土壤样品分别为2019年、 2023年采集于河南省渑池县天池镇东天池村河南天沣农业科技股份有限公司丹参种植基地(GPS坐标北纬34° 38'35″, 东经111° 56'48″, 海拔460 m)。 天池镇属暖温带大陆性季风气候, 最高气温(7月)38 ℃, 最低气温(1月)-12 ℃, 平均气温为13 ℃; 年平均降雨量为649 mm, 主要集中在夏季(6月— 8月), 占49%~50%; 地形复杂, 小气候表现明显。 地表属洛河水系, 地表径流补给少。 土壤多为红粘土, 保水保肥能力较强, 但通透性差, 耕性不良, 适耕期短, 土地较集中连片^[12]。 丹参苗品种为丹参1号, 使用的是史丹利平衡肥, 用量为906 kg· hm^-2。 (采取黄芩和丹参轮作的方式, 丹参种植一年, 黄芩种植五年。)

按照HJ/T 166的相关规定进行土壤样品的采集和保存, 样品采集信息如表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 丹参土壤采集信息 Table 1 Salvia miltiorrhiza soil collection information 序号 样品编号 样品信息 采样与采收 间隔年限 1 CK 2019年从同一地点未种植过丹参的田埂上采集土壤样本 无 2 19-ING 上一茬丹参种植于2019年, 2019年生长期采样 无 3 19-ED 上一茬丹参种植于2018年, 2019年采收期采样 0年 4 23-ED 上一茬丹参种植于2022年秋季, 2023年采收期采样 0年 5 23-One 上一茬丹参种植于2021年, 2022年采收, 2023年采样 1年 6 23-Two 上一茬丹参种植于2020年, 2021年采收, 2023年采样 2年 7 19-Five 上一茬丹参种植于2013年, 2014年采收, 2019年采样 5年

表1 丹参土壤采集信息 Table 1 Salvia miltiorrhiza soil collection information

INVENIOS型傅里叶变换红外光谱仪(德国BRUKER公司), 配有衰减全反射(ATR)晶体台, DTGS检测器, 玛瑙研钵。 实验用水为超净水。

土壤过筛后, 采用傅里叶红外衰减全反射仪器(FTIR-ATR)扫描^[14], 仪器参数设置如下: 分辨率为4 cm^-1, 样品扫描时间32 s, 背景扫描时间32 s, 保存数据从4 000~400 cm^-1, 以空气为参比, 扣除H₂O和CO₂干涉背景后采集中红外光谱, 按照上述仪器参数进行扫描, 每个样品重复扫描20次^[11]。

用OMNIC软件依次对7个样品的红外光谱进行基线校正、 自动平滑、 平均图谱、 一阶导数处理^[11]。 为了使数据更直观, 以样品CK为标准, 将特征图谱导入OPUS软件中, 进行2D相关处理, 绘制2D相关图谱。 利用SPSS软件对以上7个样品进行聚类分析。

由7个样品的中红外光谱可知, 不同间隔年限栽培丹参土壤红外图谱的峰位和峰形相同, 除吸光度存在明显差异外, 总体趋势差异不大。 主要特征吸收峰在3 622、 3 380、 1 638、 995、 777、 693、 524和463 cm^-1处, 其中3 622 cm^-1处带有肩峰的较强且尖锐的吸收峰可表征醇类化合物中O— H伸缩振动; 3 380 cm^-1处的强宽峰可表征酚酸类成分中的酚羟基的伸缩振动; 1 638 cm^-1处强而尖锐的波峰可表征酯类和有机酸类羰基C=O的伸缩振动; 995 cm^-1处带有肩峰的强吸收峰, 可表征亚甲基的C— H键; 777 cm^-1处较弱的吸收峰可表征苯环有三个相邻氢; 693 cm^-1处最弱的吸收峰可表征苯环单取代; 524和463 cm^-1处的双弱峰可表征环状酮^{[11, 13, 14]}。 这些特征吸收峰一致, 说明土壤中均含有醇类、 酚酸类、 酯类、 环状酮类化合物。 结合焦焕然等的研究, 正茬土与非连作土中均含有酸类、 酯类、 醇类、 醛类、 醚类、 烷类等物质^[9], 与本实验光谱结果一致。 丹参刚采收的样本(23-ED、 19-ED)在特征峰处吸光度最强, 表明丹参在种植过程中酚酸、 酯类等自毒物质不断积累, 是丹参产生自毒作用的重要原因。

原始红外光谱受到分子谱峰干扰会产生峰移或不清晰的现象。 而一阶导数光谱则通过微分法, 能够提高光谱分辨率, 放大原始光谱的细微差别, 增大信息量, 将一些谱峰难以分辨的特征用更加明显的谱峰表示出来, 从而更清晰地获得样品分子结构信息^[11]。 依次对土壤样品的平均光谱进行基线校正和平滑降噪处理, 求取平均图谱和一阶导数图谱, 以样品CK为标准, 进行差异分析。

7个样品一阶导数图谱在波段4 000~2 400 cm^-1(见图2)重合度高, 差异小。 样品差异性主要体现在以下四个波段: 波段3 750~3 600 cm^-1、 波段2 170~2 145 cm^-1、 波段2 060~2 030 cm^-1、 波段530~585 cm^-1, 以样品CK为对照, 分析如下。

图1

Fig.1

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	图1 不同间隔年限栽培丹参土壤的中红外光谱(波段4 000~400 cm-1)Fig.1 Mid infrared spectra of soil cultivated with Salvia miltiorrhiza at different intervals (bands 4 000 to 400 cm-1)

图2

Fig.2

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	图2 不同间隔年限栽培丹参土壤的一阶导数图谱(4 000~400 cm-1)Fig.2 First order derivative map of cultivated Salvia miltiorrhiza soil at different intervals (4 000~400 cm-1)

在波段3 750~3 600 cm^-1中(图3), 样品CK与样品19-Five峰位和峰形相同, 均在波数3 747、 3 740、 3 730、 3 716、 3 705、 3 698、 3 685、 3 672、 3 665、 3 652、 3 644、 3 632、 3 624、 3 615和3 604 cm^-1处有吸收峰, 样品19-ED和样品23-ED峰位和峰形相似, 均在波段3 645~3 642 cm^-1处有尖锐吸收峰, 样品CK在此波段为强而宽的吸收峰; 样品19-ED、 23-ED在波数3 620 cm^-1处有波谷, 而样品CK在该处无吸收; 样品19-ING和样品23-Two趋势一致, 在波段3 680~3 620 cm^-1有连续较弱的吸收峰, 样品23-One在该波段只有一个强而宽的波; 样品19-ING、 23-Two、 23-One只在3 690和3 612 cm^-1处有强吸收峰; 样品CK在全波段3 750~3 600 cm^-1有连续不断的强而尖锐的吸收峰。 波段3 750~3 600 cm^-1对应红外光谱(图1)中醇类化合物的羟基O— H伸缩振动产生的吸收峰, 且样品23-ED在此处吸光度最强, 说明丹参在种植和轮休过程中醇类化合物存在积累效应。 而样品19-Five与样品CK最为接近, 土壤经过轮休五年, 醇类化合物不断降解, 与本底土较为接近, 达到了再次种植丹参的适宜程度。

图3

Fig.3

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	图3 不同间隔年限栽培丹参土壤的一阶导数图谱(3 750~3 600 cm-1)Fig.3 First order derivative map of soil cultivated with Salvia miltiorrhiza at different intervals (3 750~3 600 cm-1)

在波段2 170~2 145 cm^-1中(见图4), 样品19-Five、 19-ED、 23-ED峰位和峰形相似, 均在2 160 cm^-1处有强吸收峰, 在2 154 cm^-1处有强吸收谷, 在2 143 cm^-1处有弱的吸收峰, 不同的是样品CK只在2 160 cm^-1处有强吸收峰, 在2 154 cm^-1处有强吸收谷; 样品19-ING、 23-Two、 23-One均在2 161 cm^-1处有强而宽的吸收峰, 在2 150 cm^-1处有弱的波谷, 而样品CK在2 160 cm^-1处有强吸收峰, 在2 154 cm^-1处有强吸收谷。

图4

Fig.4

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	图4 不同间隔年限栽培丹参土壤的一阶导数图谱(2 170~2 145 cm-1)Fig.4 First order derivative map of soil cultivated with Salvia miltiorrhiza at different intervals (2 170~2 145 cm-1)

在波段2 060~2 030 cm^-1中(见图5), 样品CK与样品19-Five、 19-ED、 23-ED峰位和峰形相同, 均在2 053 cm^-1处有中等波谷, 在2 048、 2 035 cm^-1处有中强吸收峰; 样品19-ING、 23-Two、 23-One均在2 058 cm^-1处有较弱波谷, 在2 045和2 034 cm^-1处有弱宽吸收峰, 而样品CK在此处对应的是较强吸收峰。

图5

Fig.5

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	图5 不同间隔年限栽培丹参土壤的一阶导数图谱(2 060~2 030 cm-1)Fig.5 First order derivative map of soil cultivated with Salvia miltiorrhiza at different intervals (2 060~2 030 cm-1)

在波段630~585 cm^-1中(见图6), 样品CK与样品19-Five、 19-ED、 23-ED峰位和峰形相同, 均在623、 603和594 cm^-1处有吸收峰, 在610 cm^-1处有波谷; 样品19-ING、 23-Two、 23-One峰形和峰位相似, 均在621和590 cm^-1处有吸收峰, 在609 cm^-1处有波谷。 波段630~585 cm^-1对应红外图谱(图1)由环状酮产生的双弱峰, 说明不同间隔年限栽培丹参土壤中环状酮有差异, 表明种植丹参改变了土壤中环状酮类化合物的种类和含量。

图6

Fig.6

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	图6 不同间隔年限栽培丹参土壤的一阶导数图谱(630~585 cm-1)Fig.6 First order derivative map of cultivated Salvia miltiorrhiza soil at different intervals (630~585 cm-1)

综上所述, 丹参在种植和轮休过程中, 醇类化合物、 环酮类、 酚酸类、 酯类等物质发生显著变化。 根据一阶导数图谱升降趋势可将样品分为两大类, 一类为种植一年、 未种植、 轮休4年样品, 一类为轮休1年、 2年样品。 表明自毒物质积累需要时间, 至少种植2年后土壤才会发生质变, 进而影响作物生长。 结合焦焕然等研究, 丹参连作后12种酚酸类化合物, 3种酯类含量均有增加, 增幅为10.638%~310.811%^[9], 与本实验结果一致。 其中苯甲酸、 硬脂酸甲酯、 2-乙基己醇、 酚酸二甲酯、 磷酸异葵基二苯酯, 酞酸二甲酯等物质对丹参苗的生长表现出强抑制作用, 且抑制作用与物质浓度成正相关关系; 邻苯二甲酸、 苯甲酸乙基己酯、 2, 4-二叔丁基苯酚等物质对丹参苗生长同样具有强效的抑制作用, 但与物质浓度无关; 邻苯二甲酸二异丁酯、 肉豆蔻酸异丙酯对丹参生长表现出低浓度促进, 高浓度抑制的作用。 总体来看, 丹参在种植过程中, 酚酸类和酯类物质均存在积累效应, 增强对丹参植株生长的抑制作用, 是致使丹参连作障碍的潜在原因。

2D相关图谱是一种通过绘制红外吸光度等高线, 在第二维度上展开的红外光谱。 使重叠峰或者是不明显的小峰清晰地显示出来, 将不显著的微小变化放大。 将一阶导数图谱导入OPUS软件中, 以未种植过丹参的土壤(样品CK)为标准, 进行2D相关分析。 根据上述一阶导数图谱的差异性分析, 选取特征波段3 750~3 600和2 170~2 145 cm^-1两个波段。

在波段3 750~3 600 cm^-1中(图7— 图14), 样品CK与样品19-Five波峰的分布和颜色相同, 均在(3 625, 3 675)、 (3 650, 3 675)、 (3 650, 3 650) cm^-1有凸形吸收峰, 在(3 720, 3 675)、 (3 720, 3 650) cm^-1处有双强峰。 样品19-ING、 23-Two、 23-One波峰的分布和颜色相同, 均在(3 720, 3 675)、 (3 720, 3 650) cm^-1有单强峰, 而样品CK在此处为双强峰。 样品19-ED与23-ED波峰的分布和颜色相同, 波峰与波峰之间为绿色吸光度等高线, 而样品CK为黄绿色。

图7

Fig.7

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	图7 七个样品一阶导数图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.7 First derivative spectra of seven samples (Band 3 750 to 3 600 cm-1)

图8

Fig.8

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	图8 样品CK 2D相关图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.8 Sample CK 2D correlation spectrum (Band 3 750 to 3 600 cm-1)

图9

Fig.9

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	图9 样品19-Five 2D相关图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.9 2D correlation spectrum of sample 19-Five (Band 3 750 to 3 600 cm-1)

图10

Fig.10

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	图10 样品19-ED 2D相关图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.10 Sample 19-ED 2D correlation spectrum(Band 3 750 to 3 600 cm-1)

图11

Fig.11

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	图11 样品19-ING 2D相关图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.11 2D correlation spectrum of sample 19-ING(Band 3 750 to 3 600 cm-1)

图12

Fig.12

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	图12 样品23-Two 2D相关图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.12 2D correlation spectrum of sample 23-Two (Band 3 750 to 3 600 cm-1)

图13

Fig.13

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	图13 样品23-One 2D相关图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.13 2D correlation spectrum of sample 23-One (Band 3 750 to 3 600 cm-1)

图14

Fig.14

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	图14 样品23-ED 2D相关图谱(波段3 750~3 600 cm-1)Fig.14 2D correlation spectrum of sample 23-ED (Band 3 750 to 3 600 cm-1)

在波段2 170~2 145 cm^-1中(图15— 图22), 样品19-ING、 23-Two、 23-One吸光度等高线较为圆润密集, 峰形较为平缓和规则, 而样品CK吸光度等高线较为稀疏, 波峰棱角分明。 样品19-ED与23-ED波峰的分布和颜色相同, 吸光度等高线呈密集三角形, 波峰呈三棱锥形, 而样品CK吸光度等高线较为稀疏, 波峰棱角分明。

图15

Fig.15

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	图15 七个样品一阶导数图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.15 First derivative spectra of seven samples (Band 2 170~2 145 cm-1)

图16

Fig.16

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	图16 样品CK 2D相关图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.16 Sample CK 2D correlation spectrum (Band 2 170~2 145 cm-1)

图17

Fig.17

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	图17 样品19-Five 2D相关图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.17 Sample 19-Five 2D correlation spectrum (Band 2 170~2 145 cm-1)

图18

Fig.18

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	图18 样品19-ED 2D相关图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.18 Sample 19-ED 2D correlation spectrum (Band 2 170~2 145 cm-1)

图19

Fig.19

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	图19 样品19-ING 2D相关图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.19 2D correlation spectrum of sample 19-ING (Band 2 170~2 145 cm-1)

图20

Fig.20

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	图20 样品23-Two 2D相关图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.20 2D correlation spectrum of sample 23-Two (Band 2 170~2 145 cm-1)

图21

Fig.21

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	图21 样品23-One 2D相关图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.21 2D correlation spectrum of sample 23-One (Band 2 170~2 145 cm-1)

图22

Fig.22

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	图22 样品23-ED 2D相关图谱(波段2 170~2 145 cm-1)Fig.22 2D correlation spectrum of sample 23-ED (Band 2 170~2 145 cm-1)

综上所述, 各个样品2D相关光谱吸收峰的位置、 个数、 以及颜色都不相同, 能够直观清晰地表征出不同样品之间的差异。

聚类结构就是在相似性统计量的基础上, 遵循一定的分类原则, 通过公式计算, 以求得各类之间较为合理的分类方法, 并依此方法得到的聚类结构图即为聚类图, 也称谱系图^[15]。 由谱系图(图23)可知, 在平方欧式距离为5时, 可以将7个样品分为三大类。 第一大类为样品19-ING、 23-Two、 23-One、 23-ED; 第二大类为样品19-ED; 第三大类为样品CK和19-Five。 样品19-Five与样品CK归为一类, 说明栽培丹参土壤经过五年休整, 达到了再次种植丹参的适宜程度。 但样品23-ED与样品19-ED同为丹参刚采收的土壤, 谱系图却把他们归为不同的大类, 推测原因为以下两点: 一是2023年进行数据检测, 而样品19-Five采收于2019年, 放置时间过长, 酚酸类物质及其不稳定, 易降解, 致使测量结果存在误差; 二是2023年采集的样本比2019年采集的样本黄芩种植时间长、 茬次多, 黄芩和丹参根际分泌物相互作用的时间更长, 即不同年份采集的土壤样本之间存在差异。

图23

Fig.23

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	图23 不同间隔年限栽培丹参土壤的谱系图Fig.23 Pedigree map of soil cultivated with Salvia miltiorrhiza at different intervals