电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂); 中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司); 100目标准筛(绍兴市上虞圣超仪器设备有限公司); 配备有ATR晶体台面的傅里叶红外光谱仪(德国Perkin Elmer公司); OPUS分析软件; OMNIC 9.2分析软件; OriginPro2021; IBM SPSS Statistics 26软件。

马钱苷标准品(纯度: 99.0%, 批号: 111640-201808)、 莫诺苷标准品(纯度: 98.4%, 批号: 111998-202205)、 熊果酸标准品(纯度: 99.9%, 批号: 110742-201823), 均购自中国食品药品检定研究院。

实验选取三个省份(河南、 浙江、 陕西)七个产地共30批次山茱萸药材。 详细信息见表1。 样品经河南中医药大学董诚明教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 药材信息表 Table 1 Information of medicinal materials 批号 编号 产地 山茱萸szy1 S1— S4 河南栾川 山茱萸szy2 S5— S8 河南西峡 山茱萸szy3 S9— S14 陕西丹凤 山茱萸szy4 S15— S18 陕西佛坪 山茱萸szy5 S19— S22 陕西商洛 山茱萸szy6 S23— S26 陕西周至 山茱萸szy7 S27— S30 浙江临安

表1 药材信息表 Table 1 Information of medicinal materials

1.4.1 样品处理

将30批山茱萸样品置于55 ℃烘箱中^[5]30 min, 粉碎机粉碎, 过100目标准筛。 扫描红外光谱之前, 将其置于玛瑙研钵中, 在烤灯下保持干燥条件将粉末研细。

1.4.2 光谱采集

分别取30批山茱萸样品粉末, 测量背景图谱, 以排除空气中二氧化碳和水的干扰。 采用压粉末法利用ATR晶体台进行数据采集。 傅里叶红外光谱仪的仪器条件: 扫描范围为: 4 000~400 cm^-1, 分辨率为: 4 cm^-1, 扫描次数为: 16次, 单个样品重复扫描20次。

1.4.3 光谱的预处理

利用OMNIC分析软件对所测得的山茱萸样品谱图进行自动基线矫正、 自动平滑、 平均光谱处理、 求二阶导数等处理。 在Origin软件中对图谱进行标峰、 绘制。 基线矫正可以消除由于散射、 反射及湿度的影响。 平滑处理可以减少来自各方面因素所产生的噪声, 使谱线更加平滑, 提高信噪比。 为减少实验误差, 需要对实验的七个产地的样品光谱图进行平均光谱处理。 对光谱数据求导可以消除背景漂移所造成的影响, 一阶导数可以消除背景的常数平移, 二阶导数可以消除线性背景平移。 此外, 光谱求导也可以提高分辨率, 使重叠峰分开程度增加, 便于分析。

如图1和图2所示, 不同批次的山茱萸红外谱图总体趋势一致, 山茱萸特征峰如下: 3 300 cm^-1附近处出现的强吸收峰, 为分子间的— OH伸缩振动及— NH伸缩振动所产生的吸收峰, 主要来源于山茱萸中一些含有— OH和— NH₂的化学成分, 如多糖、 蛋白质的羟基和羟基的伸缩振动吸收。 2 937 cm^-1处出现的红外吸收, 为饱和的— CH伸缩振动所产生的, 来源于多糖、 蛋白质甲基、 亚甲基。 1 713 cm^-1处为C=O伸缩振动, 来源于醛类、 脂肪酮、 羧酸类化合物。 在1 300~1 000 cm^-1范围内有多个峰, 分别为1 294、 1 100和1 056 cm^-1, 为C— O伸缩振动所产生的峰。 920 cm^-1附近的吸收, 为成键的O— H键的面外弯曲振动, 来源于羧酸类成分。

图1

Fig.1

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	图1 三十批山茱萸药材红外光谱Fig.1 Infrared spectra of 30 batches of Corni frucutus

图2

Fig.2

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	图2 七个产地山茱萸药材及标准品红外光谱Fig.2 Infrared spectra of Corni frucutus and chemical standard products from seven origins

根据中国药典2020版, 薄层鉴别以熊果酸、 莫诺苷、 马钱苷为质量评价对照品^[2]。 将山茱萸所测光谱与熊果酸、 莫诺苷、 马钱苷等标准品的红外光谱进行对比分析(图2)。 熊果酸和山茱萸均在1 716、 1 385、 1 067、 1 465和1 380 cm^-1附近有吸收峰, 趋势一致, 分别表征羧酸、 C— H弯曲振动产生的吸收峰。 莫诺苷和山茱萸在1 445、 1 396和1 080 cm^-1附近有吸收峰, 且吸收峰趋势一致, 分别表征烷烃的C— H弯曲振动所产生的吸收峰、 酯键的吸收峰。 马钱苷和山茱萸在1 718、 1 653、 860和902 cm^-1附近有吸收峰, 且吸收峰趋势一致, 分别表征C=O伸缩振动和不饱和双键的C— H面外弯曲振动所产生的吸收峰。 不同产地的山茱萸药材原始红外图谱整体趋势一致, 所含化学成分种类基本相同, 原始光谱并不能对不同产地的山茱萸进行区分。

对7个产地山茱萸光谱进行二阶导数处理增强其差异性(如图3), 主要体现在: 2 500~2 000 cm^-1为叁键吸收区, 主要是来源于腈的C≡ N振动或者来源于炔类C≡ C振动。 在2 400~2 370 cm^-1波段范围内(图4), 陕西周至和陕西丹凤只有一个波谷, 其他五个产地均有两个波谷; 在波数2 270 cm^-1处(图4), 河南栾川、 陕西佛坪无明显波谷, 其他五个产地均有明显波谷; 在2 252~2 212 cm^-1波段范围内, 陕西佛坪有一个波谷, 浙江临安、 河南栾川有两个波谷, 河南西峡、 陕西周至、 陕西丹凤、 陕西商洛有三个波谷; 2 210~2 000 cm^-1峰强有些微差别, 峰位、 峰形无明显差别。

图3

Fig.3

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	图3 七个产地山茱萸二阶导数光谱(4 000~500 cm-1)Fig.3 Second derivative spectra of Corni frucutus from seven origins (4 000~500 cm-1)

图4

Fig.4

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	图4 七个产地山茱萸二阶导数光谱(2 500~2 000 cm-1)Fig.4 Second derivative spectra of Corni frucutus from seven origins (2 500~2 000 cm-1)

在波数1 636 cm^-1处(图5), 河南西峡、 陕西丹凤、 陕西商洛、 陕西周至、 浙江临安均有小波谷, 而陕西佛坪、 河南栾川二阶导数图谱无波谷。 在1 580 cm^-1附近, 河南西峡、 陕西丹凤、 陕西商洛、 陕西周至、 浙江临安均有小波谷, 而陕西佛坪、 河南栾川二阶导数图谱无波谷; 在波数1 560 cm^-1处, 河南栾川无波谷, 其他六个产地均有小波谷。

图5

Fig.5

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	图5 七个产地山茱萸二阶导数光谱(1 800~1 500 cm-1)Fig.5 Second derivative spectra of Corni frucutus from seven origins (1 800~1 500 cm-1)

在波数1 128 cm^-1处(图6), 河南西峡有一小波谷, 而河南栾川、 陕西丹凤、 陕西佛坪、 陕西商洛、 陕西周至、 浙江临安均无波谷, 差异性显著。

图6

Fig.6

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	图6 七个产地山茱萸二阶导数光谱(1 200~800 cm-1)Fig.6 Second derivative spectra of Corni frucutus from seven origins (1 200~800 cm-1)

二维红外相关谱能够反映化学物质受到外界微扰如温度、 pH、 磁场等之后的变化, 根据对角线上自动峰的不同, 来判别不同产地中药材化学成分中化学基团及分子的相互作用, 从而达到鉴别药材的目的^{[7, 8, 9]}。

根据二阶微分后研究分析出的结果, 本研究选取2 370~2 400、 2 200~2 300和1 500~1 650 cm^-1波长范围进行二维相关红外图谱分析, 其相关峰的强度、 位置和个数存在差异。

在2 370~2 400 cm^-1波段范围内(图7), 河南栾川最强峰位置在波数2 370 cm^-1处附近, 而河南西峡、 陕西丹凤、 陕西佛坪、 陕西商洛、 陕西周至及浙江临安最强峰位置均在波数2 400 cm^-1附近。 河南栾川、 河南西峡有四个自动峰, 陕西丹凤、 陕西佛坪有两个自动峰, 陕西商洛有三个自动峰, 陕西周至和浙江临安有两个自动峰。

图7

Fig.7

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	图7 七个产地山茱萸图谱(2 370~2 400 cm-1)Fig.7 Map of Corni frucutus in seven producing areas (2 370~2 400 cm-1)

在2 200~2 300 cm^-1波段范围内(图8), 河南栾川最强峰在2 295 cm^-1附近; 河南西峡在2 265、 2 295 cm^-1处出现两个较强自动峰; 陕西丹凤在2 280 cm^-1处出现最强自动峰; 陕西佛坪在2 210、 2 285和2 295 cm^-1处出现三个较强自动峰; 陕西商洛在2 295 cm^-1处有一处强吸收峰; 陕西周至在2 265 cm^-1处有一强吸收峰; 浙江临安最强吸收峰在2 295 cm^-1处, 在2 210、 2 280 cm^-1处出现较强吸收峰。 除峰强不同外, 自动峰的个数也具有差异。 在2 200~2 300 cm^-1波段范围内河畔栾川存在六个自动峰, 陕西佛坪存在七个自动峰, 河南西峡、 陕西丹凤、 浙江临安存在八个自动峰, 陕西周至存在九个自动峰, 陕西商洛存在四个自动峰。 在1 500~1 650 cm^-1波段范围内(图9), 七个产地的最强自动峰均出现在1 615 cm^-1处附近, 但是七个产地山茱萸的自动峰个数存在差异: 河南栾川、 河南西峡和陕西佛坪在1 525、 1 570和1 610 cm^-1处存在三个自动峰; 陕西丹凤在1 525、 1 540、 1 560、 1 570和1 610 cm^-1处存在五个自动峰; 陕西商洛在1 525、 1 560、 1 570和1 610 cm^-1处存在四个自动峰; 陕西周至在1 525、 1 570、 1 590和1 610 cm^-1处存在四个自动峰; 浙江临安在1 525、 1 560、 1 570、 1 590和1 610 cm^-1处存在五个自动峰。 综上所述, 二维红外相关图谱可以直观地反映不同产地山茱萸的成分差异。

图8

Fig. 8

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	图8 七个产地山茱萸图谱(2 200~2 300 cm-1)Fig. 8 Map of Corni frucutus in seven producing areas (2 200~2 300 cm-1)

图9

Fig.9

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	图9 七个产地山茱萸图谱(1 500~1 650 cm-1)Fig.9 Map of Corni frucutus in seven producing areas(1 500~1 650 cm-1)

图7— 图9中, A为七个产地二阶导数图谱, B为河南栾川, C为河南西峡, D为陕西丹凤, E为陕西佛坪, F为陕西商洛, G为陕西周至, H为浙江临安。

主成分分析是利用方差来衡量数据的差异性, 将差异性较大的高维数据投影到低维空间中进行表示, 把多个指标数据转化为几个综合的指标, 从而简化分析的过程^[10]。 以波段1 800~600 cm^-1指纹图谱进行主成分分析, 得到不同产地山茱萸主成分特征值、 方差贡献率及累积贡献率(如表2)。 从SPSS分析运算的方差贡献率来看, 前两个主成分的累积贡献率达到96.596 09%, 因此, 对前两个主成分分析已经可以反映出山茱萸的原始光谱的基本特征。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 山茱萸红外光谱图前两个主成分累计贡献率 Table 2 The cumulative contribution rate of the first two principal components in the Corni frucutus IR spectra 主成分 特征值 方差贡献率/% 累计贡献率/% 1 484.48 77.77 77.77 2 117.31 18.83 96.60

表2 山茱萸红外光谱图前两个主成分累计贡献率 Table 2 The cumulative contribution rate of the first two principal components in the Corni frucutus IR spectra

利用Origin软件进行主成分分析图的绘制, 显示各个产地山茱萸在2D分布图中处于不同位置(图10), 其中陕西丹凤和陕西佛坪两地相似度较高, 位于第一象限; 陕西商洛和陕西周至相似度较高, 位于第二象限; 河南栾川、 河南西峡两个产地的山茱萸药材相似度较高, 位于第四象限; 而浙江临安的山茱萸与其他6个产地的山茱萸样品点距离较远差异性较大, 位于第三象限。 不同产地山茱萸药材红外光谱在散点图中的位置不同, 相互独立, 可能是由于其地域差异及山茱萸种质等所引起的, 可以通过主成分分析对不同产地山茱萸之间进行区别及分析。

图10

Fig.10

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	图10 不同产地山茱萸主成分分析图Fig.10 PCA of Corni frucutus in different regions

聚类分析是可以将数据进行分组, 将相似的数据归为同一组, 不相似的数据归为不同的组, 可以帮助分析了解数据的特征, 发现其中的关系和规律^[11]。

本研究利用SPSS对不同产地山茱萸药材的红外图谱数据进行聚类分析, 结果显示: 首先是陕西丹凤和陕西佛坪聚为一类; 陕西商洛和陕西周至聚为一类, 浙江临安一个产地聚为一类; 河南栾川和河南西峡聚为一类。 随着欧氏距离的增加, 在欧氏距离为3~11时, 可以将七个产地划分为三个表征群, 即陕西丹凤、 陕西佛坪、 陕西商洛和陕西周至划分为第一表征群, 浙江临安为第二表征群, 河南栾川和河南西峡为第三表征群。 不同产地山茱萸的聚类分析的结果与主成分分析相吻合(图11)。

图11

Fig.11

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	图11 不同产地山茱萸聚类分析Fig.11 Cluster analysis of Corni frucutus in different regions

不同产地的温度、 湿度及土壤等因素会影响山茱萸的开花和化学成分的含量^{[11, 12]}。 山茱萸为中日照植, 既耐阴又喜光, 喜湿润, 年日照1 600~2 000 h、 年降雨量800~1 500 mm均可成长, 山茱萸适宜生长在疏松且深厚、 湿度适宜、 含有丰富的各种矿物元素、 呈中性或微酸性的土壤。 结合中国气象数据网、 国家土壤信息服务平台, 收集本实验品不同山茱萸产地的生境条件, 不同产地气候因子数据见表3。 结合聚类分析和主成分分析结果显示: 环境因子中温度、 光照、 年降雨量、 土壤类型等不同, 导致山茱萸样品中化学成分的组成和含量有差异性, 其中马钱苷、 莫诺苷、 熊果酸、水溶性浸出物等含量存在明显的地域差别^{[13, 14]}。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同产地气候因子 Table 3 Climatic factors in different regions 产地 年日照 时数/h 平均温度 /℃ 年降雨量 /mm 土壤类型 河南栾川 2 103 12.0 864 褐土、 棕壤 河南西峡 2 019 15.2 830 黄棕壤、 棕壤 陕西丹凤 2 056 13.8 687 黄棕壤、 棕壤 陕西佛坪 1 727 11.6 938 黄棕壤、 棕壤 陕西商洛 2 000 12.8 700 褐土、 棕壤、 黄棕壤 陕西周至 1 993.7 13.2 700 褐土、 耧土、 黄棕壤 浙江临安 1 837.9 12.5 1 614 红壤、 棕壤、 水稻土

表3 不同产地气候因子 Table 3 Climatic factors in different regions

本实验研究采用配备有ATR晶体台的傅里叶红外光谱仪对7个产地的山茱萸药材进行中红外光谱扫描。 对山茱萸红外光谱进行导数处理及主成分分析和聚类分析, 并结合二维相关红外光谱, 最终实现对不同产地山茱萸进行鉴别。 将山茱萸七个产地平均光谱与马钱苷、 莫诺苷、 熊果酸标准品的红外全反射光谱进行对比, 熊果酸在1 716、 1 385和1 067 cm^-1处出现吸收峰, 为羧酸的特征吸收峰信号。 在1 465、 1 380 cm^-1处的吸收峰, 为C— H弯曲振动所产生的吸收峰。 莫诺苷在1 445、 1 396和1 314 cm^-1处的吸收峰, 为C— H弯曲振动所产生的吸收峰; 在1 080 cm^-1处的强吸收峰, 为酯键的吸收。 马钱苷在1 718、 1 653 cm^-1处的吸收峰, 为C=O伸缩振动所产生的峰; 在860、 902 cm^-1处的吸收峰, 为不饱和双键的C— H面外弯曲振动所产生的。 各个产地的二阶红外光谱图, 差异性波段主要在2 500~2 000、 1 800~1 500和1 200~800 cm^-1, 峰形和峰位存在差异, 用于区别不同产地山茱萸的鉴别。 对不同产地山茱萸红外光谱进行主成分分析, 结果显示2种主成分的方差累积贡献率超过95%, 陕西丹凤和陕西佛坪相似度较高, 在主成分分析2D图中位于第一象限, 并在聚类分析中聚为一类; 陕西商洛和陕西周至相似度较高, 位于第二象限; 河南栾川和河南西峡相似度较高, 分布在第四象限; 浙江临安的山茱萸红外图谱和其他六个产地的差异性较大, 单独分布在第三象限, 聚为一类。 在二维相关红外光谱分析中, 结果显示在特征峰2 370~2 400、 2 200~2 300和1 500~1 600 cm^-1处峰强和个数存在差异。 结合主成分分析、 聚类分析的结果显示环境因素等可能是影响其差异性的主要原因。