在本实验中, 烧蚀源为Nd:YAG脉冲调Q激光器, 聚焦激光光斑直径为500 μ m。 激光经反射并通过聚焦透镜垂直聚焦于样品表面以下2 mm处, 聚焦透镜直径25 mm, 焦距100 mm。 将产生的等离子体发射光由光纤耦合进配备了增强型电荷耦合器件(intensified charge-coupled device, ICCD)的切尔尼-特纳光谱仪中。 在实验中, 样品被放置在位移平台上进行“ 螺旋形” 运动, 为每个激光脉冲提供新的未烧蚀表面, 样品的运动速度为1.0 mm· s^-1。 采用数字延时发生器控制Nd:YAG激光器和ICCD相机的触发时序。 实验在大气条件下进行。 所用系统装置图及设备参数分别如图1和表1 所示。

图1

Fig.1

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	图1 LIBS实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of the LIBS system

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实验所用主要设备的具体型号和参数 Table 1 Specific parameters of the main equipment used for the experiment 设备名称 参数 Nd:YAG脉冲调Q激光器 型号: Quantel Brilliant B 波长: 1 064 nm 重复频率: 10 Hz 脉宽: 6 ns 能量: 100 mJ(max) 增强型电荷耦合器件 型号: Princeton Instruments, Max3 1 024× 256像素 切尔尼-特纳光谱仪 型号: Princeton Instruments, IsoPlane SCT 320 光栅对数: 3 600 lp· mm-1 分辨率: ± 0.2 nm 数字延时发生器 型号: Stanford Research Systems, DG535

表1 实验所用主要设备的具体型号和参数 Table 1 Specific parameters of the main equipment used for the experiment

为模拟职业性慢性铅中毒患者的含铅全血, 需要制备一系列具有已知铅浓度的全血样品。 在本实验中, 因为兔红细胞具有与人红细胞相似的溶血特性, 且为医疗器械生物学评价中常用的模型动物, 所以选用无菌肝素抗凝兔血(郑州平睿生物科技有限公司)进行实验^[19]。 使用电子天平称取一定量的铅标准溶液(GNM-SPB-006-2013, 10 μ g· mL^-1)加入全血中, 配置不同浓度血铅样品, 具体浓度如表2所示。 其中, 编号1— 5为接铅正常组, 编号6— 10为铅吸收组, 编号11— 15为铅中毒组。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 样品编号及血铅浓度* Table 2 Sample number and blood lead concentration* 编号 浓度/ (μ g· L-1) 编号 浓度/ (μ g· L-1) 编号 浓度/ (μ g· L-1) 1 70 6 400 11 600 2 140 7 440 12 700 3 210 8 480 13 800 4 280 9 520 14 900 5 350 10 560 15 1000 注: * 所有配置液经ICP-MS验证实际铅含量相对误差小于5% Note: * The relative error of actual lead content verified by ICP-MS is less than 5%

表2 样品编号及血铅浓度* Table 2 Sample number and blood lead concentration*

液固转化法^[20]能有效避免液体样品低灵敏度、 重复性差等缺点, 并且只需要很小的样本量。 本实验对比了LIBS医学检测中常用的几种基板: 滤纸、 硼酸基板、 石墨基板和载玻片。 制样前使用无水乙醇和去离子水清洗基板三次以去除表面杂质。 液固转化具体步骤如图2所示:

图2

Fig.2

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	图2 全血样品制备流程图Fig.2 Whole blood sample preparation process

(1) 对兔血超声处理(超声功率50 W, 频率40 kHz, 40 ℃下持续5 min)并稀释配置系列不同铅浓度的全血样品;

(2) 将无铅胶带打孔贴于载玻片上以限制液滴范围, 用移液器移取40 μ L的溶液滴至圆孔中心;

(3) 40 ℃下加热基板5 min, 使全血样品干燥完成制样。

1.3.1 数据预处理方法

采集到的光谱数据除包含与样品相关的信息, 还有背景噪声等干扰, 因此在分析前, 需要对光谱数据进行预处理。 PCA是一种无监督学习算法, 有特征提取的作用, 可在尽量避免丢失数据有效信息的前提下, 将多特征问题转化为较少综合特征问题的方法。 其本质是一种降维过程, 通过正交变换将可能线性相关的n维变量转换为k维上线性不相关的新变量, 这k维即主成分。 这种转换在确定第一主成分时选择原数据方差最大的方向, 意味着其包含尽可能多的信息量, 并且后续每个主成分在保持与前面成分正交的条件下选取方差最大者。

1.3.2 定性分析算法

将SVM和BPNN两种机器学习算法应用于LIBS数据, 以实现不同职业性慢性铅中毒类型的识别。

SVM是一种典型的有监督分类方法, 其本质是定义在特征空间上的间隔最大分类器, 在LIBS医学检测领域已有广泛应用^{[21, 22]}。 其主要思想为: 找到空间中的一个能够将所有数据样本划分的超平面, 并使样本集中所有数据到这个超平面的距离最短。 该超平面可描述为

minw, b12‖w‖2s.t. yi(wTxi+b)≥1, i=1, 2, …, m(1)

式(1)中, w和b分别为超平面的法向量和位移项, (x_i, y_i)为样本点。

若用k(x_i, y_i)对x_i进行映射, 则该函数被称为“ 核函数” ^[23]。 LIBS数据存在非线性关系, 通过选择合适的核函数, SVM可以将线性不可分问题转化为可处理。 在小样本数据上SVM也能获得较好的分类结果和泛化能力, 适合于LIBS数据分类任务。 选择的核函数如表3所示。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 SVM算法常用核函数 Table 3 Kernel functions are commonly used in SVM algorithms 名称 表达式 参数 线性核 k(xi, xj)= xiTxj / 多项式核 k(xi, xj)=( xiTxj)d d≥ 1为多项式的次数 高斯核 k(xi-xj)=exp-‖xi-xj‖22σ2 σ > 0为高斯核的带宽 Sigmoid核 k(xi, xj)=tanh(βxTixj+θ) 为双曲正切函数, β > 0, θ < 0

表3 SVM算法常用核函数 Table 3 Kernel functions are commonly used in SVM algorithms

BPNN是一种前馈型神经网络, 也是神经网络领域最基本的网络结构。 善于训练学习输入与输出数据之间的复杂非线性关系, 适合处理LIBS光谱这类多特征数据。 反向传播算法是神经网络领域最常用的梯度更新策略^[24]。 如图3所示, 本工作所采用的神经网络一共由三部分组成: 输入层、 隐含层、 输出层。

图3

Fig.3

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	图3 BP神经网络结构示意图Fig.3 Schematic diagram of the BPNN structure

神经网络的神经元从前一层接收加权输入信号后, 结合激活函数进行非线性变换处理, 从而捕捉输入数据的复杂特征。 隐藏层第k个神经元的输出为

yk=f∑i=1mwixi(2)

式(2)中, x_i为上一层第i个神经元的输出, w_i为上一层第i个神经元与当前神经元之间传递信号的权值, m是网络结构中上一层的神经元数量, f为激活函数。 利用反馈误差作为梯度更新权重, 以此优化网络的整体性能, 实现光谱类型识别。

为了比较不同算法的识别效果, 将最大最小归一化^[25]后的原始数据集划分为训练集和测试集, 使用交叉验证(cross-validation)策略来抑制模型过拟合问题并对模型进行评估。 采用准确率(Accuracy)、 精确率(Precision)、 F1值(F1 score)及曲线下面积(area under the curve, AUC)等常用分类任务评价指标对模型结果进行评估, 具体定义如下:

(1)准确率指预测正确的样本数量占样本总数的百分比, 可用来评价模型整体预测效果。

Accuracy=TP+TNTP+TN+FP+FN(3)

式(3)中, TP(true postive)代表正确判断为目标类样本的数目, TN(true negative)代表正确判断为非目标类样本的数目, FP(false postive)代表错误判断为目标类样本的数目, FN(false negative)代表错误判断为非目标类样本的数目。

(2)精确率又称为查准率, 是针对预测结果为目标类的评价指标。 对应在模型预测为目标类的结果中, 真正为目标类样本的百分比。

Precision=TPTP+FP(4)

(3)F1值被定义为精确率和召回率(Recall)的调和平均数。 召回率是指被模型正确识别为目标类的样本比例。 F1值的最大值是1, 最小值是0, 值越大意味着模型越好。 其计算方式如式(5)和式(6)所示

Recall=TPTP+FN(5)

F1=2×precision×recallprecision+recall(6)

(4)接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve, 曲线)是以TPR(true postive rate)为纵坐标, FPR(false postive rate)为横坐标绘制的曲线, TPR和FPR分别代表正确和错误判断为目标类样本的比率。 AUC值即ROC曲线下面积, 表示ROC曲线与坐标轴围成的面积, 其范围从0到1, 值越大表示模型性能越好。 结合上述指标, 本文对不同类别的职业性慢性铅中毒数据的分类方法流程如图4所示。

图4

Fig.4

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	图4 模型构建流程图Fig.4 Construction process of the models

2.1.1 全血样品特性分析及基板优化

为方便观察全血超声前后的细胞形态, 使用生理盐水10倍稀释超声处理前后的全血样品, 如图5(a), (b)所示。 图中观察到, 超声震荡后, 因其产生的机械振动和热效应破坏了细胞膜, 导致细胞破裂并表现出褶皱状形态。 图5(c), (d)分别展示了使用超声前后全血制备的固体样品, 可以观察到, 超声后干燥血液上形成的裂缝密度明显减少。 其原因是血液作为一种胶体悬浮液, 超声后红细胞为主的细胞破裂导致细胞内容物流出, 液体整体均质化, 胶体颗粒平均尺寸减小, 血液粘度降低, 进而导致裂纹密度的降低^[26]。 超声处理不仅缓解了激光作用于干燥血液时的样品碎裂问题, 且使全血基质分布更加均匀, 增加了LIBS样品采集的稳定性。

图5

Fig.5

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	图5 全血超声前后的细胞及样品形貌 (a)超声前, (b)超声后生理盐水稀释全血的细胞形貌; (c)超声前, (d)超声后干燥血液形成的裂缝形貌Fig.5 Cellular and sample morphologies of whole blood before and after ultrasound (a) before ultrasound, and (b) after ultrasound, cellular morphologies of saline-diluted whole blood; (c) before ultrasound, and (d) after ultrasound, morphologies of fissures formed by dried blood droplets

为选择合适的基板类型, 对不同基板本身及其上全血样品的光谱进行分析。 每个样品采集30幅光谱, 选择Pb Ⅰ 405.78 nm作为目标谱线。 图6(a), (b)为基板滴加全血前后的形貌图。 由图6(c)可知, 石墨基板和硼酸基板在所测铅线附近出现了强烈的连续背景, 而滤纸基板和载玻片基板在该信号段背景较为平稳。 图6(d)为滴加全血样品后的LIBS光谱图, 图中可以观察到载玻片及石墨基板上全血光谱信号高, 但结合图6(c)来看, 石墨基板本身在目标谱线附近存在较强的干扰背景, 因此不考虑使用。 而滤纸内部为多孔疏松结构, 样品分布不均匀, 从而影响LIBS光谱的强度, 综合选择载玻片作为实验基板。

图6

Fig.6

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	图6 基板及其对全面光谱的影响 (a): 空白基板; (b): 全血沉积在基板; (c): 不同基板的光谱; (d): 全血沉积在不同基板的光谱Fig.6 Substrates and spectra of whole blood on different substrates (a): Blank substrate; (b): Whole blood on substrate; (c): Spectra of substrates; (d): Spectra of whole blood on different substrates

为进一步优化实验, 探究了不同制样参数对光谱质量的影响。 为防止加热干燥时全血中蛋白质凝固现象对样品造成干燥不均匀的问题, 经实验对比获得最佳干燥温度为40 ℃, 可在5 min内完成干燥。 不同的孔径所导致的咖啡环效应程度不同, 在打孔胶带上设置不同孔径(5~7 mm)及滴入量优化实验。 每个参数采集20幅光谱, 在相同实验条下比较信号强度及光谱波动性, 如图7所示, 展示了不同孔径下不同滴入量的影响结果。 其中“ * ” 为液滴溢出, 样本无意义。 7 mm孔径所有滴入量的平均光谱信号强度相比6和5 mm孔径分别高7.88%和11.87%。 强度增加的原因是随着滴入量的增加, 单位面积上的元素总量增加, 导致光谱强度升高。 同时在体积一定的前提下, 随着面积扩大, 周长增加, 咖啡环效应导致的边缘集中现象减弱^[27], 整个范围内元素分布更加均匀, 从而导致标准差降低。 因此该孔径下40 μ L的滴入量相比其他值测得的光谱强度误差更小, 光谱波动更低, 最终选择7 mm的胶带孔径以及40 μ L的滴入量作为最优参数。

图7

Fig.7

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	图7 胶带孔径(a)5 mm, (b)6 mm, (c)7 mm及滴入量对光谱质量的影响Fig.7 Effect of tape aperture size (a) 5 mm, (b) 6 mm, (c) 7 mm and drop size on the qualities of spectra

2.1.2 LIBS实验参数优化

光谱中包含分析物信号、 连续背景(轫致辐射和复合辐射引起)和检测器的随机噪声等。 当实验设备固定时, 优化LIBS分析实验参数如激光脉冲能量、 门延迟和门宽, 可以显著提高LIBS分析的灵敏度和重复性, 从而获得更可靠和准确的分析结果。 采集参数优化结果如图8所示, 最优参数的选择通过综合考虑所分析元素特征谱线的光谱强度以及信背比(signal-to-background ratio, SBR)^[28]来确定。 为防止能量过大对基板造成烧蚀, 实验中激光能量的调节范围为10~50 mJ, 间隔5 mJ依次增加, 观测和分析谱线Pb Ⅰ 405.78 nm强度及SBR。 从图8(a)可以看出激光能量与特征谱线强度呈线性关系, 当能量超过40 mJ时, 光谱波动增大, 载玻片开始出现明显裂纹; 谱线SBR随激光冲能量先增加后减小, 在能量25 mJ时SBR最佳, 综合选择最优能量为25 mJ。 采集延时的设置范围为1~14 μ s, 信号随采集延时的变化如图8(b)所示, 随延时增加, 谱线强度明显降低, SBR却先增后减, 增加的原因是由轫致辐射产生的连续背景下降速度比谱线强度大的多。 选择2.5 μ s为合适延时的原因是其后光谱强度波动逐渐减小, 且此时SBR最佳。 采集门宽指光谱仪对接受光信号累积时间的长短, 门宽增加, 光谱仪采集光信号的时间越长, 收集到的光信号越多, 谱线强度越高; 门宽过大, 不同时间段的信号叠加可能会干扰目标谱线。 如图8(c)所示, 谱线强度随采集门宽的增加而增强且逐渐趋于饱和, 且10 μ s后光谱波动性增加, 综合谱线强度和SBR, 选择10 μ s为最佳门宽。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 采集参数对光谱质量的影响 (a): 激光能量; (b): 采集延时; (c): 采集门宽Fig.8 Effect of acquisition parameters on qualities of the spectra (a): Laser energy; (b): Acquisition delay; (c): Acquisition gate width

根据上述的实验设置和最佳光谱采集参数, 采集得到全血样品LIBS光谱, 光谱范围为400~410 nm。 对比NIST相关标准谱线库可知, 光谱范围内除了目标元素铅外还存在K、 铁(Fe)等血液中常见元素的谱线, 其与铅元素谱线相距较远, 不会干扰分析结果。 元素浓度不同导致相关谱线信号强度不同, LIBS在痕量分析物浓度低且光谱峰强度较低时, 其分类准确性较差且重现性有限。 图9中可以看出, 虽然不同类别慢性铅中毒的铅元素谱峰强度差异较小, 但非线性机器学习算法能够通过构建高维特征空间, 捕捉隐含的复杂特征关系。 例如, 神经网络或支持向量机等算法可以在铅元素谱峰强度的非线性分布中发现区分不同类别的重要特征, 从而提升分类准确性。

图9

Fig.9

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	图9 不同铅中毒诊断类别的元素谱线差异图Fig.9 Differences in spectra for different diagnostic categories of lead poisoning

2.3.1 SVM和BPNN用于慢性职业性铅中毒类型诊断

分别使用原始SVM和BPNN模型构建慢性铅中毒的分类模型。 原始数据集由三类慢性铅中毒数据组成, 每类数据包含5种样本, 每类样本采集30幅光谱。 SVM模型训练时分别采用了线性核、 多项式核、 高斯核和Sigmoid核, 如表4所示, 展示了不同核函数的分类结果。 使用粒子群优化算法, 通过不断更新粒子的速度和位置, 寻找问题的最优解, 实现了对模型的核函数参数gamma和正则化参数C的优化。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 不同核函数对分类结果的影响 Table 4 Effect of different kernel functions on classification results 名称 准确率/% 精确率/% F1值 AUC值 线性核 87.78 87.97 0.875 3 0.962 7 多项式核 86.67 88.85 0.869 7 0.973 1 高斯核 90.00 90.53 0.897 7 0.989 8 Sigmoid核 54.44 54.61 0.616 5 0.753 1

表4 不同核函数对分类结果的影响 Table 4 Effect of different kernel functions on classification results

BPNN中输入层神经元数量和降维后的单个特征向量长度保持一致。 隐藏层神经元数量为10, 输出层神经元数量为3。 隐藏层采用Sigmoid激活函数, 输出层采用线性激活函数。 为进一步评估预测模型, 均通过10折交叉验证策略进行训练。 图10显示了职业性慢性铅中毒的3种诊断类别: 接铅正常组(1类)、 铅吸收组(2类)和铅中毒组(3类)的SVM和BPNN分类结果。 从SVM分类结果来看: 2类样品的分类正确率相比其他两类低, 在1、 3类样品上取得了较好的结果; 从BPNN分类结果来看, 2类样品的分类准确率相比SVM有了明显的提高, 同时在1、 3类样品的分类上维持了较好的分类效果。 相比于SVM, BPNN更能够容忍输入数据中的噪声^[29]。 即使训练数据中含有一些错误或噪声, BPNN通过学习和训练也能得到较好的分类效果。

图10

Fig.10

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图10 分类结果图 (a): SVM; (b): BPNNFig.10 Classification results (a): SVM; (b): BPNN

2.3.2 PCA-SVM和PCA-BPNN用于慢性职业性铅中毒类型诊断

原始LIBS数据集中包含大量冗余信息干扰, 对直接使用机器学习算法的准确率有一定影响。 为此, 先使用PCA提取血液原始光谱数据中的有效特征, 再使用SVM和BPNN模型进行训练。 在PCA降维过程中, 贡献率随主成分数的变化如图11所示。 在主成分数选择10个的条件下解释了95%以上的原始数据方差, 作为降维后特征数量的选择依据。

图11

Fig.11

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图11 贡献率-主成分数关系图Fig.11 Relationship between contribution margin and major component

基于10折交叉验证后各模型的结果如表5所示, PCA-SVM和PCA-BPNN模型平均分类准确率和精确率分别为91.11%、 91.18%和95.56%、 96.08%; F1值分别为0.909 2和0.955 4; AUC值分别为0.984 8和0.998 3。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 不同模型的判别结果对比 Table 5 Comparison of discriminatory results of different models 模型 准确率/% 精确率/% F1值 AUC值 SVM 90.00 90.53 0.897 7 0.989 8 BPNN 93.33 93.54 0.932 0 0.995 0 PCA-SVM 91.11 91.18 0.909 2 0.984 8 PCA-BPNN 95.56 96.08 0.955 4 0.998 3

表5 不同模型的判别结果对比 Table 5 Comparison of discriminatory results of different models

与SVM和BPNN单模型相比, 分类准确率分别提高了1.11%和2.23%, 证明了PCA降维算法在构建LIBS全血慢性铅中毒类型判别模型中的作用。 相比PCA-SVM模型, PCA-BPNN模型对LIBS光谱数据具有较好的分类效果, 表现出最佳的分类准确率、 精确率、 F1值以及AUC值。 如图12 所示, PCA-BPNN模型对3类样品预测正确率最高, 在2类样本上表现相对较差。

图12

Fig.12

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	图12 分类结果图 (a): PCA-SVM; (b): PCA-BPNNFig.12 Classification results (a): PCA-SVM; (b): PCA-BPNN

综上所述, BPNN在有无PCA的条件下分类效果都优于SVM。 PCA进一步提高了BPNN的表现。 因为BPNN具备非常强的非线性映射能力, 适合求解内部机制复杂的问题; 且具备较强的学习、 适应和泛化能力, 能够通过学习自动提取输入、 输出数据间的潜在关系, 对参数敏感性相对较低。