性, 我们对原始红外光谱数据进行了预处理, 包括标准正态变量变换(SNV)和多元散射校正(MSC), 如图12所示。 这些预处理方法有效地提高了数据集的一致性和分析模型的鲁棒性。 考虑到灵芝样本质地坚硬可能导致颗粒大小不一, 经过MSC处理后的图像显示出较大的振幅变化, 而SNV处理显示出更高的适用性。 通过SNV处理得到的光谱图谱显示, 在446和1 210 nm波长处, 人工金边灵芝菌柄的吸光度显著低于其他样本, 这可能与其特有的生长环境和地理位置有关。 这一发现与刘有菊^[25]等学者在保山市野生灵芝和人工栽培灵芝的红外光谱对比分析中的研究结果一致, 他们也发现在二阶导数光谱中, 野生灵芝与人工栽培灵芝在波长约为1 400 nm处均呈现出显著的特征峰。 因此, 这些波长处的吸光度差异可以作为区分人工与(野)生金边灵芝的重要依据, 为灵芝的鉴别提供了一种有效的分析手段。

图12

Fig.12

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	图12 灵芝光谱的标准正态变量变换(a)和多元散射校正(b)Fig.12 Standard normal variate transformation (SNV, a) and multiplicative scatter correction (MSC, b) of ganoderma lucidum spectra

我们采集了五种不同灵芝实体的近红外波段图谱, 以评估和比较它们在特定波长范围内的吸收特征。 图13是五种灵芝菌柄菌盖的近红外波段图谱, 展示了各自独特的光谱特征, 这些特征为我们提供了关于灵芝中活性成分含量和种类的重要信息。

图13

Fig.13

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	图13 菌柄菌盖光谱图 (a): 八一灵芝; (b): 尼泊尔赤芝; (c): 人工赤芝; (d): 人工金边灵芝; (e): 野生金边灵芝Fig.13 Spectra of stipes and caps of different ganoderma lucidum varieties (a): 81 Ganoderma lucidum; (b): Nepal red reishi; (c): Cultivated red reishi; (d): Cultivated golden-edge ganoderma lucidum; (e): Wild golden-edge ganoderma lucidum

图13(a)、 (b)、 (e)三种是野生灵芝, (c)、 (d)两种是人工养殖的灵芝, 从图中明显看出野生灵芝菌柄菌盖的吸光度几乎完全重叠, 揭示其不同部位所含化学成分的细微差异^[26]; 而两种人工养殖的灵芝菌柄与菌盖吸光度相差较大, 且人工养殖的灵芝菌盖吸光度始终高于菌柄, 我们可以通过这种方法来判断灵芝的生长方式。 整体分析图形可看出除野生金边灵芝外其余灵芝的菌柄与菌盖吸光度趋势基本相同, 而野生金边灵芝菌柄菌盖的吸光度趋势相差较大, 通过对比研究可得出是野生金边灵芝菌盖的吸光度趋势异常, 这是因为将样品研磨搅拌再取样属于随机取样, 导致取到比较偏僻的部位, 并且藏药在运输及加工过程中脱水程度不同, 影响近红外光谱的分析。 图14(a)是五种灵芝菌柄的吸光度对比图, 其中人工金边灵芝、 人工赤芝与八一灵芝的吸光度在波长350~1 120 nm处没有太大差异, 但相较于野生金边灵芝与尼泊尔赤芝的吸光度有明显差异, 在1 400~2 500 nm五种灵芝的吸光度差异小于350~1 400 nm, 整体来看, 野生金边灵芝、 尼泊尔赤芝这两种野生灵芝与人工金边灵芝、 人工赤芝这两种人工种植的灵芝相比是有明显的差异, 八一灵芝在350~1 120 nm波段与人工种植的灵芝吸光度非常接近, 但在1 120~1 300 nm八一灵芝吸光度明显高于人工种植的灵芝, 可以得出虽然野生灵芝菌柄的吸光度整体高于人工种植灵抓, 但即使同是野生灵芝, 在不同地域环境中生长也会有明显差异。 图14(b)为五种灵芝菌盖的吸光度对比图, 野生金边灵芝的吸光度高于其他四种灵芝, 尼泊尔赤芝、 人工赤芝与人工金边灵芝的吸光度相差不大, 八一灵芝在350~1 400 nm处吸光度低于其他四种灵芝, 在1 400~2 500 nm五种灵芝的菌盖吸光度没有太大差别, 对比两张图可以看出这几种灵芝的菌盖吸光度相差幅度小于菌柄, 菌盖中对应含氢基团的含量相差不大, 其中八一灵芝菌柄与菌盖最稳定, 图14(a)中两种人工种植的灵芝吸光度低于八一灵芝, 在图14(b)中高于八一灵芝, 可以得出人工养殖的灵芝菌柄与菌盖所含有的含氢基团相差较大。

图14

Fig.14

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	图14 五种不同灵芝菌柄(a)、 菌盖(b)光谱对比图Fig.14 Spectral comparison of stipes (a) and caps (b) of five ganoderma species

灵芝酸F是一种从灵芝中分离出来的三萜类化合物, 在不同种类的灵芝真菌鉴别中起了重要作用。 在近红外光谱分析中, 灵芝酸F的特征吸收峰通常位于1 200~1 500 nm的波长范围内。 通过对图14(a)的分析, 我们观察到在这一特定波长范围内, 人工灵芝菌柄的吸光度显著低于野生灵芝菌柄。 这表明人工灵芝菌柄中灵芝酸F的含量低于野生灵芝菌柄。 并且, 图14(b)也显示出相同的趋势, 这可能归因于野生与人工灵芝不同的生长环境和条件, 这些差异可能影响了灵芝酸F的含量及其光谱特性。

光谱的解析一般需要通过特征频率和特征吸收峰来确定主要官能团信息, 物质的近红外光谱是其分子结构的反映, 谱图中的吸收峰与分子中各基团的振动形式相对应。 表4为常见基团的吸收峰, 而表5为实验用灵芝菌柄吸收峰所对应的含氢基团分布表, 表6为实验用灵芝菌盖吸收峰所对应的含氢基团分布表。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 基团的特征吸收峰(nm) Table 4 Characteristic absorption peaks of functional groups (nm) 单位基团 C— H N— H O— H H2O 合频 2 350 2 150 2 000 1 940 二倍频 1 720 1 500 1 430 1 440 三倍频 1 180 1 050 950 960 四倍频 900 800 740 750

表4 基团的特征吸收峰(nm) Table 4 Characteristic absorption peaks of functional groups (nm)

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 菌柄吸收峰所对应的含氢基团表 Table 5 Hydro functional groups corresponding to absorption peaks of stipes 尼泊尔赤芝 人工金边灵芝 野生金边灵芝 人工赤芝 八一灵芝 波长/nm 基团 波长/nm 基团 波长/nm 基团 波长/nm 基团 波长/nm 基团 1 114 CH3 1 110 CH3 1 097 ArCH 1 135 CH3 1 135 CH3 1 662 ArCH 1 661 ArCH 1 555 RNH2 1 669 ArCH 1 655 ArCH 1 794 C— H 1 651 ArCH 1 853 RCO2H 1 799 C— H 1 854 RCO2H 1 856 RCO2H 1 852 RCO2H 1 856 RCO2H 2 012 CONH2R 2 013 CONH2R 2 015 CONH2R 2 013 CONH2R 2 014 CONH2R 2 143 RNH2 2 145 RNH2 2 081 CONH2R 2 226 CH3 2 123 CONH2R 2 226 CH3 2 224 CH3 2 230 CH3 2 349 CH3 2 226 CH3 2 386 CH3 2 384 CH3 2 393 CH3 2 386 CH3 2 386 CH3

表5 菌柄吸收峰所对应的含氢基团表 Table 5 Hydro functional groups corresponding to absorption peaks of stipes

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 菌盖吸收峰所对应的含氢基团表 Table 6 Hydro functional groups corresponding to absorption peaks of caps 尼泊尔赤芝 人工金边灵芝 野生金边灵芝 人工赤芝 八一灵芝 波长/nm 基团 波长/nm 基团 波长/nm 基团 波长/nm 基团 波长/nm 基团 1 113 CH3 1 128 CH3 961 H2O 1 147 CH3 1 135 CH3 1 304 1 313 1 102 ArCH 1 314 1 313 1 662 ArCH 1 655 ArCH 1 304 1 648 ArCH 1 657 ArCH 1 799 C— H 1 667 ArCH 1 794 C— H 2 012 RCO2H 1 860 RCO2H 1 858 RCO2H 1 852 RCO2H 1 852 RCO2H 1 852 CONH2R 2 013 CONH2R 2 008 CONH2R 2 012 CONH2R 2 012 CONH2R 2 227 CH3 2 226 CH3 2 227 CH3 2 223 CH3 2 227 CH3 2 386 CH3 2 381 CH3 2 387 CH3 2 380 CH3 2 383 CH3

表6 菌盖吸收峰所对应的含氢基团表 Table 6 Hydro functional groups corresponding to absorption peaks of caps

将5种灵芝的近红外数据导入OMNIC中, 利用高斯乘积函数找峰法结合表5(基团的特征吸收峰)得到五种灵芝含氢基团的吸收峰, 将灵敏度调至75时, 系统在每个灵芝的菌柄、 菌盖处分别确定7组波峰, 其中C— H基团在这7组波峰中有4组, 剩余3组分别是位于合频区的N— H基团、 合频区的羧酸衍生物RCO₂H以及灵芝的特有峰。 尝试将灵敏度再上调, 看是否可以找出更多的N— H基团与O— H基团, 将灵敏度调至99时发现, 野生八一灵芝、 野生金边灵芝与人工金边灵芝的菌柄波峰均为8个, 菌盖波峰为9个, 而两种赤芝的菌柄波峰为7个, 菌盖为8个波峰, 赤芝波峰比灵芝少一组, 然而并没有因为调高灵敏度使其他几种含氢基团的占比提高, C— H基团占比依然很大。 由于藏药在运输以及后期研磨加工等过程中会损失大量水分, 因此在红外图谱中探测到水的含量很少, 由此我们可知其他含氢基团在近红外光谱中弱于C— H基团。

根据波峰数据分析, 这五种灵芝在1 100~1 150 nm处都有C— H基团, 其中1 100 nm为C— H基团的ArCH, 1 130~1 150 nm的C— H基团均为饱和的CH₃, 1 300 nm的波峰推测为灵芝在近红外波段的特有峰, 在1 650与1 800 nm 也含有不饱和C— H基团, 1 850 nm的羧酸衍生物中有含氢基团中的O— H, 波长为2 010 nm的酰胺基衍生物CONH₂R, 波长2 200~2 500 nm范围均为C— H基团, 由于近红外光谱的谱峰重叠, 因此波长为2 380 nm处五种灵芝菌柄菌盖含有CH₃、 CH₂CH三种基团。 五种灵芝的近红外光谱图中, 1 440与1 930 nm处的波谷都是由于水的含量降低导致的。