光损伤是指成像过程激光束对样品产生的热效应和化学反应所导致的组织损伤。 这种损伤可能使细胞死亡、 蛋白质变性、 发生氧化反应或引发其他不可逆的生物化学反应, 进而影响结果准确性, 因而在活体成像中必须首要关注。 在显微成像领域, 避免光损伤的方法通常包括降低激光功率、 缩短成像时间、 采用红外波段激光等, 以减少激光对样品的热效应和化学反应。 CRS成像通常采用的近红外光或远红外光在大多数组织中吸收率很低, 能尽可能避免光损伤问题, 因此克服光损伤主要从控制激光功率和成像时间上下功夫。

Hellerer等^[12]在对线虫进行活体CARS成像时指出, 由于CARS需要同时照射两束激光, 可能会对活体线虫造成一定损伤或干扰, 需采用低平均激光功率(7.5~38 mW)和短积分时间(20 s)来减少这种影响。 Kö nig等^[13]在利用CARS对人体皮肤进行直接成像时, 则提出为避免任何组织损伤, 成像过程中物镜后激光功率要严格保持在50 mW以下。 Lee^[14]、 Jung^[15]、 Zhu^[16]等在分别对小鼠皮下肿瘤、 耳朵皮脂腺、 小肠进行CARS活体成像时, 也都提到需要通过控制激光功率和缩短成像时间来避免光损伤, 但具体数值需要根据样品性质来决定。 表1给出了不同研究中用于CARS成像的典型实验参数, 包括激光功率、 数值孔径、 光斑直径等。 采用较高的数值孔径缩小了光斑尺寸, 提高了分辨率, 但同时也增加了局部光损伤的风险, 因此这些参数的选择通常还需要综合权衡利弊。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同研究中CARS成像的典型实验参数 Table 1 Typical experimental parameters of CARS imaging in different studies 文献 激光波长(λ /nm) 激光功率(P/mW) 数值孔径(NA) 光斑直径(d* /nm) Hellerer[12] 817/1 064 7.5/15 1.4 707 Kö nig[13] 800/1 040 总激发功率< 50 1.3 750 Jung[15] 812/1 064 30/35 0.75 1 320 Zhu[16] 817/1 064 40/30 1.2 830 注: * 根据公式d=1.22λ /NA估算, 由波长较短的激光(一般为泵浦光)决定

表1 不同研究中CARS成像的典型实验参数 Table 1 Typical experimental parameters of CARS imaging in different studies

随着成像深度增加, 生物组织存在的光吸收、 光散射效应和光学像差会严重影响CRS显微成像质量。 此外, 由于需要两束波长不同的光共同照射样品, 这两束光在深层生物样品中会出现空间上的错位, 还会导致信号激发困难, 进一步影响成像效果。 这些因素使得CRS显微的成像深度受到限制。

斑马鱼^{[29, 37]}、 果蝇^[38]、 线虫^{[12, 39, 40, 41, 42, 43, 44]}等简单生物样品尺寸小, 成像深度限制一般可忽略。 但对于复杂的生物样品, 如小鼠和人体, 则成像深度制约问题必须考虑。 将CRS显微直接用于皮肤或皮肤附近部位可避免成像深度限制, 是最直接的活体成像应用方式。 如通过对皮肤中不同深度的脂质、 蛋白质进行成像, CARS显微能详细展示皮肤的表皮和部分真皮的结构和形态特征^[44]。 CRS的无标记特性还能最大限度减少对样品的扰动, 使其适合观察活体的动态过程。 Evans等^[28]在利用CARS显微对小鼠耳朵皮肤表层、 皮脂腺、 脂肪细胞、 血管网络等进行成像和光谱分析基础上, 跟踪了外部涂抹的矿物油在小鼠皮肤中的渗透过程。 类似地, Sarri等^[32]利用CARS显微对人体皮肤中活性分子甘油的渗透进行成像和量化分析, 发现黄原胶作为甘油载体能在皮肤中持续释放甘油。 Liao等^[33]开发了一种光纤传输的手持式便携SRS显微成像装置, 结合光谱分析, 可区分皮肤上是否涂抹化妆品。 Jung等^[15]利用CARS显微对冷冻治疗前后小鼠耳内皮脂腺进行成像研究, 揭示了皮脂腺在全分泌过程中的动态变化, 以及对冷却引起的腺体损伤的反应。 Hajireza等^[34]则利用SRS显微对小鼠耳朵中的血管进行成像, 观察血液中氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的吸收差异, 用于评估血液氧合水平。 此外, 皮肤中脂质分布和变化与某些皮肤疾病密切相关, 因此CRS显微还具备区分病变组织的能力。 Chen等^[35]利用CARS显微对比了银屑病病变区域皮肤与健康皮肤的脂质图像, 发现两者的脂质分布存在显著差别。 他们定制了样品支架(图2), 可直接实现人体皮肤的CARS显微成像, 并对人体皮肤中油脂的扩散过程进行长达30 min的实时监测。

图2

Fig.2

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	图2 手掌皮肤的CARS显微成像[35] (a): 手掌感兴趣区域; (b): 可磁吸固定于显微镜样品台的定制支架; (c): 手掌在显微镜上的摆放位置; (d): 定制支架设计图Fig.2 CARS microscopic imaging for palm skin[35] (a): Selected location on the palm; (b): Sample holder that can be attached to the microscope sample stage with a magnets; (c): Hand position on the microscope; (d): Detailed design of the sample holder

然而, 要利用CRS显微对更深层的组织或器官(如实验动物大脑、 体内肿瘤等)进行成像研究, 上述装置和成像方案不再适用。 最直接的解决办法是对活体动物进行微创手术, 直接暴露要观察的部位, 再结合光学窗口来获得高质量的CRS显微图像。 光学窗口有不同类型, 如对小鼠大脑进行成像可采用颅窗(cranial window, CW), 而对小鼠皮下种植肿瘤进行成像可采用背脊皮翼视窗(dorsal skinfold window, DSW)(图3)。 这种方法对实验动物影响较小, 只要确保窗口部位不发生炎症或渗液, 还能长期观察。 Fu等^[17]利用CW对小鼠大脑中皮层和皮下白质中的髓鞘纤维束进行CARS显微成像, 观察到皮下白质中的髓鞘纤维束比皮层中的纤维束排布更为均匀。 Galli等^[18]利用CW对小鼠头部肿瘤进行CARS显微观察, 发现肿瘤组织内CARS信号的下降可作为肿瘤边界探测的可靠参考。 Luo等^[19]利用CW对阿尔茨海莫症(Alzheimer's disease, AD)小鼠脑内血管和Aβ 斑块进行长期观察和定量分析。 Qu等^[20]则利用DSW实现对小鼠皮下肿瘤生长过程中脂滴变化的长期CARS显微监测。 Lu等^[21]在利用SRS显微对小鼠皮肤进行成像时也采用了DSW, 实现了对小鼠皮肤细胞分裂过程中DNA的成像。 此外, Wu等^[22]开创性地利用微创椎间窗对小鼠脊髓进行长期的体内CARS显微成像。

图3

Fig.3

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	图3 光学窗口示意图 (a)— (c): 颅窗[19]; (d)— (e): 背脊皮翼视窗[21]; (f): 椎间窗[22]Fig.3 Schematic diagram of optical windows and DSW (a)— (c): Cranial window[19]; (d)— (e): Dorsal skinfold window[21]; (f): Intervertebral window[22]

对于一些更深的组织和器官, 如脊髓、 肝脏、 小肠等, 也有研究人员选择微创手术打开皮肤后直接进行成像。 Shi等^[23]对小鼠脊髓表面进行CARS显微成像时在脊柱钻一个小孔, 每次成像后在伤口处放置琼脂块用于保护, 也实现了对脊髓的多次、 长期成像。 Huff等^[24]通过微创手术打开小鼠皮肤后, 直接利用CARS显微对坐骨神经中的髓鞘轴突进行成像。 Rodewald等^[31]对小鼠进行手术, 暴露肝脏后对小鼠肝脏中维生素A进行CARS显微成像研究。 Zhu等^[16]则对小鼠小肠组织进行手术暴露, 然后在CARS显微成像过程中使用温暖的培养基保持组织活性, 以实时观察膳食吸收过程中细胞质脂滴内三酰甘油的积累和消耗。 Fu等^[25]通过手术暴露小鼠坐骨神经后, 对其髓鞘结构进行CARS显微成像, 从而发现髓鞘降解的机制和途径。

然而, 手术暴露毕竟是有创行为。 为更好地发挥CRS显微的无标记无创成像优势, 研究人员采用自适应光学(adaptive optics, AO)技术来突破成像深度的限制。 自适应光学通过实时检测和校正光波相位畸变有效补偿像差影响, 可大幅提高深层样品的成像质量。 Wright等^[45]采用该机制, 校正CARS显微成像系统和肌肉组织样品引起的像差, 将700和260 μm深度处肌肉组织的CARS信号分别增强约3倍和6倍。 Fu等^[17]采用类似方法, 借助CW实现对小鼠大脑内髓鞘轴突的CARS显微成像, 获得亚微米级的三维分辨率。 Lin等^[46]则利用一种基于AO的SRS显微成像装置, 实时捕捉到了二甲基亚砜在人体汗孔中的动态扩散过程。

内窥技术也是提升成像深度的有效方法, 它通过细长光学管道将光源和成像设备引入体内, 可提供高分辨率图像并支持实时监测。 近年来已有诸多研究聚焦于实现CRS内窥显微成像, 但由于仍存在诸多难点待解决, 目前尚未有真正的活体成像应用报道。 以CARS内窥显微为例, 其主要难点在于四波混频背景和色差问题。 针对这些难点, 研究者们提出多种解决方案, 如Lukic等开发的新型光纤探头^[47]和CARS内窥镜^[48], Lombardini等^[49]提出的共振扫描空心光纤设计, 以及Hirose等提出的梯度折射率透镜^[50]等。

生物体的运动和呼吸、 心跳等生理活动会在活体成像过程中产生伪影, 导致图像模糊, 这在CRS显微成像中尤其不容忽视。 CRS显微成像通常采用高倍物镜, 成像视野相对较小, 且一般需较长积分时间以积累足够的信号光子, 因此与宽场成像相比, 相同幅度的运动伪影在CRS图像中会产生更显著的影响。

在活体成像中, 确保生物体静止或减少运动是基本需求, 通常通过麻醉和固定来实现。 对于小鼠等稍大型的活体样品, 一般采用腹腔注射氯胺酮与噻嗪混合物^{[22, 23, 51]}, 或吸入异氟醚气体^[19], 以实现全身麻醉; 而对一些小型活体样品, 如斑马鱼、 果蝇和线虫等, 通常有特定的处理方法, 如斑马鱼可用三卡因甲磺酸进行麻醉, 而后固定于超低胶凝温度的琼脂糖中进行固定^{[29, 37]}; 果蝇可采用乙醚烟雾麻醉, 并在成像过程中通过持续释放二氧化碳气体来保持其麻醉状态^[38]; 对于线虫, 可将其置于铺有琼脂糖垫和叠氮化钠的载玻片上进行成像^{[12, 39, 40, 41, 42, 43, 44]}。

但即便如此, 处于麻醉状态的活体样品仍有呼吸和心跳, 仍可能带来运动伪影。 采用光学窗口能有效减少这种影响^{[20, 21]}。 如图3中的DSW能很好地固定成像部位, 最大程度隔绝呼吸和心脏收缩引起的抖动, 减少运动伪影影响, 显著提高活体CRS显微成像质量。 此外, 采用实时运动矫正算法也可有效减少呼吸和心跳造成的运动模糊。 通过在每一帧图像中选取感兴趣区域并计算与前一帧图像的互相关得到图像的相对偏移量, 用于对齐两帧图像, 可消除抖动影响。 Veilleux等^[26]采用该算法消除CARS显微成像中的运动伪影, 成功获得小鼠眼睛虹膜血管的清晰图像。 Bé langer等^[27]也在小鼠神经CARS成像过程中应用类似算法, 显著提高了成像质量和信噪比。

设法提高成像速度也是活体成像中减少运动伪影的一种有效策略。 Evans等^[28]采用一种基于快速扫描头的CARS显微系统, 实现帧率达20 fps的宽视场(800 μm× 600 μm)高分辨率成像, 实时跟踪了矿物油在小鼠皮肤中的渗透过程。 Veilleux等^[26]设计了一种快速激光扫描机制和时序电路, 利用旋转多边形镜和扫描振镜实现单向栅格扫描, 将小视场(4.11 μm× 16.46 μm)的扫描帧率进一步提高到120 fps, 从而实现对血管中快速流动细胞的清晰CARS成像。

值得一提的是, 上述方法通常不是单独使用的, 这些方法的结合有望提高CRS显微在活体成像中的应用效果, 为动态生物过程的研究提供有力支撑。

如前所述, CARS和SRS显微一般采用两束脉冲激光照明样品, 并采用点扫描方式成像, 这使得它们可以较方便地与TPEF和SHG显微等同样需要脉冲光和点扫描的非线性光学成像技术共用一套系统, 实现多模态融合成像。 每种非线性成像技术对特定分子或结构具有独特敏感性, 如CARS和SRS可实现对样品中特定分子的特异性成像, 还能获取样品的拉曼光谱信息以区分不同物质; TPEF可对生物组织中的自体荧光物质或外源荧光标记物进行成像; 而SHG则对生物组织中的胶原纤维等具有非中心对称的结构尤为敏感。 因此, 多模态融合成像能更全面观察复杂生物组织, 既能拓展光学显微成像在生命科学研究中的应用潜力, 又能提供更丰富的生物学信息, 助力更深入的理解。

将TPEF、 SHG与CRS整合到同一显微成像系统面临的最大挑战, 是这些成像方式对脉冲光要求的差异— — TPEF和SHG通常需要超短飞秒脉冲激光以确保高激发效率, 而CRS显微, 尤其是高光谱CARS或SRS显微则需要窄带的皮秒脉冲激光以提高光谱分辨率。 为实现多模态融合成像, Veilleux等^[52]采用皮秒脉冲激光与飞秒激光组合的方案, 对小鼠的皮肤、 头骨骨髓和视网膜进行CARS、 TPEF、 SHG显微成像, 分别呈现出血管结构、 血管中的白细胞和胶原蛋白组织。 Wu等^[53]则利用飞秒脉冲激光和皮秒脉冲激光组合的方案, 实现了小鼠脊髓的SRS和TPEF双模态显微成像, 同时监测了脊髓疾病发展过程中髓鞘和轴突的动态变化。 然而, 这种多激光器的配置方式增加了系统的复杂度和成本, 使推广应用受到限制。

Hellerer等^[36]提出的光谱聚焦法可采用宽带飞秒脉冲激光作为光源, 通过在光路中引入色散介质将飞秒脉冲展宽为皮秒脉冲, 不仅可以在非线性光谱和显微成像中实现高光谱分辨率, 还能有效解决其与TPEF和SHG的光源兼容性问题。 Andreana等^[29]利用该方法, 成功采用飞秒脉冲激光实现TPEF、 SHG和CARS多模态显微成像, 且其中CARS显微的光谱分辨率达35 cm^-1, 能区分斑马鱼体内肿瘤中的脂质和用于麻醉固定斑马鱼的琼脂。 Qu等^[20]基于类似方法搭建的CARS/SHG双模态显微系统, 可对活体小鼠肿瘤中的脂滴和胶原蛋白进行实时监测(图4), 为评估药物疗效提供新方案。 Luo等^[19]在其利用CARS对AD小鼠大脑血管进行成像的工作中, 引入TPEF用于监测荧光标记的Aβ 斑块, 清晰观察到 AD小鼠脑内血管壁上的斑块沉积及其随月龄增加而显著增加的规律。 此外, Breunig等^[30]结合TPEF和CARS对人体皮肤进行成像, Kö nig等^[13]则结合CARS、 SHG和TPEF进行皮肤成像, 更全面地解析人体皮肤的结构和功能。 这些研究展示了CRS多模态融合显微成像在生物组织观察中的重要性和应用潜力。

图4

Fig.4

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	图4 活体小鼠肿瘤的CARS/SHG成像监测[20] (a): 肿瘤区域; (b), (c): 脂滴的CARS图像; (d): 胶原蛋白的TPEF图像; (e): 合并图像; 比例尺: 40 μmFig.4 CARS/SHG monitoring of in vivo mouse tumors[20] (a): Tumor region; (b), (c): CARS image of lipid droplets; (d): TPEF image of collagen; (e): Merge images; Scale: 40 μm