1995年, 美国陆军研究实验室Kaye^[25]等提出了一种荧光粒子计数器, 该计数器采用488 nm氩离子激光器作为激发光源, 此波长的荧光信号对于生物细胞中的荧光分子(如核黄素)尤为敏感。 然而, 研究表明, 该计数器虽然能够初步识别高岭土和赤铁矿, 但无法识别枯草杆菌孢子和真菌孢子。 针对这一局限, 1996年, 美国和加拿大积极联合发展激光光谱法, 旨在快速鉴别与测量生物气溶胶, 这项技术能够实现对生物气溶胶的快速识别和精准测量。 特别有代表性的是, 美国TSI公司在本世纪初推出的生物气溶胶紫外激光空气动力学粒子计数器(UVAPS)。 该计数器与液体流式细胞仪相结合, 使含有颗粒的样品流通过单个选定波长的聚焦光束, 使鞘气流包裹样品流, 确保样品流在探测区域保持未分散状态^[26], 从而提高了测量的准确性和效率。 其早期原型为空气动力学粒度仪(aerodynamic particle size analyzer, APS), 如图1所示^[27]。

图1

Fig.1

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图1 空气动力学粒度仪实时监测系统[27] (a): APS原型布局示意图; (b): APS原型光路示意图; (c): 示波器跟踪系统信号(顶部轨迹是APS用于飞行时间测量的信号脉冲对, 中间迹线是用于接受荧光信号的定时窗口, 底部迹线是来自1.0 μ m荧光染色胶乳颗粒的荧光信号)Fig.1 Real-time monitoring system of APS[27] (a): APS prototype layout diagram; (b): APS prototype optical path diagram; (c): The oscilloscope traces the system's signals (the top trace represents the signal pulse pairs used by the APS for time-of-flight measurements, the middle trace is the timing window for receiving fluorescence signals, and the bottom trace is the fluorescence signal originating from 1.0 μ m fluorescently stained latex particles)

APS使用325 nm氦镉激光束来激发含有NAD(P)H的荧光团, 其荧光检测范围为420~580 nm, 以此探测粒子的荧光特性。 同时, 该系统还采用633 nm氦氖激光束来探测粒子的形状, 被照射颗粒的发射光通过光电倍增管(PMT)进行收集。 对于每个被检测到的颗粒, 系统电子设备会根据APS荧光信号的幅度来测量其空气动力学颗粒尺寸, 并将这些数据实时在线传输到计算机。 因其APS具有高精度特性, 至今仍然是各国在生物气溶胶单粒子在线监测设备校准方面的首选工具。

2015年, 芬兰坦佩雷理工大学提出了名为BioScout的生物气溶胶探测器^[28], 该探测器采用405 nm二极管激光器作为激发源, 其激发功率在200 mW, 可测量粒径在0.3~5 μ m之间的单个气溶胶颗粒的自发荧光和光学粒径。 如图2所示, 椭圆镜负责收集这些颗粒的自发荧光和散射光, 并将它们聚焦在两个光电倍增管(PMT)上。 其中, PMT(SC)用于收集散射光, PMT(FL)用于收集自发荧光。 为了将自发荧光和散射光分离, 系统使用分束器和442 nm长通滤光片, 并通过PMT记录荧光在16个通道中的分选结果。 研究结果显示, 与UV-APS系统相比, BioScout在检测雾化真菌孢子、 细菌孢子和常见生化物质时, 展现出了更高的荧光颗粒检测效率。 这一发现表明BioScout在生物气溶胶监测领域具有显著的优势和潜力。

图2

Fig.2

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	图2 BioScout的工作原理[28]Fig.2 Working principle of BioScout[28]

2005年, 英国赫特福德大学Kaye等^[25]首次提出(wideband integrated bioaerosol spectrometer, WIBS)双波长紫外氙灯生物气溶胶仪, 该仪器利用紫外氙灯激发单颗粒气溶胶的本征荧光。 相比紫外激光器, 紫外氙灯可以精确选择特定的紫外光波长, 从而显著地提高对常见生物气溶胶(色氨酸、 NADH)测量的准确度, 并降低了设备成本。 该设备内置两个紧凑且成本效益高的紫外氙灯, 分别在280和370 nm的波长下激发粒子荧光。 其中, 280 nm波长用于激发含有色氨酸的荧光基团, 而370 nm波长用于激发含有NADH的荧光基团。

近年来, WIBS系列推出了新版本— WIBS-4A, 它在设计上进行了优化, 特别是单一增益设置的改进, 使得仪器能够选择性地评估粒径在0.5~20 μ m之间的颗粒。 WIBS-4A利用层流传输系统, 确保气溶胶粒子逐一且稳定地通过光学探测区域。 此外, 它还配备了一个635 nm的连续波二极管激光源, 用于照射通过探测区域的粒子。 当粒子通过激光束时, 光电倍增管(PMT)检测向前散射光, 以评估粒子的形状特征。 同时, 两个脉冲式紫外氙灯激发粒子中的本征荧光, 产生具有特征性的荧光信号, 这些信号在两个不同的波长范围内被精确探测。 最终, 收集到的数据会通过如层次聚类分析(HACA)等先进的数据处理方法进行深度分析, 进而实现对生物气溶胶的有效识别和分类^{[29, 30]}。 这些测量和分析工作为深入理解生物气溶胶在大气中的分布模式、 来源追踪及其对环境和人类健康的潜在影响提供了重要信息。

2019年, 美国朗蒙特公司基于WIBS仪器, 成功开发了一种升级设备— — 光谱强度生物气溶胶传感器(spectral intensity bioaerosol sensor, SIBS)^[31], 该设备具备高分辨率荧光测量强度功能。 SIBS与WIBS共享关键设计组件, 能够记录每个粒子的32个荧光通道, 以提供详尽的光谱信息, 并且新增了检测颗粒荧光寿命的能力。 这一创新弥补了UV-APS和WIBS因其宽发射探测带而在不同尺寸生物气溶胶分类上存在的精确度不足问题^[32]。

SIBS采用双激发波长(λ _ex1=285 nm和λ _ex2=370 nm), 并在这两个激发波长下, 通过16个通道(λ _em=298~735 nm)提供尺寸、 形状和光谱分辨荧光的综合测量, 从而显著提升了对生物气溶胶颗粒的检测能力。 2020年, 英国克兰菲尔德大学Nasir等^[7]利用SIBS进行了污水处理厂的实时监测与表征。 研究发现, 在污水处理厂的荧光光谱中, 荧光强度随着颗粒尺寸的增强而增强, 这一特征在背景光谱中并未出现。 这一发现证实了SIBS通过其光谱分辨荧光功能, 能够可靠地提供废水处理过程中产生的生物气溶胶排放的生物荧光团信息, 从而具备在时间尺度上更准确地表征生物气溶胶的潜力。

随着LED技术的不断进步, UV-LED诱导的荧光技术因其低功耗、 便携性和小型化的优点, 正在积极开发以替代传统的激光诱导荧光方法^[33]。 2020年, 韩国国防科技局设计了一种手持式生物颗粒物监测系统^[34], 该系统由光学模块和信号处理控制核心模块构成。 在光学模块中, UV-LED被作为激发源, 照射生物颗粒产生散射和荧光信号, 随后, 这些信号被送入信号处理控制模块进行精细处理, 以准确判定生物颗粒的存在。 为了验证该系统的性能, 研究团队使用非荧光聚苯乙烯乳胶颗粒(PSL)、 海藻糖、 荧光聚苯乙烯乳胶颗粒(FPSL)和含有1~3 μ m大小的蜡状芽孢杆菌孢子的样本进行了一系列实验, 结果显示, 该系统不仅能够实时监测空气中的生物颗粒, 还展现出了低功耗与高荧光效率的特点。 此外, 关于其他采用荧光法的在线监测设备, 其详细信息已汇总于表1中, 本文不再逐一展开说明。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 其他基于荧光法的在线监测设备 Table 1 Parameters of online monitoring equipment using fluorescence methods 文献 年份 研究机构 设备 激发光源 光源 类型 采集系统 荧光光谱 采集范围 尺寸范围 样品流速/ (L· min-1) 针对荧光团 [25] 2005 英国 赫特福德 大学 WIBS2 660nm+ 280 nm+ 370 nm 二极管 激光器+ 氙灯* 2 PMT 302~ 721 nm 20 μ m~ 300 nm 0.6 色氨酸、 酪氨酸、 NADH、 核黄素等 [35] 2009 麻省理工 学院 - 808 nm+ 365 nm LED+ 二极管 PMT* 3 400~ 600 nm > 1 μ m - 酪氨酸、 NADH [36] 2010 立陶宛 维尔纽斯 大学 - 280 nm 紫外铝镓氮 LED PMT 320~ 400 nm 1 色氨酸、 孢子 [37] 2011 华盛焚海军 研究实验室 2-SPFA 785 nm+ 266 nm+ 355 nm 二极管激光 器+Nd∶ YAG 激光器 PMT* 3+ PD* 2 450~ 550 nm 1~8 μ m 0.3 孢子 [38] 2013 日内瓦 大学 655 nm+ 780 nm 二极管 激光器+ 氙闪光灯 32阳极 PMT* 2 295~ 570 nm 1~ 50 μ m 1 花粉 [28] 2015 芬兰坦佩雷 理工大学 bioscout 450 nm 二极管 激光器 PMT* 2 (16通道) > 442 nm 0.5~ 10 μ m - 色氨酸、 核黄素等 [39] 2016 波兰军事 技术大学 BARDet 375 nm 固体激光器 PMT* 2 (32通道) 400~ 650 nm 20 μ m~ 300 nm 0.15 花粉 [40] 2019 立陶宛区域 发展研究所 Rapid-E 400 nm+ 320 nm 脉冲激光器 PMT (32通道) 400 nm+ 320 nm 0.5~ 100 μ m 2.8 花粉 [32] 2019 美国朗蒙特 SIBS 285 nm+ 370 nm 氙灯* 2 310~ 400 nm 20 μ m~ 300 nm 0.3 细菌 [41] 2022 北京理工 大学 - 808 nm+ 825 nm+ 263 nm+ 355 nm 红外激光器 +紫外脉冲 激光器 PMT (32通道) 274~ 463 nm+ 374~ 565 nm 1~ 3 μ m 0.135 色氨酸、 NADH、 核黄素 [42] 2023 上海光机所 - 405 nm 半导体 激光器 PMT* 2 420~ 620 nm > 0.5 μ m - NADH、 核黄素

表1 其他基于荧光法的在线监测设备 Table 1 Parameters of online monitoring equipment using fluorescence methods

2013年上海光学精密机械研究所赵永凯课题组研制了一款基于365 nm LED的高灵敏度生物气溶胶监测仪, 并首次探讨了其校准方法^[46]。 在校准实验中, 采用了平均直径为0.8 μ m的B800高量子效率荧光微球作为标准物, 相较于传统模拟物表现更佳。 此外, 以葡萄球菌为测试对象, 对监测仪的灵敏度进行了验证。 实验证明, 相敏检测探测器在提升监测仪检测灵敏度和信噪比方面发挥了关键作用。 该监测仪已被证实能稳定检测空气中的有害生物浓度, 最低可达1 800 cfu· L^-1。

2017年美国地球系统研究实验室Ellis Shipley Robinson^[47]等使用已知质量的荧光团研发生产尺寸可选的生物粒子, 以校准宽带集成生物气溶胶传感器(WIBS-4A)的荧光检测。 其中, 硫酸铵混合颗粒被用于评估通道1(激发波长: 280 nm, 发射波长: 310~400 nm), 而纯奎宁颗粒则用于评估通道2(激发波长: 280 nm, 发射波长: 420~650 nm)。 结果显示, 硫酸铵混合颗粒的荧光能力与粒子质量成线性关系, 纯奎宁颗粒与荧光能力无线性关系, 两种模拟物均能产生可重复的响应。 通过使用探测器增益来获得绝对响应, 能计算出给定仪器的检测限。 差分迁移分析仪可提供尺寸可选择的细小粒子, 然后构建PMT荧光信号与荧光团质量相关联的荧光校准曲线。 在采样研究中可直接比较不同仪器之间的校准曲线的偏差。

2019年军事医学科学院李劲松团队^{[48, 49]}致力于实验室生物安全的动态性和系统性的风险评估, 包括病原微生物的危害、 实验活动、 设施设备、 人员和实验方法等方面。 该团队探讨了生物粒子实时监测采样仪与Andersen 6级采样器在大气生物气溶胶监测中的效率和结果差异, 为大气生物气溶胶监测方法提供了理论依据。 实时监测采样仪每6 s记录一次空气中的生物粒子数, 而Andersen 6级采样器则通过先采样5 min, 后实验室培养来确定微生物气溶胶的菌落浓度。 研究结果显示, 实时监测采样仪采集到的生物粒子浓度范围在20~120 (pts)· L^-1, 而Andersen 6级采样器检测到的微生物气溶胶菌落浓度则集中在0.2~5 cfu· L^-1。 实时监测仪能够实时、 直观地反映空气中粒子浓度的变化, 而Andersen 6级采样器则需要较长的培养时间。 如图3所示^[48], 对比实时监测仪和Andersen 6级采样器的采样灵敏度, 实时监测采样检测到的生物粒子的浓度远高于Andersen 6级采样器检测到的菌落浓度。 因此, 说明实时监测采样具有较高的灵敏度, 能够及时反映生物粒子浓度的变化, 更适合实时监测大气生物气溶胶的本底变化规律。

图3

Fig.3

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图3 北京市丰台区, 高约30 m的屋顶; 采样10个月, 每月上、 中、 下旬采样, 每次采样分别在上午9:00、 中午13:00和下午18:00连续采样1 h[44] (a): 实时监测环境生物粒子浓度采样结果; (b): Andersen 6级环境微生物采样结果Fig.3 In FengTai District, Beijing, on a rooftop approximately 30 meters high; Sampling was conducted for 10 months, with samples collected in the early, middle, and late parts of each month; Each sampling session lasted for 1 hour continuously, conducted at 9:00 AM, 1:00 PM, and 6:00 PM respectively[44] (a): Results for real-time monitoring of ambient biological particle concentrations; (b): Results of environmental microbial with Andersen Level 6

2023年, 美国犹他州大学的Angela Peck等^[50]对低成本传感器AirU进行了评估。 这款AirU传感器能够评估粒径在0.3~10 μ m范围内的颗粒物。 他们在室内环境中使用该传感器评估空气质量, 并将其检测到的结果与参考仪器(GIRMM)的检测结果进行了比对。 评估结果显示, AirU在检测颗粒物浓度时, 倾向于低估了颗粒物的最小浓度, 而高估了颗粒物的最大浓度。 尽管如此, AirU传感器的88%的检测结果仍落在参考仪器测量结果的± 1 μ g· m^-3误差范围内。 鉴于低成本传感器(AirU)在经济成本上相较于参考仪器(GIRMM)低了几个数量级, 因此它仍然被推荐为空气质量研究中一种有用的低成本颗粒物监测工具。 然而, 为了更全面地了解AirU的性能及其在不同环境下的适用性, 仍需进一步的研究和探索AirU的性能和使用条件。 同年, 苏州计量研究院暴海霞等^[51]使用脉冲高度分析仪检测生物气溶胶探测器不同粒径档的响应电压, 响应电压与探测器的灵敏度直接相关, 通过脉冲频率曲线, 确定不同标准粒子的响应电压, 从而评估计数器的灵敏度仪器的检测能力。 研究结果显示, 通过对比未分段拟合和分段拟合的粒径档设置误差, 发现分段拟合可以更准确地反映不同粒径档的设置误差。 除了10 μ m粒径档外, 其他通道的粒径设置误差均小于ISO 21501-4标准规定的10%误差限。

2021年, 联邦计量研究所Gian Lieberherr研究团队对当时市场上销售的三款主流生物气溶胶探测器(WIBS-NEO、 Plair Rapid-E和Swisens Poleno)进行了计数效率的对比研究^[52]。 联邦计量研究所(METAS)以不同尺寸(0.5~10 μ m)、 不同浓度的聚苯乙烯(PSL)微球为标准粒子, 对比了以上三种生物气溶胶探测器的绝对计数精度, 并验证探测器对不同尺寸颗粒的检测能力及其荧光测量的准确性。 测试结果显示, 三种探测器的计数效率高度依赖于粒子的尺寸。 其中WIBS-NEO对小尺寸颗粒的计数效率极高(粒子直径0.9 μ m时, 检测效率为90%), 具备低至0.5 μ m颗粒的检测能力, 更适合用于检测小尺寸粒子, 但其性能在检测更大颗粒时显著降低。 对比来看, Swisens Poleno也更适合用于检测2 μ m内的粒子, 其中最小检测颗粒直径在0.5~1 μ m之间。 Plair Rapid-E更适合用于检测较大粒子(粒子直径10 μ m时, 检测效率为58%), 其最小检测颗粒直径在2~5 μ m之间, 并且检测性能随颗粒尺寸的增大而提高。

2021年, 张国城团队研究了荧光显微镜计数方法, 考察不同浓度、 不同粒径、 不同发射波长荧光粒子的计数效率^[53]。 通过显微镜计数法测量气溶胶的颗粒浓度, 并以此结果作为待测生物气溶胶颗粒浓度的标准值, 通过比对方法校准生物气溶胶监测仪。 结果表明, 对于粒径≥ 2 μ m的标准荧光微球, 计数效率能达到80%以上。 荧光显微镜计数方法只有产生荧光的粒子才被计数, 排除了非荧光粒子的干扰, 计数结果更加准确, 可实现对生物气溶胶监测仪的校准。 2022年, 张国城团队在前期基础上使用日立F-7000荧光分光光度计为监测仪, 采用荧光光谱法探测空气中的生物性物质, 并通过实时定量PCR法和菌落计数法检测采集瓶中的微生物, 选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为实验的微生物菌种^[54]。 研究结果显示, 生物气溶胶监测仪在采集空气中的生物颗粒时, 无法区分死细菌与活细菌, 检测的是总细菌数。 菌落计数法得到的是活的可培养的细菌浓度, 当活细菌浓度和总细菌浓度的差别较大时, 该方法不适用于气溶胶监测仪的校准。 定量PCR法检测的总的细菌浓度, 由于厂家出厂时一般以菌落计数法作为校准方法, 导致监测仪的检测结果更接近菌落计数法的浓度。 因此定量PCR检测的浓度结果远远高于菌落计数法和监测仪的结果, 相较于菌落计数更适合用于监测仪的校准。

2022年, 俄罗斯Kovbasyuk^[55]等为确定计数效率, 要求标准监测仪的计数效率为100%, 并使用该标准监测仪比对待校准的监测仪。 其中, 待校准仪器的计数效率等于待测装置测量的颗粒浓度与标准装置测量的颗粒浓度的比值。 计数效率由校准颗粒的两种尺寸决定, 第一种粒子大小应接近计数器的最小可检测颗粒尺寸, 第二种粒子大小应比第一种大1.5~2倍。 实验结果表明, 对于第一种粒子, 被测试粒子计数器的计数效率应在50%± 20%之间; 对于第二种粒子, 计数效率应在100%± 10%之间。 同年, 苏州计量研究院暴海霞^[56]等研制了一套以聚苯乙烯微球为标准物质的校准设备, 用于粒径通道为1、 3和5 μ m的粒子的校准溯源。 装置基于湿法发尘原理, 主要由气溶胶发生器、 干燥过滤系统、 粒子混匀装置三部分组成。 实验结果显示, 该设备发生的粒子在较低浓度下(400~1 000粒子· L^-1)测得的粒子浓度测量重复性均小于5.0%。 通过优化加热干燥装置和冷冻凝结干燥装置, 有效降低了小粒子对测定的干扰, 提高了5.0 μ m粒径通道的计数准确性。

2023年, 北京市计量检测科学研究院张国城团队评价了荧光法生物监测仪总粒子和荧光粒子2个荧光通道的计数效率^[57]。 选用自制的单分散、 荧光性稳定的聚苯乙烯微球悬浮液作为模拟标准物, 通过雾化悬浮液发尘, 发出粒径≤ 3 μ m的粒子, 设置两路采样口, 分别放置生物气溶胶监测仪和空气动力学粒径谱仪(APS)同时测量颗粒的数量和浓度。 结果显示, 生物气溶胶实时监测仪的总粒子的计数效率为98.9%, 荧光粒子的计数效率为98.1%。 表明搭建的评价计数效率的装置能满足评价需求, 为进一步开展相关研究提供了基础和依据。