甲醛灭活的RSV、 IFA和HAdV保存于哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生微生物学实验室。 样品于-80 ℃保存, 其中RSV的分装浓度为1.3× 10⁴ copies· mL^-1, IFA为2.0× 10⁴ copies· mL^-1, HAdV为1.5× 10⁴ copies· mL^-1。

实验过程如图1所示。 将12 mL 1%浓度的柠檬酸钠溶液加入400 mL硝酸银溶液(0.17 mg· mL^-1)中, 利用恒温磁力搅拌器在97 ℃下制备银纳米颗粒(Ag@cit)。 再取5 mL Ag@cit(6 500 r· min^-1, 20 min, 20 ℃)离心, 去除上清液后, 制备碘离子(1 mmol· L^-1)孵育的银纳米颗粒(Ag@INPs)。 然后, 在混合物中加入钙离子(0.01MCaCl₂· 2H₂O)制备SERS基底(Ag@ICNPs)。

图1

Fig.1

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图1 基于SERS和机器学习方法的呼吸道病毒检测示意图 (a): 增强基底的制备流程图; (b): “ 热点” 形成示意图; (c): 采用本方法获得的三种病毒的SERS图谱; (d): 结合机器学习方法对三种呼吸道病毒进行精准鉴定Fig.1 Schematic diagram of respiratory virus detection based on SERS and machine learning methods (a): Schematic illustration of the preparation process of the enhanced substrate; (b): Illustration of “ hotspots” formation; (c): SERS spectra of three viruses obtained using the described method; (d): Accurate identification of three respiratory viruses using machine learning methods

充分混匀Ag@ICNPs与样品溶液后进行SERS检测, 所用仪器是WITec Alpha 300 RA(Ulm, 德国), 激光波长为633 nm, 扫描时间为20 s, 激光功率为25 mW, 累计检测次数为1次。

在相同浓度(1.0× 10³ copies· mL^-1)下, 通过多次独立制备和检测, 获得了每种呼吸道病毒的1 000组SERS光谱。 为确保数据的多样性和代表性, 在不同的实验批次、 不同的光谱采集条件(激光功率, 扫描时间)下进行数据采集。 采用LabSpec 6对所有光谱进行基线校正和标准化, 每组1 500拉曼位移(300~1 800 cm^-1)作为机器学习的变量。 机器学习LDA、 NB、 Tree、 KNN、 SVM、 RF、 CNN分别使用R语言中的“ MASS” 、 “ klaR” 、 “ rpart” 、 “ kknn” 、 “ e1071” 、 “ randomForest” 、 “ torch” 包完成。

无标记SERS检测无需使用特异性抗体或序列标签, 同时具有灵敏性和信号稳定性。 然而, 在病毒检测中, 该技术仍需解决由于“ 热点” 与病毒大小差异导致的信号捕获困难和普适性差的问题^{[12, 16]}。 本研究通过修饰银纳米颗粒以形成高质量检测“ 热点” 来应对这些挑战。 在图2(a)中, 橙色线显示了RSV在1.0× 10³ copies· mL^-1浓度下的拉曼光谱, 未能捕获病毒信号; 蓝色线则显示了添加Ag@INPs后的SERS光谱, 虽然有病毒信号, 但信噪比差, 难以区分RSV信号与杂质信号。 为了获得高质量的病毒信号, 本研究将钙离子作为聚集剂, 加入到Ag@INPs中形成Ag@ICNPs进行SERS检测。 钙离子通过与柠檬酸盐形成稳定络合物, 使柠檬酸盐从银纳米颗粒表面脱离, 从而降低柠檬酸盐的SERS信号对病毒检测的干扰。 此外, 钙离子的正电荷能够诱导银纳米粒子聚集, 形成适合于病毒检测的高质量“ 热点” , 增强待测病毒分子的信号。 图2(a)中的粉色线展示了以Ag@ICNPs为增强基底获得的RSV SERS图谱, 与不加钙离子聚集剂相比, 病毒的信号增强较为明显, 杂峰较少, 信噪比显著提高。 对于IFA和HAdV, 我们采用相同的方法观察了其SERS特征图[图2(b, c)]。

图2

Fig.2

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	图2 病毒在不同增强体系中的SERS图谱 Ag@ICNPs的SERS图谱(灰色线); RSV (a)、 IFA (b)和HAdV (c)的拉曼光谱(橙色线)、 在Ag@INPs中的SERS图谱(蓝色线)和使用当前方法的SERS图谱(粉色线)Fig.2 SERS spectra of viruses in different enhancement systems SERS spectra of Ag@ICNPs (grey line); Raman spectra of RSV (a), IFA (b), and HAdV (c) (orange line); SERS spectra in Ag@INPs (blue line); and SERS spectra using the current method (pink line)

增强基底的表征如图3所示。 相同尺度下Ag@INPs和Ag@ICNPs的扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)图像显示, Ag@INPs在系统中均匀分布, 加入钙离子后的Ag@ICNPs明显聚集。 动态光散射(dynamic light scattering, DLS)结果表明, Ag@INPs与Ag@ICNPs的平均粒径分别为27.6和59.2 nm, 与SEM结果一致。 通过zeta电位测量, 观察到银纳米颗粒的zeta电位从-32.2 mV变为-22.9 mV, 这是由于带负电荷的银纳米颗粒与带正电荷的钙离子相互吸引从而中和了表面电荷, 电位有所下降但是依然保持良好的稳定性。

图3

Fig.3

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	图3 基底表征 运用SEM(a)和DLS(b)方法, 对Ag@INPs和Ag@ICNPs的表征结果进行比较Fig.3 Substrate characterization Comparison of the characterization results of Ag@INPs and Ag@ICNPs using SEM (a) and DLS (b) methods

运用当前方法成功捕获了RSV、 IFA和HAdV病毒颗粒的指纹图谱, 从图4(a)可以看出, 光谱中蛋白质结构(1 002 cm^-1)和核酸结构(746、 799 cm^-1)的信号峰明显, 具体峰位归属如表1所示。 RSV与IFA的SERS图谱在各峰位上相似, 但峰强度差异显著, 而HAdV的图谱与前两者差异明显。 这可能源于其结构差异。 RSV和IFA作为RNA病毒, 具有相似的糖蛋白和脂质双层结构, 导致其SERS光谱相似; 而HAdV是DNA病毒, 缺乏脂质包膜, 主要由蛋白质衣壳构成, 表面结构显著不同。 这些结构差异影响了病毒在SERS基底上的吸附状态和光谱特征, 进而导致SERS图谱的明显差异。

图4

Fig.4

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图4 基底的检测性能研究 (a)为RSV、IFA和HAdV在相同浓度(1.0× 103 copies· mL-1)下的SERS图谱; (b)— (d)分别为不同浓度下RSV、IFA和HAdV的SERS图谱; (e)— (g)分别为随机选取的200组RSV(1.0× 103 copies· mL-1)、 IFA(1.0× 103 copies· mL-1)和HAdV(1.0× 103 copies· mL-1)样品在当前方法(Ag@ICNPs)下获得的SERS图谱和色彩编码强度图Fig.4 Study on the detection performance of the substrate (a) SERS spectra of RSV, IFA, and HAdV at the same concentration (1.0× 103 copies· mL-1); (b)— (d) SERS spectra of RSV, IFA, and HAdV at different concentrations, respectively; (e)— (g) SERS spectra and color-coded intensity maps obtained using the current method (Ag@ICNPs) for 200 randomly selected samples of RSV (1.0× 103 copies· mL-1), IFA (1.0× 103 copies· mL-1), and HAdV (1.0× 103 copies· mL-1), respectively

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 病毒SERS光谱的峰位归属 Table 1 Assignment of peaks in the viral SERS spectra 拉曼位移/cm-1 峰位归属 文献 746 Adenine [18] 761 Tryptophan [19] 799 Cytosine+Uracil [19] ~857 Tyrosine [18] 868 ν OPO [20] ~884 Tryptophan [16] 924 ACN [16] ~1 002 Phenylalanine [21] 1 029 ν C— N of aromatic amines [22] ~1 097 Phenylalanine [16] 1 184 β C— H of aromatic compounds [23] 1 200 ν C— N [24] 1 219 Phenylalanine [20] 1 440 ωCH2 and sCH3 [25] 1 545 Amide Ⅱ [24] 注: ν : 伸缩; β : 面内弯曲; ω : 剪切; s: 对称振动 Note: ν : stretching; β : in-plane bending; ω : scissoring; s: symmetric vibration

表1 病毒SERS光谱的峰位归属 Table 1 Assignment of peaks in the viral SERS spectra

图4(b、 c、 d)分别展示了RSV、 IFA和HAdV的浓度依赖性SERS光谱。 即使检测浓度低至1.0× 10² copies· mL^-1, RSV、 IFA和HAdV分别在1 097、 1 002和1 029 cm^-1处的特征峰依旧明显(S/N> 3), 因此本方法的检测限低于1.0× 10² copies· mL^-1。 这一结果表明, 本方法具有较高的灵敏度, 与被称为金标准的实时荧光定量PCR方法的灵敏度水平相当^[17]。 图4(e、 f、 g)分别为利用不同批次制备的病毒样品及增强基底捕获的RSV、 IFA和HAdV的200组随机SERS图谱和色彩编码强度图, 结果显示RSV、 IFA和HAdV的SERS特征峰强度的相对标准偏差(RSD)值分别为1.00%、 0.53%、 0.64%。 为了进一步评估本方法在病毒检测中的一致性, 利用色彩编码强度图对每种病毒的200组光谱数据进行可视化处理。 从色彩编码强度图中可以清晰地看到, 绝大多数检测点的颜色变化较小, 检测结果表现出高度一致的光谱特征, 表明本方法在不同的病毒检测中都具有显著的重现性和稳定性。 此外, 色彩编码强度图中局部微弱的颜色变化可能反映了实验过程中的微小波动, 但并未对整体趋势产生显著影响, 进一步支持了本方法的一致性。

采用乙腈(acetonitrile, ACN)作为内标, 分析了三种病毒的浓度与SERS峰强度的线性关系。 图5(a、 b和c)分别为RSV、 IFA以及HAdV的浓度依赖性SERS图谱。 利用ACN在924 cm^-1处的特征峰进行归一化, 评估病毒浓度变化对病毒在特征峰位处(1 002 cm^-1)峰值强度的影响。 结果表明, 随着浓度升高, 特征峰值强度呈上升趋势, RSV[图5(d)]、 IFA[图5(e)]以及HAdV[图5(f)]的浓度均与SERS光谱强度呈良好的正相关关系, 证明了本方法在病毒定量鉴定中的可靠性和稳定性。 该方法在其他呼吸道病毒的定量分析中也显示出广阔的临床应用前景。

图5

Fig.5

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图5 病毒浓度与SERS峰强度的线性关系研究 (a)— (c)分别获得RSV、IFA、HAdV在不同浓度(2.0× 103~1.0× 104 copies· mL-1)下的SERS图谱; (d)— (f)病毒浓度变化对应的I1 002/I924值柱状图, 用均数± SD表示(n=4)Fig.5 Study on the linear relationship between virus concentration and SERS peak intensity (a)— (c) SERS spectra of RSV, IFA, and HAdV at different concentrations (2.0× 103 to 1.0× 104 copies· mL-1), respectively; (d)— (f) Bar charts of I1 002/I924 values corresponding to the changes in virus concentration, represented as mean ± SD (n=4)

传统分析方法由于样本复杂性和数据噪声, 可能难以区分高相似度的SERS光谱。 机器学习方法能够处理高维数据, 自动提取和选择关键特征, 发现数据中隐藏的微小差异, 有助于实现呼吸道病毒的高精度鉴别和高通量检测。 将SERS与机器学习方法相结合, 对三种病毒进行精准分类和预测。 在1.0× 10³ copies· mL^-1的浓度条件下, 获得每种病毒1 000组SERS光谱, 并将数据随机分为训练集和测试集(7∶ 3)。 研究了朴素贝叶斯(NB)、 决策树(Tree)、 线性判别分析(LDA)、 支持向量机(SVM)、 k近邻(KNN)、 随机森林(RF)和卷积神经网络(CNN)七种机器学习方法, 比较了其对三种病毒的识别效果。 除NB算法外, 其余六种算法在训练集和测试集上的准确率均超过99%[图6(a, b)]。 此外, CNN凭借其复杂的卷积和池化过程, 在训练集和测试集中鉴定三种病毒的准确率均高达100%[图6(c, d)]。 综上所述, “ SERS@机器学习” 技术能够高效准确地区分和预测三种病毒。

图6

Fig.6

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图6 基于机器学习的病毒分类器建立 (a), (b)在训练集和测试集上使用NB、 Tree、 LDA、 SVM、 KNN、 RF和CNN等不同的分类模型, 比较它们针对三种呼吸道病毒的预测精度; (c), (d)七种机器学习模型在训练集和测试集中鉴定三种病毒的准确性Fig.6 Establishment of a virus classifier based on machine learning (a), (b) Comparison of prediction accuracy for three types of respiratory viruses using different classification models (NB, Tree, LDA, SVM, KNN, RF, and CNN) on the training set and the test set; (c), (d) Accuracy of seven machine learning models in identifying three viruses on the training set and the test set