目前在血液检测中最常用的为联苯胺衍生物3, 3', 5, 5'-四甲基联苯胺(TMB)。 联苯胺可以与血液中的血卟啉反应, 使过氧化氢释放出强氧化性的初生态氧[O], 将无色的四甲基联苯胺氧化为蓝色的四甲基联苯胺蓝, 从而推测血液残留的可能性^[18]。

Cox^[19]探究了四甲基联苯胺检测血迹的灵敏度以及干扰因素, 发现血液在1∶ 1 000 000稀释度下仍能在20 s内呈阳性反应, 说明该实验方法灵敏度较高。 此外, 2011年, 维也纳艺术博物馆使用联苯胺测试了中国漆器底层的可疑血迹, 结果呈蓝色, 并通过色谱-质谱验证了结果的准确性^[20]。 然而, 联苯胺实验易受外界因素影响, 如土豆、 番茄、 辣根和铁锈等均会对联苯胺实验结果产生干扰, 出现假阳性, 其中辣根的联苯胺实验几乎和血液显色一样强烈、 迅速和持久^[19]。 因此, 使用联苯胺实验检测文物上血残留物时, 需要充分考虑外界因素存在的影响, 故其使用十分受限, 但也推动了其他检测方法的发展。

在酸性溶液中, 隐色孔雀石绿为无色。 遇到血红蛋白时, 在血卟啉的催化下发生氧化反应生成深绿色的孔雀石绿, 从而推定血迹的存在。 尽管以往也将隐色孔雀石绿应用于血痕检测之中, 但由于其灵敏度不如联苯胺实验及还原酚酞实验^[21], 故其应用并不广泛。 最近, 有研究成果表明, 与联苯胺及其衍生物相比, 隐色孔雀石绿产生的假阳性可能最低, 是比较合适的血迹推定试剂^[22]。

还原酚酞在碱性条件下提供电子, 血红蛋白类似过氧化物酶催化过氧化氢还原为水, 同时还原酚酞被氧化遇碱变红, 从而检测血液残留。

传统还原酚酞实验灵敏度高, 如Cox^[19]发现血液在1∶ 1 000 000稀释度下仍可获得阳性反应。 Fang等^[23]通过还原酚酞法在浙江省衢州市龙游祠堂戏台的石柱外层灰浆样品中检测到血痕, 并通过红外光谱确认结果。 尽管还原酚酞也会与果蔬如鲜绿色菜豆、 马铃薯和辣根反应显色, 出现假阳性, 但结果与真实血液易于区分^{[21, 24]}。 随后, 陆续有研究者对试剂进行改进, 提高了工作溶液的稳定性使试剂能长期使用^{[21, 25]}。 此外, Zhai等^[26]针对早期检测灰浆中有机添加物的方法^[23], 引入微孔板分光光度计, 将还原酚酞对血料的检测限从1 μ g· mL^-1降低至0.13 μ g· mL^-1。 Gurfinkel^[27]等通过模拟埋藏实验对文物血液残留的可能性进行了验证, 认为使用四甲基联苯胺和还原酚酞等方法可以对样品进行快速筛选。 因此, 还原酚酞法有望成为血液残留样品的初筛方法。

血红蛋白在碱性条件下会分解成正铁血红素和变性珠蛋白, 与具有还原性的高山试剂反应时, 正铁血红素会被还原生成血红素, 血红素与含氮化合物(变性珠蛋白)结合可以生成樱红色结晶^[28]。

由于血迹属于有机残留物, 经过成百上千年的埋藏, 往往在文物上遗留下来的量十分有限, 想要通过结晶实验推测血迹存在的难度较高。 Loy^[15]在加拿大两处露天遗址中首次发现史前石器上含血残留物, 随后通过结晶实验与现代人及多种动物的血样对比, 确定了人、 鹿、 羊、 兔和熊等动物的血液残留。 周文晖^[10]等针对蒙古国博格达汗宫博物馆柱子油饰彩画地仗中的血料, 首次将血色原结晶实验用于血料的定性鉴定, 但实验仅产生了少量红色物质, 表明文物样品中含有血料, 但是血料降解程度较高, 因此实验现象不明显。 Loy^[15]、 Wood^[29]、 Dixon^[30]等研究人员也曾使用血红蛋白结晶来鉴定考古文物上的血残留物。 除了血色原结晶实验外, 目前还有联苯胺色晶实验^[31]、 氯化血红素结晶实验^[32]等, 这些实验与血色原结晶实验原理类似。 虽然这类方法很早就被发明, 但在血残留物检测上并无广泛应用, 且可靠性受到一些学者的怀疑, 认为仅根据晶体外观进行鉴定并不可靠^[33], 有的认为血红蛋白难以在文物上保存下来, 更无法与结晶试剂反应生成晶体^[33], 还有的认为析出的晶体是溶盐^[34]。

鲁米诺发光现象是一种化学反应, 其之所以遇到血迹会发光, 是因为血液中的血红蛋白含有血红素, 而血红素是含有Fe(Ⅱ )的铁卟啉化合物, 血液在物体上形成血残留物后, 血红素中的Fe(Ⅱ )会逐渐在空气中氧化为Fe(Ⅲ ), 从而催化鲁米诺的化学发光反应, 产生蓝绿色荧光, 实现检测血迹的可能^{[35, 36]}。 与鲁米诺发光现象相似, Lee等^[37]发现用一定比例的盐酸、 5-氨基水杨酸和过氧化氢混合液处理血液, 会产生血液光致发光。 但是目前该方法与鲁米诺实验均未有在文物上使用的案例, 但可以为文物血液残留物检测提供新思路。

化学法在文物血残留物分析领域上应用较早。 联苯胺实验和还原酚酞实验具有操作简便、 灵敏度高等优点, 尽管受到外界因素影响会出现假阳性, 但二者均可在一定条件下对含血液残留物的可疑样品进行快速筛选。 结晶实验尽管在文物血残留物分析上多次应用, 但其可靠性一直备受质疑。 除上述三种方法外, 一些用于刑侦上检测血痕的血液光致发光实验或许能为文物血残留物分析提供新思路。 但为了提高结果的准确性, 化学法应与其他方法配合使用。

红外光谱通过测量样品对不同波长红外光的吸收来确定其分子结构, 其作为常见分析手段, 也可用于检测残留物。 红外光谱通常提供的是物质整体化学信息, 如蛋白质酰胺区的特征吸收峰, 针对血残留物并不具备特异性。

Zhang等^[38]针对含牛血的模拟砂浆样品, 通过傅里叶变换红外光谱对样品进行表征, 在1 664和1 548 cm^-1处发现属于蛋白质酰胺Ⅰ 、 Ⅱ 区的特征吸收峰。 此外, 黄建华等^[39]通过红外光谱法采集了蛋黄、 蛋清、 皮胶、 骨胶、 鱼鳔胶参考样品的红外吸收光谱, 发现其在1 651、 1 547和1 242 cm^-1等处存在明显的共同吸收峰。 这说明红外光谱法可通过蛋白质酰胺区的特征吸收峰快速而准确地检测蛋白质, 但无法确认此蛋白质来源于血液中的血红蛋白。

X射线荧光光谱根据不同元素具有不同特征波长的X射线进行定性分析, 特征X射线强度与元素含量正相关, 据此可以进行定量分析^[40]。

蔡军等^[41]利用手持X射线荧光光谱分析了南京大学博物馆收藏的《大方便佛报恩经残卷》朱书和血书。 该血书距今一千三百多年, 尽管血红蛋白分解, 但残留的铁元素并不会减少, 通过检测朱书与血书字迹汞元素和铁元素的相对含量, 发现朱书含有较高的汞含量, 而血书中颜色较浅的字迹铁元素含量较高, 但其中部分字体颜色差异较大, 经过检测发现深颜色字体系经朱砂修补, 这也是首次使用该方法对经书字迹成分进行鉴定研究。

尽管血红蛋白中存在铁元素, 但是铁元素的存在并不能说明文物有血迹残留, 往往需要结合文物背景或者与其他光谱方法互相佐证。

紫外吸收光谱能提供物质分子中生色团及助色团的特征信息, 如果物质组成发生的变化没有影响生色团和助色团, 就不会显著地影响原物质的吸收光谱。

谢济运等^[42]首次研究了血液、 红细胞、 白细胞和血清的光谱特性, 其中发现全血、 红细胞的紫外-可见吸收光谱均在417.6 nm处具有强烈吸收峰。 丘家杵等^[43]利用紫外-可见吸收光谱探究了4组健康人固体血红蛋白的谱学特征, 发现在277 nm附近的吸收峰由血红蛋白氨基酸残基的共轭发色团吸收紫外光而产生, 411 nm处的吸收峰则归属于三价铁血红素的特征吸收峰, 而536及576 nm处吸收峰主要和血红蛋白与氧气结合有关。

虽然紫外-可见吸收光谱尚未有应用于文物血残留物分析的案例, 但从其分析原理和在其他领域的成果来看, 该方法在文物血残留物分析中具有较大的应用前景。

高光谱技术主要建立在针对连续窄波段范围(从可见光到近红外甚至短波红外)的分析研究上, 以得到更多光谱信息。 庄园等^{[44, 45]}利用高光谱成像技术对不同种类血潜手印本进行无损提取和种属分析, 结果表明此方法可用于无损检测血迹种属并显现残留血迹, 不同种类的血痕区分率在70%以上且灵敏度较高。 目前高光谱已在埃及象形文字识别^[46]、 彩绘文物图像识别^[47]以及纸质文物灰痕检测^[48]中使用, 尽管目前高光谱尚未应用于文物血液残留物分析, 但近红外反射高光谱成像技术已被应用于刑侦上的血迹检测^[49]。 由此可见, 高光谱成像技术在应用于文物血液残留物检测方面前景巨大。

拉曼光谱主要用于分子结构的研究。 在血残留物检测方面, 拉曼光谱灵敏度较高, 分析速度快, 并且其对于样品前处理的要求较为简单, 节省了一定的时间。

拉曼光谱在检测文物血残留物的中已有应用, 如Fraser等^[50]针对底特律艺术学院收藏的非洲Komo mask上的涂层, 通过拉曼光谱研究涂层中血液的存在, 发现样品的拉曼光谱产生两个强带: 1 588 cm^-1可归属为血红素卟啉环拉伸振动特征吸收峰, 1 336 cm^-1处的较宽谱带可归属为吡咯环拉伸振动吸收峰。 仅通过拉曼光谱证明卟啉环的存在而推断血残留物的存在, 其说服力有限, 但仍说明拉曼光谱可以在针对文物血残留物进行定性分析方面具有较大潜力。

质谱是一种通过测量离子质荷比确定被测物成分的分析测试方法, 兼具高特异性和高灵敏度。

Fraser^[50]等针对对来自Komo面罩的涂层的小块样品, 通过实时直接分析质谱进行表征。 在m/z=644.212处观察到全甲基化血红素的清晰信号, 证实面罩上的涂层存在血红素, 并将结果与拉曼光谱比对, 判断面罩表面涂层存在血液。

色谱利用固定相吸附剂对样品组分的不同吸附力实现分离。 气相色谱可高效分离和鉴别有机化合物。 Loy等^[16]针对以色列塔本洞穴中90 000年前的石器上残留物, 使用高压液相色谱对初筛样品进行分析, 将老化6年的干燥鹿血作为对照样品, 根据血红蛋白和血清蛋白不同的保留时间, 与石器样品谱图对比, 发现四件样品存在血液残留物: 血红蛋白、 血清蛋白。

色谱与质谱结合可提高鉴别的准确性。 因此, 在实际的分析检测中, 色谱往往与质谱联用。 杨璐等^[51]通过气相色谱-质谱联用对皮胶、 鸡蛋、 牛奶、 血料四种胶料参考样品进行了氨基酸组成分析, 发现血料具有丝氨酸与脯氨酸比值较高且不含羟脯氨酸的组成特征。 这一特征有望成为判断存在血料的依据。 Ma等^[52]针对圆明园中木构画样品采用气相色谱-质谱进行分析, 在第一层和第五层的样品中发现了蛋白质的存在, 随后将第一层及第五层样品氨基酸色谱图与血液标准样的色谱图进行比较, 发现木构画第一层样品的氨基酸分布与血液标准样品完全相似, 而在第五层样品的色谱图中, 仅前五种氨基酸分布与血液标准样品的相似, 因此认为木构画样品第一层含有血液, 而第五层可能由于降解或其他原因, 暂时无法确认血液存在。 付迎春等^[53]通过在线甲基化水解-裂解气相色谱/质谱分析古代壁画、 彩绘等文物常用的胶结材料, 发现猪血的含氮裂解产物与蛋清相似, 但猪血除了含吲哚类、 血/蛋清标记物、 磷酸三甲酯、 脯氨酸类化合物外, 还含有蛋清所不具备的胆固醇化合物。 王娜等^[54]通过热裂解-气相色谱/质谱分析故宫旧藏填漆夔龙纹长方桌表层灰胎, 发现其裂解产物组分与猪血和蛋清类似且检测到胆固醇类物质, 从而排除蛋清的可能。 因此, 推测该文物表层灰胎中含有猪血。

此外, 还有学者将化学法与气相色谱-质谱结合对考古样品进行研究, 使用过氧化氢和联苯胺实验对样品初筛, 根据阳性反应再使用气相色谱和质谱联用对样品进行分析, 确认来自维也纳世界博物馆的中国雕漆屏风底层样品中存在猪血^[20]。 Rao等^[55]针对圆明园、 清东陵和太原夫子庙的三个灰浆样品进行了分析, 使用考马斯亮蓝对样品染色寻找可能存在蛋白质的区域, 红外光谱确证了三种砂浆中均含有蛋白质, 通过液相色谱串联质谱进行分析, 分别鉴定出清东陵和太原夫子庙的砂浆样品含有牛血和猪血。

谱学分析方法能提供较为准确、 精细的结果, 但测试费用昂贵, 测试流程复杂, 耗时较长, 也不能像化学法一样在短时间内获取到实验结果, 且单一使用某种仪器, 如X射线荧光光谱、 红外光谱等说服力有限, 需要综合利用多种仪器进行相互佐证。