试验地点位于黑龙江省海伦市中国科学院海伦农业生态实验站(47° 26'N, 126° 38'E), 土壤为发育于第四纪黄土母质的黑土, 温带大陆性季风气候, 年平均气温1.5 ℃, 年降雨量500~600 mm。 该地区地下水深度为20~30 m。

试验布设于2001年5月, 采用大豆-玉米轮作种植方式。 设置了5个施肥处理, 每个处理3次重复, 随机区组排列, 处理分别为: (1)不施肥(CK)、 (2)施氮磷钾(CF)、 (3)施氮磷钾+低量有机肥M1(OM1)、 (4)施氮磷钾+中量有机肥M2(OM2)、 (5)施氮磷钾+高量有机肥M3(OM3), 具体施肥量见表1。 氮肥、 磷肥及钾肥分别施用尿素、 磷酸二铵和硫酸钾。 有机肥为纯腐熟猪粪, 有机质含量为597.6 g· kg^-1。 有机肥于每年秋收后施撒于地表, 使用旋耕机还田。 小区面积为67.2 m²。 2022年8月采集土壤样品, 供试作物为大豆, 采样深度为0~20 cm土层。 每个土壤样品代表各小区5个采样点的混合样, 将所有采集的土壤样品带回室内后, 置于通风处自然风干, 在风干过程中将原状土沿土壤颗粒的自然面掰成直径为10~12 mm大小的颗粒, 并除去肉眼可见的根系、 植物残体等, 保存备用, 后续测试每个土壤样品重复3次。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验小区大豆和玉米施肥量(kg· hm-2) Table 1 Chemical fertilizer application of maize and soybean in experimental plots (kg· hm-2) 作物 N P2O5 K2O 有机肥 M1 有机肥 M2 有机肥 M3 玉米 120 60 30 7 500 15 000 22 500 大豆 20.25 51.75 30 7 500 15 000 22 500

表1 试验小区大豆和玉米施肥量(kg· hm-2) Table 1 Chemical fertilizer application of maize and soybean in experimental plots (kg· hm-2)

1.3.1 土壤团聚体湿筛分级

采用湿筛法进行团聚体分级, 称取风干土样100 g均匀筛分在0.053、 0.25和2 mm组成的自动振荡套筛中, 用蒸馏水在室温条件下浸润5 min后, 以30次min^-1的速度上下自动筛分2 min, 振幅为3 cm。 筛分完成后, 将每层筛上的团聚体分别冲洗到对应烧杯中, 获得> 2、 2~0.25、 0.25~0.053和< 0.053 mm四种不同粒径的团聚体。 将烧杯中的团聚体置于50 ℃条件下烘干称重, 计算黑土各粒径团聚体的百分含量。

1.3.2 土壤团聚体DOM提取

将3 g团聚体土壤与30 mL去离子水共同振荡24 h(180 rpm· min^-1, 25 ℃), 离心15 min(3 500 rpm· min^-1), 上清液通过0.45 μ m滤膜进行过滤, 上清液为DOM。

1.3.3 DOM光谱指标测定

DOM溶液采用TOC分析仪进行浓度测定, 将DOM溶液稀释至10 mg· L^-1。 采用三维荧光光谱仪测定DOM荧光光谱。 激发波长(excitation, Ex)扫描范围为200~600 nm, 带宽为10 nm; 发射波长(emission, Em)扫描范围为200~600 nm, 带宽为5 nm; 扫描速度为1 200 nm· min^-1。

1.3.4 土壤有机碳矿化相关指标测定

用喷雾瓶均匀地喷洒去离子水将土壤含水量调至最大田间持水量(WHC)的60%, 在恒温培养箱内25℃下预培养7天(用于平衡土壤微生物)。 称取土壤放入120 mL试样杯中, 并将其放入750 mL的玻璃瓶中。 采集气体前打开玻璃瓶通气30 min, 使瓶内气体与空气充分交换, 然后用注射器抽取10 mL气体存于顶空进样瓶中作初始气体待用分析。 密封培养瓶1小时后, 反复推拉注射器(不扰乱土壤)混匀瓶中气体后采集样品存于顶空进样瓶中。 采集完成后打开培养瓶30 min, 使内外气体气压平衡, 然后密封培养瓶。

气体样品采用气相色谱仪(Agilent Technologies 7890B)分析测定CO₂浓度, CO₂气体排放通量(F)按式(1)计算:

F=ρ×Vm×ΔcΔt×273T×α(1)

式(1)中: F为CO₂排放通量(mg· kg^-1· h^-1); ρ 为标准状况下气体的密度(CO₂为1.98 kg· m^-3); V是培养瓶上部有效空间体积(L); m为土干重(g); Δ c/Δ t为在一特定时间内的气体浓度变化速率; T为绝对温度; α 为CO₂换算到C(12/44)的转换因子。

有机碳累积矿化量(M)按式(2)计算

$M=\sum \frac{F_{i+1} \ + F_{i}}{2} \times\left(t_{i+1}-t_{i}\right) \times 24$(2)

式(2)中: M为累积矿化量(CO₂, mg· kg^-1); i为采样次数; t为采样时间(d)。

采用Excel 2020进行数据整理, 采用SPSS 22.0、 单因素方差分析(ANOVA)和Duncan进行各处理间的差异性分析。 相关性分析采用Person相关系数计算。 采用Origin 2018进行绘图。 使用MATLAB 2014b中的DOM Fluor工具箱进行三维荧光光谱的平行因子分析, 并计算光谱指标(表2)。 采用AMOS进行结构方程模型建构。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 三维荧光光谱指标的意义 Table 2 Three-fluorescence spectrum parameters indication 光谱指数 计算公式 指示意义 荧光指数 FI FI=Ex=370 nm/ Em450, 500 nm FI< 1.4表征植物来源; 1.4< FI< 1.9表征植物和微生物来源; FI> 1.9表征微生物降解产物 自生源指数 BIX BIX=Ex=310 nm/ Em380, 430 nm 0.7< BIX< 1.0表征DOM有较强的自生源特征; BIX> 1.0表征自生源特征主要来自于微生物 腐殖化指数 HIX HIX=Ex254 nm, SEm 435~480 nm/ SEm 300~345 nm 表征DOM腐殖化程度

表2 三维荧光光谱指标的意义 Table 2 Three-fluorescence spectrum parameters indication

与CK处理相比, > 2和2~0.25 mm团聚体粒径分布在不同处理间差异显著(p< 0.05)(图1)。 > 2和2~0.25 mm团聚体的粒径分布比例均随着有机肥施用量的增加逐渐升高, OM1、 OM2和OM3处理的> 2 mm团聚体分布比例较CK分别显著增加了5.2%、 10.2%和11.9%(p< 0.05); 2~0.25 mm团聚体分布比例也分别显著增加了4.3%、 6.2%和8.4%(p< 0.05)。 这表明相比于CK处理, 有机肥中含有的木质素、 多糖、 蛋白质等可以作为胶结剂, 更有利于改善土壤颗粒间的附着力, 从而显著增加大团聚体在土壤中的分布比例^[9]。 对于0.25~0.053 mm团聚体, 与CK处理相比, CF、 OM1、 OM2和OM3处理的分布比例分别增加了20.7%、 14.7%、 5.2%和1.1%(p< 0.05)。 随着有机肥施用量的增加, 0.25~0.053 mm团聚体的分布比例逐渐降低, 而< 0.053 mm团聚体分布比例在不同施肥处理间无显著差异(p> 0.05)。 这表明有机肥施用促进了土壤团聚体向较大粒径的转化, 这有利于土壤团聚体的稳定性提升^[7]。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 有机肥施用对土壤团聚体粒径分布的影响 注: 柱上不同小写字母表示同一粒径不同处理间差异显著(p< 0.05), 下同Fig.1 Effect of organic fertilizer application on particle size distribution of soil aggregates Note: Different lowercase letters on the column indicate significant difference between different treatments of the same particle size (p< 0.05), the same below

根据PARAFAC, 在土壤团聚体衍生的DOM中识别到了三种荧光组分, 分别是C1组分(Ex/Em=240, 285 nm/365 nm)、 C2组分(Ex/Em=210 nm/410 nm)和C3组分(Ex/Em=245 nm/420 nm)(图2)。 C1组分是类蛋白质物质, 包含了2个激发峰和1个发射峰, 对应着传统的T峰。 有研究表明可溶性的微生物副产物和类蛋白质组分可以作为腐殖化的有机前体, 类蛋白质组分的减少有利于腐殖质的形成^[10]。 C2组分是类胡敏酸物质, 主要为陆源腐殖物质, 分子量较高, 分子结构相对复杂, 不易被微生物利用。 因此类胡敏酸组分常可以改变土壤物理和化学性质, 特别是对于土壤团聚体的形成^[11]。 C3组分代表了类富里酸物质, 对应传统的F峰(Ex/Em=240~370 nm/400~530 nm)。 C3组分是易氧化和生物可利用的脂肪族化合物, 腐殖化程度较低, 可作为肥料供应的重要指标^[12]。 C2和C3组分荧光峰的产生与DOM中的芳香性物质有关, 也与羧基、 羟基等含碳官能团密切相关。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 有机肥施用对土壤团聚体DOM组分的影响Fig.2 Effects of organic fertilizer application on DOM components of soil aggregates

有机肥施用对土壤团聚体DOM的PARAFAC的最大荧光强度也产生了显著性影响(图3)。 结果显示, 在土壤各粒径团聚体中, C3组分荧光强度最高(822.7~1 498.4), 其次是C2组分荧光强度(745.8~1 724.6), C1组分荧光强度最低(324.3~1 018.3)。 随有机肥的施用微生物活动增强, 其中小分子量的DOM被降解, 这会导致芳香性的DOM快速积累, 从而提高了C2和C3组分荧光强度^[13]。 另外, 不同粒径团聚体DOM的各组分荧光强度之间有显著差异(p< 0.05), C2和C3组分荧光强度随着土壤团聚体粒径的增大而逐渐增大, 表现为(> 2 mm)< (2~0.25 mm)< (0.25~0.053 mm)< (< 0.053 mm)。 相反, C1组分荧光强度在< 0.053 mm团聚体中最高, 在2~0.25 mm团聚体中最低。 这表明有机肥施用增加了大团聚体DOM中类富里酸和类胡敏酸物质的逐渐积累, 同时提升小团聚体DOM中类蛋白质组分的积累。 DOM的荧光组分在一定条件下可以发生转化, 结构简单、 腐殖化程度低的类蛋白质组分可以通过缩合反应形成结构复杂、 腐殖化程度高的类胡敏酸组分, 并且类胡敏酸组分可以在分解后形成类蛋白质组分^[14]。 此外, 有机肥增大了DOM的微生物活性促进了微生物副产物分解成更小的分子单体。 随后, 这些单体发生聚集, 形成了更稳定蹬类富里酸和类胡敏酸物质。 通常粒径较小的团聚体中具有较高的微生物量和微生物活性, 能够促进有机物降解, 从而衍生结构相对简单的DOM, 这解释了本文中小团聚体中类蛋白质荧光含量更高的原因^[15]。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 有机肥施用对土壤团聚体DOM荧光强度的影响Fig.3 Effects of organic fertilizer application on DOM fluorescence intensity of soil aggregates

FI值可以用来表征DOM的来源(图4)。 FI< 1.4以陆地源输入为主, FI> 1.9以微生物源为主^[16]。 本研究中, 不同处理下土壤各粒径团聚体DOM的FI均在1.4~1.9间, 这表明本研究中的DOM由外源输入和微生物代谢降解产物共同贡献。 不同处理间土壤团聚体DOM的FI值存在显著差异(p< 0.05), 表现为OM3> OM2> OM1> CF> CK。 这表明有机肥施用后土壤各粒径团聚体DOM的微生物源特征显著提升。 此外, 不同粒径土壤团聚体DOM的FI值也有显著差异(p< 0.05), 表现为(> 2 mm)< (2~0.25 mm)< (0.25~0.053 mm)< (< 0.053 mm), 这表明了小粒径团聚体微生物源特征更显著。 BIX可以表征DOM的自生源贡献比例^[14], 较低的BIX表示主要以微生物源的DOM为主(BIX< 0.8)。 CF和OM处理的各粒径团聚体DOM的BIX> 1.0, CK处理的各粒径团聚体DOM的BIX< 0.8, 这表明未施肥处理的DOM微生物源特征明显, 而施肥处理的DOM来自于植物残体和微生物活动的共同贡献较大。 HIX可用来表征DOM的腐殖化程度, 值越大表明DOM腐殖化程度越大。 不同处理间土壤团聚体DOM的HIX值随着土壤团聚体粒径和有机肥施用量的增加而增大。 与CK处理相比, 2~0.25 mm团聚体DOM的HIX只在施肥处理后有所差异, 这表明外源有机质输入增强导致2~0.25 mm团聚体DOM中的类腐殖质物质显著升高。 可见, FI、 BIX和HIX值与荧光表征的结果一致。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 有机肥施用对土壤团聚体DOM光谱指数的影响Fig.4 Effects of organic fertilizer application on DOM spectral index of soil aggregates

有机肥施用显著影响了SOC的累积矿化量(图5)。 各处理下培养15 d时, SOC矿化量快速增加, 28 d时增加趋势减缓; 且于28 d时, 各处理的矿化量达到最大值。 这可能是因为在培养初期, 土壤微生物前期分解有机质能力强, 矿化量增加, 后期随着土壤养分的逐渐消耗, 土壤微生物呼吸减弱^[17]。 28 d时, 相比于CK处理(41.8 mg· kg^-1), CF、 OM1、 OM2和OM3处理下SOC的累积矿化量分别提升了68.2%、 87.3%、 108.0%和135.9%。 虽然第1~5 d内OM处理间SOC矿化量差异不大, 但是与OM1处理相比, OM3中含有更多的有机质, 且养分供应能力持久, 所以随着培养时间的延长, OM3处理的累积矿化量高于OM1处理下的矿化量。 这说明化肥与有机肥的配施对累积矿化量有一定积极作用, 且随有机肥施用量的增大, 作用更显著。 在SOC矿化过程中, 微生物会充分分解有机质, 同时向外释放CO₂, 在Xu等^[15]的研究中也得到了相似结论。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 有机肥施用下土壤有机碳的累积矿化量Fig.5 Accumulated mineralization of soil organic carbon under organic fertilizer application

Mantel试验表明, 土壤SOC矿化与团聚体DOM的荧光组分和光谱指数存在显著关联(图6)。 > 0.25 mm团聚体DOM的C1、 C2组分和BIX值与SOC矿化量存在显著正相关关系(p< 0.05)。 有机肥施用后, > 0.25 mm团聚体中主要以植物来源的DOM为主, 较< 0.25 mm团聚体存在更多的腐殖质组分和土壤孔隙, 增加了物质和氧气的运输, 有利于微生物活动, 从而带动有机碳矿化分解, 有利于SOC的矿化。 除此之外, < 0.25 mm团聚体中DOM的荧光组分和光谱指数均与土壤CO₂累积矿化量有显著的正相关关系, 这可能是主要是与微生物活动有关, < 0.25 mm团聚体中DOM多为微生物来源的DOM。 土壤各粒径团聚体的结构方程模型拟合度较好, 能够反映出有机肥施用下不同粒径团聚体影响土壤CO₂累积矿化量的关键因素(图7)。 总的来说, 土壤各粒径团聚体DOM的BIX值与土壤CO₂累积矿化量成正相关(p< 0.001), 表明BIX值对土壤CO₂累积排放量的关键作用。 另外, 土壤各粒径团聚体DOM的BIX值均与C1组分呈正相关(p< 0.01), 表明土壤各粒径团聚体DOM的BIX值主要受C1组分控制。

图6

Fig.6

Figure Option ViewDownloadNew Window

图6 土壤团聚体DOM结构和SOC累积矿化量的相关性分析 注: 土壤SOC累积矿化量与土壤团聚体DOM荧光组分和光谱指数关系以红色表示, 表明p< 0.01; 绿色, 表明0.01< p< 0.05; 浅灰色无明显影响, 表明p> 0.05; 线宽表示相关性的强度; 正方形的颜色为蓝色, 表示这两个因素之间存在正相关关系; 红色表示这两个因素之间的负相关性, 颜色填充表示相关性的强度Fig.6 Correlation analysis between DOM structure of soil aggregates and accumulated mineralization of SOC Note: The relationship between accumulated mineralization of SOC and the fluorescence component and spectral index of soil aggregates is shown by color lines: red, indicating p< 0.01; Green, indicating 0.01< p< 0.05; Light gray without significant effect, indicating p> 0.05; The line width indicates the strength of the correlation; The blue square indicates a positive correlation between two factors; Red square indicates a negative correlation between two factors, and color padding indicates the strength of the correlation

图7

Fig.7

Figure Option ViewDownloadNew Window

图7 SEM模型分析有机肥施用下影响土壤SOC累积矿化量的关键因素 注: * 代表p< 0.05水平上显著相关, * * 代表在p< 0.01水平上显著相关, * * * 代表在p< 0.001水平上显著相关; CO2代表SOC累积矿化量; 每个箭头上数值代表路径系数Fig.7 SEM model analysis of key factors affecting the accumulated mineralization of SOC under organic fertilizer application Note: * represents a significant correlation at p< 0.05 level, * * represents a significant correlation at p< 0.01 level, and * * * represents a significant correlation at p< 0.001 level; CO2 stands for accumulated mineralization of SOC; The value on each arrow represents the path coefficient

BIX特征主要源于生物和细菌的活动或降解^[20], 无论粒径大小, OM3处理下土壤DOM均具有最大的BIX值, 这意味着其微生物降解能力也更高。 DOM的类蛋白质组分(C1)是微生物生长底物的主要来源, 优先被微生物分解, 直接影响了微生物的活动, 这间接证明了C1与BIX之间存在的显著关联。 此外, 微生物的活动能力直接决定了SOC的矿化强弱, Zhu^[21]等报道显示, 长期施肥可以通过增加底物有效性和微生物生物量显著促进SOC矿化, 这也解释了本文中BIX对SOC矿化的突出贡献的原因。 而对于> 0.25 mm和< 0.25 mm的团聚体来说, > 0.25 mm团聚体倾向于改变粒径分布而间接影响SOC的矿化, 而< 0.25 mm的团聚体则是易于影响DOM的类蛋白质占比和BIX指数间接影响SOC的矿化。 这可能是由于> 0.25 mm团聚体的粒径分布受施肥影响较大, 而小团聚体的粒径分布几乎不被有机肥影响, 则更倾向于通过改变微生物的性质进而影响SOC的降解[图7(b)]。

DOM的降解会导致温室气体CO₂的产生, 目前对于DOM的动态变化研究逐渐得到重视。 土壤中有10%~44%的DOM可被微生物降解, 且DOM随着土地利用、 施肥等外部因素的影响表现出不同的降解率^[18]。 同时DOM的光谱学特征已被芝实存在与生物降解性的关联, 根据PARAFAC结果, DOM中类胡敏酸组分所占的比例越高, 其生物降解性越差。 而类蛋白质组分与DOM生物可利用性成正比, 其占比的升高表明生物可利用DOM的比例升高^[19]。 本研究的结果表明, 类蛋白质组分随着土壤团聚体粒径的减小在DOM中占比逐渐增加, 与累积矿化量呈现显著正相关关系。 外源有机质的输入增加了土壤中DOM的含量, 这为微生物呼吸以及代谢提供更多的活性碳源。 因此, 当有机肥施用后, 土壤微生物对外源有机质输入的响应更为强烈, 相比于CK和CF处理, 土壤DOM表现出更简单的分子结构和更高的生物降解性。 DOM结构可能是控制DOM生物降解性的重要因素, Begum等^[22]证实DOM的光谱学性质包括荧光指数和类蛋白质组分, 与CO₂排放量正相关。 本研究结果也显示随着有机肥施用, 团聚体DOM的PARAFAC组分荧光强度和BIX值的增加对于SOC矿化具有重要意义, 其中< 0.25 mm团聚体DOM中类蛋白质组分相对含量的改善对SOC矿化的贡献更加突出[图7(b)]。