用无水乙醇和去离子水超声处理基板10 min, 以去除基板表面的有机物和污染物, 待干燥后将铝箔纸平整无褶皱且无气泡地贴在带有粘性的基板上。 将制备好的基板放置于定制的点样板中, 紧密贴合制备点样室。 点样本总大小为8 cm× 2.5 cm, 共8个阵列, 每个阵列直径为3 mm。 将金纳米颗粒加至点样室进行冷冻干燥制备成SERS@Au微阵列芯片, 然后抽真空保存。 金纳米颗粒合成参考化学还原法^[19], 将质量分数为0.01%的氯金酸溶液加入圆底烧瓶中, 将其置于油浴锅中装上冷凝回流装置, 搅拌加热, 加入1%柠檬酸三钠溶液后继续加热, 待冷却后装入棕色试剂瓶, 避光4 ℃条件下保存。 制备的金颗粒的平均粒径约为(60± 12) nm, 在535 nm吸光度最大。 氯金酸(分析纯)和柠檬酸三钠(99%)购自国药集团化学试剂有限公司。

实验中所用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 大肠杆菌(Escherichia coli)、 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)菌株来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心。 LB培养基和琼脂购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

将上述四种菌株在LB固体培养基上进行培养8~10 h, 长出针尖大小即可挑取单菌落进行检测, 取2 μ L无菌水加至点样室混匀, 并放置在便携式拉曼光谱仪的激光探头下进行检测。 采用便携式拉曼光谱仪的大小为42 cm× 32 cm× 18 cm, 激发波长为785 nm, 激光功率为250 mW, 积分时间设为20 s, 积分次数设为1, 平滑系数设为3。

将微量毛细管放置于下眼睑, 待眼睛轻微湿润, 采集5~10 μ L泪液置PCR管4 ℃保存备用。 取10 μ L加标金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的泪液置于90 μ L LB液体培养基中充分混匀, 涂布于LB固体培养基, 37 ℃培养。 待菌落长至针尖大小, 随机挑取单菌落至点样室内, 滴加1~2 μ L无菌水充分混合, 进行拉曼光谱检测, 方法同上。 同时, 待测菌株使用革兰氏染色试剂盒进行染色鉴定。

对原始数据进行去除宇宙射线、 基线校正和平滑处理, 取400~1 800 cm^-1导入SIMCA14.1软件进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)。 MATLAB软件中分别对光谱数据进行迭代训练, 其中包括参数优化等, 输出光谱数据, 将光谱数据输入到支持向量机(support vector machine, SVM)模型进行分类, 建立判别模型。 图片采用Origin 2018和MATLAB绘制。

本研究开发了一种SERS@Au微阵列芯片[图1(a)], 该芯片点样室直径为3 mm, 适用于微量样品检测, 与便携式拉曼光谱仪配套使用, 具有便携、 快速、 现场检测的特点。 对SERS@Au微阵列芯片的增强效果、 重现性、 稳定性进行评价, 以结晶紫(crystal violet, CV)和金黄色葡萄球菌作为目标物, 检测发现CV和金黄色葡萄球菌的拉曼信号被显著增强[图1(b, c)]。 根据公式(EF=I_SERS· c_vol/I_RS· c_surf), 比较CV的普通RS信号和SERS信号, 计算出本文开发的基底增强因子达到5.39× 10⁹。 随机抽取10批次SERS@Au微阵列芯片进行金黄色葡萄球菌检测, 不同批次间的信号强度一致[图1(d)]。 选取732 cm^-1处特征峰强度计算相对标准偏差值(RSD), 结果为10.27%[图1(e)], 证明不同批次的SERS芯片具有良好的重现性和稳定性。 该芯片保存一定时间后仍然能够检测到被测物的信号。 如图1(f)所示, 每隔5 d收集被测物的SERS信号, 发现在30 d内金黄色葡萄球菌的信号强度虽有下降, 但指纹信息仍然清晰可见, 特征峰峰型及峰位无改变, 说明采用该芯片检测细菌的指纹信息结果可稳定保存一段时间, 便于临床检测结果的数字化存储及信息追溯。

图1

Fig.1

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图1 SERS@Au微阵列芯片性能测试 (a): SERS@Au微阵列芯片结合便携拉曼光谱仪检测泪液示意图; (b): CV的SERS图谱; (c): S.aureus的SERS图谱; (d): S.aureus的SERS图谱的重现性; (e): 特征峰732 cm-1的信号强度及RSD值; (f): 芯片储存不同时间时S.aureus的信号Fig.1 SERS@Au microarray chip performance testing (a): Schematic diagram of tear fluid detection using SERS@Au microarray chip combined with a portable Raman spectrometer; (b): SER spectra of CV; (c): SER spectra of S.aureus; (d): Reproducible SER spectra of S.aureus detected by SERS@Au microarray chip; (e): The signal intensities and RSD value at 732 cm-1 of S.aureus; (f): SERS@Au microarray chip spectra of S.aureus at different storage times

金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、 表皮葡萄球菌和大肠杆菌等为细菌性结膜炎常见致病菌^{[5, 6]}。 采用SERS@Au微阵列芯片检测四种致病菌的拉曼信号, 每种细菌至少选取50组样本进行检测, 研究结果发现, 四种致病菌在400~1 800 cm^-1波段具有拉曼特征信号[图2(a)]。 从拉曼图谱可以直观看到不同细菌具有不同的拉曼特征表型。 尽管, 金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌峰型较为相似, 却仍有不同。 其中金黄色葡萄球菌的最强拉曼峰出现在732, 959和1 266 cm^-1, 表皮葡萄球菌的特征峰主要为733, 960, 1 232和477 cm^-1[图2(a)]。 表皮葡萄球菌在477, 1 232和1 579 cm^-1有着不同于金黄色葡萄球菌的特征峰。 表皮葡萄球菌在477 cm^-1波段的振动推测是谷氨酸^[20], 730 cm^-1归属于N-乙酰胞壁酸和N— H振动^[21]。 大肠杆菌与铜绿假单胞菌的特征峰与葡萄球菌明显不同, 大肠杆菌的最强拉曼峰为722, 754, 1 001 cm^-1, 分别属于腺嘌呤^[22]或糖苷环振动、 吡咯杂环^[23]、 苯丙氨酸^[24]。 铜绿假单胞菌的主要拉曼峰出现在861, 1 096和1 222 cm^-1, 分别归属于酪氨酸^[25]、 C— C或C— O振动^[26]、 酰胺Ⅲ ^[27]等。 四种致病菌的其他拉曼特征峰及归属详见表1。

图2

Fig.2

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图2 细菌性结膜炎相关致病菌的拉曼特征与模型判别 (a): 四种细菌的平均拉曼图谱; (b): SVM模型的适应度曲线; (c): SVM训练集模型; (d): SVM预测集模型; (e): OPLS-DA模型分类结果; (f): OPLS-DA模型置换检验200次的结果Fig.2 SERS profiles of bacterial conjunctivitis-related pathogens and the discrimination models (a): Mean SERS spectra of S. aureus, S. epidermis, P. aeruginosa, and E. coli; (b): SVM model fitness curve; (c): SVM training set model; (d): SVM prediction set model; (e): Classification results of OPLS-DA; (f): Result of the permutation test of OPLS-DA model conducted 200 times

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 四种细菌性结膜炎相关致病菌的拉曼特征峰及归属 Table 1 Raman characteristic peaks of four bacterial conjunctivitis-related pathogens and the assignments Raman shift/cm-1 Assignments S. aureus E.coli P. aeruginosa S.epidermis 477 L-Glutamate[20] 679 Cysteine Vibrational Model[27] 722 Polyadenine, Glycosidic Ring Mode[22] 732 733 N-acetylmuramic acid, N— H wagging mode[21] 754 Pyrrole breathing mode[23] 861 Tyrosine ring breathing[24] 959 960 C— N and C— O[25] 1 001 Phenylalanine, $NH_{2}$[23] 1 096 C— C, C— O stretch of carbohydrates[26] 1 222 Amine Ⅲ of proteins[28] 1 266 Amine Ⅲ of proteins[20] 1 316 1 319 NH2 stretch of adenine[20], polyadenine, CH2/CH3 wagging mode[29] 1 404 Symmetric Ring C— H Bend[30]

表1 四种细菌性结膜炎相关致病菌的拉曼特征峰及归属 Table 1 Raman characteristic peaks of four bacterial conjunctivitis-related pathogens and the assignments

图2(a)可以直观看出不同细菌具有独特的的拉曼特征表型, 可能是由于不同种类的细菌具有各自特有的细胞壁组成及代谢产物。 为了进一步提高分类的准确性和客观性, 同时使用SVM和OPLS-DA对四种病原菌进行建模分析与鉴定。 SVM是一种有监督算法, 通过构建一个最优的超平面将不同类别的数据点分开, 具有准确性高、 误差率低和可解释性等优点。 将光谱数据随机打乱, 70%数据设置为SVM模型训练集, 30%为测试集, 经数据归一化、 函数优化和算法优化得到SVM最佳参数, 结果如图2(a— f)所示, SVM模型训练集的准确率为100%[图2(c)], 迭代50次后[图2(b)], 预测集的准确率达到97%[图2(d)]。 说明通过SVM建模能够客观、 准确地区分四种致病菌。

OPLS-DA为偏最小二乘判别分析方法, 基于偏最小二乘回归模型(OPLS)来寻找可以有效区分样品组别的线性组合变量, 并通过判别分析将其转化为分类结果, OPLS-DA在保留原始变量同时减少噪声的影响。 OPLS-DA模型的分析结果如图2(e, f)所示, 选取三个主成分, 绘制散点图, 同一菌株的信息聚集, 说明拉曼信号的重复性良好; 不同致病菌分布在不同的区域, 说明四种致病菌之间的差异明显, 能够被很好地区分开[图2(e)]。 OPLS-DA模型自变量拟合指数( Rx2)为0.807, 因变量拟合指数( Ry2)为0.915, 模型预测指数(Q²)为0.9, 准确率为90%。 该模型置换检验200次的结果如图2(f)所示, R²< 0.5, Q²的最终坐标小于0, 说明所建立的OPLS-DA模型可靠, 不存在过度拟合现象。

所构建了SVM和OPLS-DA两种分类模型, 准确率均不小于90%, 在双控验证下, 大大提高了对不同菌株区分的可靠性和准确度, 验证了自主研发的SERS@Au微阵列芯片在细菌快速检测和鉴别中具有良好的可行性。

泪液中细菌较为复杂, 往往不是单一菌种的感染, 因此增加了检测难度。 采用泪液加标的方式, 通过简单的培养(< 10 h), 待出现针尖大小菌落, 如图3(a)所示, 从中随机选取20个菌落进行编号并SERS检测, 结果如图3(b, c)所示, 其中2、 3、 6、 8、 11、 12、 14、 16、 18和20号菌落具有相似的图谱(A组), 该组图谱与大肠杆菌的标准图谱相似[图2(a)和图3(b)]。 菌落1、 4、 5、 7、 9、 10、 13、 15、 17和19号(B组)的特征信号与金黄色葡萄球菌的标准图谱相似[图2(a)和图3(c)]。 将上述20组光谱数据放入OPLS-DA模型进行判别分析, 结果如图3(d)所示, 未知菌落A组落在大肠杆菌所处区域, 未知菌落B组与金黄色葡萄球菌所处区域重合。 通过革兰氏染色, 未知菌落组A镜检结果为杆状革兰氏阴性菌, 未知B组为球菌、 革兰氏阳性细菌。 SVM模型分析结果与OPLS-DA相一致, 分类准确率达到97.2%[图3(e)]。

图3

Fig.3

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	图3 (a) 加标泪液的细菌培养结果; (b), (c) 随机挑选菌落的SERS图谱; (d) OPLS-DA模型判定结果; (e) SVM模型判定结果Fig.3 (a) The standard culture results of tear fluid with spiked bacteria; (b), (c) SERS spectra ofunknown colonies; (d) Discrimination results of OPLS-DA; (e) Discrimination results of SVM model

拉曼光谱结合机器学习的方法为无标记检测, 无需选择鉴定培养基, 对患者无损, 全程仅需12 h即可出结果, 因此大大降低了人力和物力成本, 大大缩短了检测时间, 在临床检测方面具有潜在的应用价值。