仪器: 傅里叶变换红外光谱仪(Bruker, 德国), 配备ATR-FTIR和FTIR检测附件; 压片模具; 玛瑙研钵; 红外烘烤灯(恒创科技, 中国香港); 手动压片机(恒创科技, 中国香港); 天平。

试剂材料: 溴化钾(光谱纯, PIKE, 美国); 无水乙醇; 脱脂棉。

土壤样品: 采自小麦/玉米轮作长期定位试验田, 试验设置有5个处理, 分别为不施肥对照(CK)、 氮磷钾养分100%由化肥提供(NPK)、 氮磷钾养分由50%化肥+50%有机肥提供(50%NPK+50%M)、 氮磷钾养分由100%有机肥提供(100%M)、 在NPK处理的基础上进行小麦和玉米秸秆还田(SNPK)。 选择该长期定位试验样品的原因在于, 长期施肥处理可形成土壤有机质官能团的显著差异, 为ATR-FTIR与FTIR的检测能力对比提供理想的实验载体, 同时能让学生直观感知农业生产措施对土壤分子结构的影响, 强化从理论到实践再到农学意义的关联认知。

课前准备: 课前组织学生分组领取土壤样品, 并指导学生自主完成样品的风干、 研磨、 过筛等前处理操作, 强化对土壤样品制备标准流程的实践认知。 仪器操作前, 安排学生轮流清洁仪器表面、 调试红外烘烤灯、 操作手动压片机等辅助设备, 培养实验准备习惯。 该环节, 让学生在正式实验前掌握样品预处理和仪器调试等基本技能, 避免因基础操作不当影响后续方法对比实验的准确性, 同时通过分组协作初步培养团队合作意识。

1.2.1 基础认知阶段

以问题“ 不同官能团为何有特定红外吸收频率?” 为切入点, 结合“ 砂质土与黏质土有机质官能团差异” 案例组织小组讨论, 引导学生建立“ 结构— 光谱” 关联认知。 通过仪器原理动画直观展示FTIR构造及测试逻辑, 重点解析ATR-FTIR与FTIR的光路本质差异(表1), 使学生不仅掌握“ 振动— 频率— 官能团对应关系” , 更能理解两种技术的适用场景。 通过问题引导-案例谈论-动画演示的递进式教学, 将抽象的光谱原理转化为具象的技术认知, 为后续方法比较阶段的实践操作奠定理论基础。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 ATR-FTIR与FTIR光路原理与测试方法对比 Table 1 Comparison of the principles and test methods of ATR-FTIR and FTIR optical path 参数 衰减全反射法(ATR-FTIR) 透射法(FTIR) 光路原理 红外光在晶体(如金刚石、 ZnSe)内全反射, 在样品表面形成衰减波, 仅探测样品表面微米级深度的信息 红外光直接穿透样品, 信号强度与样品厚度和浓度相关 样品要求 需与晶体光学接触(固体压紧/液体涂布), 表面平整 需制备成薄片(固体压片/液体夹片)或溶解于溶剂 检测深度 仅表面0.5~5 μ m(取决于波长和晶体折射率) 反映整体样品信息(厚度通常5~20 μ m)

表1 ATR-FTIR与FTIR光路原理与测试方法对比 Table 1 Comparison of the principles and test methods of ATR-FTIR and FTIR optical path

1.2.2 方法比较阶段

差异可视化教学: 通过案例视频对比ATR-FTIR与FTIR制样核心差异。 前者仅需样品研磨过筛, 后者需按1∶ 100比例混合KBr压片。 结合教学适用性评估(表2), 引导学生量化分析两种方法在操作难度(ATR-FTIR为☆☆, FTIR为☆☆☆☆)、 时间成本(ATR-FTIR更低)、 官能团响应灵敏度(FTIR对— OH等官能团响应更显著)等维度的优劣, 让学生建立技术特性-适用场景的量化关联, 避免学生对方法差异的认知停留在定性描述层面, 为后续综合应用阶段的方法选择提供依据。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 教学适用性评估 Table 2 Teaching applicability evaluation 评估指标 ATR-FTIR FTIR 教学建议 操作难度 ☆☆ ☆☆☆☆ 先开展ATR-FTIR教学再引入FTIR 时间成本 低 高 合理安排课时 成功率 高(≥ 90%) 中等(60%~80%) 重点指导FTIR压片技术 仪器损耗 小(晶体可反复清洁使用) 较大(KBr窗片易潮解) 控制学生FTIR操作次数

表2 教学适用性评估 Table 2 Teaching applicability evaluation

下文为方便起见, 用ATR代表ATR-FTIR。

实操与量化记录: ATR-FTIR组, 学生自主将研磨后的土壤样品均匀铺在ATR-FTIR晶体上, 使用压力杆逐步加压并观察紧密程度, 教师实时纠正“ 晶体清洁不彻底” 、 “ 样品堆积过厚” 以及“ 样品全覆盖晶体” 等问题, 记录单次成功率。 FTIR组, 学生分组完成KBr与土壤样品称量(精确至0.1 mg)、 混合研磨(需在红外烘烤灯下操作避免吸潮)、 压片(手动控制压力至10~15 MPa并计时1~2 min), 记录重复操作次数。 教师重点指导混合研磨均匀性判断、 压片透光性控制(最佳为半透明状)、 压片磨具清洁流程等。

实验过程中, 要求学生同步记录ATR与FTIR的制样时间、 操作难度(如压片开裂或质量不合格等), 并分别计算成功率(如ATR单次成功占比、 FTIR重复压片占比)。 通过“ 制样时间— 操作难度— 成功率” 三维记录表, 让学生直观感知两种方法的适用边界, 培养科学选择技术的思维。

1.2.3 综合应用阶段

分组与角色设计: 采用分组形式开展实验, 25~32人班级分为5组(每组约6人)(表3), 每组负责1种施肥处理(CK、 NPK、 50%NPK+50%M、 100%M和SNPK), 组内再细分为“ ATR操作员” 与“ FTIR操作员” , 同时各组指定1名同学担任数据记录员, 通过协作完成全流程操作。 同时, 要求学生自主设计“ 组别+处理+检测方式” 的样品编号(如“ 3%~100%M-AT” )并制作标签, 强化实验规范性。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 小组成员分工 Table 3 Task assignments of team members 组别 成员 处理 检测方式 样品标签 (学生自行设计) 一 1 CK ATR 1 2 CK ATR 2 3 CK ATR 3 4 CK FTIR 4 5 CK FTIR 5 6 CK FTIR 6 二 1 NPK ATR 7 2 NPK ATR 8 3 NPK ATR 9 4 NPK FTIR 10 5 NPK FTIR 11 6 NPK FTIR 12 三 1 50%NPK+50%M ATR 13 2 50%NPK+50%M ATR 14 3 50%NPK+50%M ATR 15 4 50%NPK+50%M FTIR 16 5 50%NPK+50%M FTIR 17 6 50%NPK+50%M FTIR 18 四 1 100%M ATR 19 2 100%M ATR 20 3 100%M ATR 21 4 100%M FTIR 22 5 100%M FTIR 23 6 100%M FTIR 24 五 1 SNPK ATR 25 2 SNPK ATR 26 3 SNPK ATR 27 4 SNPK FTIR 28 5 SNPK FTIR 29 6 SNPK FTIR 30

表3 小组成员分工 Table 3 Task assignments of team members

教师强调标准化实验流程。 ATR测试采用直接扫描测定: ①背景扫描, 清洁晶体表面(用无水乙醇棉球擦拭, 吹干), 不放置样品, 采集背景光谱(扫描范围4 000~400 cm^-1、 扫描32次、 分辨率4 cm^-1); ②样品测试, 放置制备好的土壤样品于ATR晶体上, 用压力杆压紧确保无缝隙, 设置参数范围与背景光谱一致, 进行样品数据采集; ③数据处理, 软件自动扣除背景, 获得样品吸收光谱。 FTIR测试采用KBr压片法进行测定: ①样品研磨, 取1~2 mg风干土壤样品与100~200 mg干燥KBr(比例1∶ 100)置于玛瑙研钵中, 在红外烘烤灯照射下研磨至混合物均匀无颗粒感(需5~10 min), 注意避免过度研磨导致KBr晶型转变; ②装模, 将研磨好的混合粉末倒入压片模具中, 用药匙轻刮表面使其平整, 放入模具柱塞, 轻微旋转使粉末分布均匀; ③压片, 将模具置于压片机中心, 缓慢加压至10~15 MPa, 保持压力1~2 min, 在该过程中, 加压过快会导致压片开裂, 压力不足则透光性差(本实验所用仪器设备配套的压片模具无需脱模); ④测试, 立即将压片装入红外光谱仪样品架, 避免暴漏空气过久吸潮。 同时, 制备纯KBr背景片, 扫描测定参数同ATR。

首先, 组织学生分组使用OMNIC软件对图1(ATR-FTIR)与图2(FTIR)光谱图进行基线校正、 特征峰标记及积分处理, 加深学生对官能团的理解。 其次, 通过结果图谱重点对比3 400 cm^-1(— OH伸缩振动)、 1 440 cm^-1(C— H振动)、 1 050 cm^-1(C— O伸缩振动)等关键波段的响应差异(表4)。 结合ATR与FTIR的光路原理(图1), 引导学生分析差异机制。

图1

Fig.1

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	图1 不同处理下样品的ATR-FTIR-FTIR光谱图Fig.1 ATR-FTIR spectra of samples under different treatments

图2

Fig.2

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	图2 不同处理下样品的FTIR-FTIR光谱图Fig.2 FTIR spectra of samples under different treatments

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 土壤有机质在红外光区(4 000~400 cm-1)的主要特征吸收 Table 4 The main characteristic absorption of soil organic matter in infrared region (4 000~400 cm-1) 波数/cm-1 有机质特征吸收 3 500~3 000 氢键结合的— COOH、 醇及苯酚中的— OH的伸缩振动 1 465~1 340 饱和碳C— H(面内弯曲振动) 1 260~1 000 多糖类、 醇类、 羧酸类及酯类C— O的伸缩振动 870~640 苯环C— H面外弯曲振动

表4 土壤有机质在红外光区(4 000~400 cm-1)的主要特征吸收 Table 4 The main characteristic absorption of soil organic matter in infrared region (4 000~400 cm-1)

— OH峰检测差异: ATR法未检出3 400 cm^-1处— OH峰(图1), 因ATR仅探测样品表面0.5~5 μ m深度, 土壤表面吸附水分干扰官能团信号; FTIR法因红外光穿透5~20 μ m厚的样品薄片, 且制样时KBr压片过程中伴随干燥(红外灯烘烤)处理, 有效排除水分干扰, 故3 400 cm^-1处— OH峰显著(图2), 峰高均值达0.32± 0.04(n=3), 表明FTIR法更适用于土壤中含— OH官能团(如酚、 醇类)的精准检测。

灵敏度差异: 1 440 cm^-1处C— H振动峰的峰面积比值显示, FTIR法(8.73%~10.48%)为ATR法(1.43%~3.30%)的3~4倍, 且FTIR法峰形更尖锐, 说明该法对饱和碳类官能团的检测灵敏度更高, 这与FTIR法获取整体样品信息、 减少表面不均匀性干扰的技术特性一致, 更适合痕量官能团定量分析。

数据可靠性验证: 每组对同一样品进行3次平行测定, 计算相对标准偏差(RSD)。 结果显示, ATR法关键峰面积RSD为3.2%~5.8%, FTIR法为2.9%~4.5%, 均小于6%, 表明两种方法的检测重复性良好, 数据可靠。

要求学生使用Excel或其他数据处理软件自主绘制“ 不同处理官能团峰面积比值柱状图” , 并在图中标注显著性差异(如用* 标记p< 0.05)。 随后, 开展讨论: 施肥处理对土壤官能团的影响。 每组选择其负责测定的处理, 结合光谱数据阐述其对土壤有机质的影响机制, 其他小组可提出问题, 培养学生的批判性思维。 最后, 教师给出具体的分析方法, 并结合土壤碳循环理论解读数据背后的农学意义。

2.2.1 ATR分析不同施肥处理对土壤官能团结构的影响

从ATR测定结果可知, 不同施肥处理下土壤红外光谱特征峰相似, 主要在1 442、 1 440、 1 436、 991、 995、 777 cm^-1处(图1), 这也说明在长期施肥土壤中, 不同施肥处理的有机质碳骨架基本相似。 根据红外光谱吸收特征峰谱带, 位于1 465~1 340 cm^-1波段出现饱和碳C— H振动峰, 在1 260~900 cm^-1出现的强吸收峰是多糖类、 醇类、 羧酸类及酯类C— O的伸缩振动峰, 最有可能是纤维素、 半纤维素的C— O吸收峰, 在870~640 cm^-1出现苯环C— H面外弯曲振动吸收峰^{[15, 16]}(图1, 表4)。

进一步地, 通过对红外吸收特征峰面积进行积分计算不同峰的面积比值来分析不同施肥处理间土壤有机质官能团的结构差异(表5)。 烷烃类化合物, 100%M处理与SNPK处理的峰面积比值(1.43%± 0.15%、 1.67%± 0.27%)显著低于CK(3.30%± 0.16%), 因有机肥(尤其是秸秆还田)分解过程中, 烷烃类物质被微生物优先降解为小分子碳, 导致其相对含量降低; 而NPK处理(3.13%± 0.10%)与CK无显著差异, 说明单施化肥对土壤烷烃类物质影响较小。 芳香族化合物, SNPK处理峰面积比值最低(3.16%± 0.14%), 显著低于CK(4.27%± 0.01%), 因秸秆还田引入大量木质素(含芳香环结构), 但长期轮作下微生物对芳香族化合物的降解能力增强, 反而使土壤中芳香族化合物积累量减少; 50%NPK+50%M处理(4.19%± 0.23%)与CK无差异, 表明有机无机肥配施可维持土壤芳香族化合物含量稳定, 有利于土壤碳库固存^{[17, 18]}。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 ATR-FTIR光谱官能团峰面积比值(%) Table 5 ATR-FTIR spectral functional group peak area ratio (%) 处理 烷烃类 碳水化合物 芳香族化合物 CK 3.30± 0.16a 29.88± 0.67a 4.27± 0.01a NPK 3.13± 0.10a 29.64± 0.59a 3.58± 0.38b 50%NPK+50%M 3.04± 0.01a 30.31± 0.93a 4.19± 0.23a 100%M 1.43± 0.15b 19.23± 2.43c 3.53± 0.18bc SNPK 1.67± 0.27b 22.76± 2.81b 3.16± 0.14c 注: 表内数值为均值± 标准差(n=3); 同列数据后不同字母表示处理间差异显著(p< 0.05), 下同 Note: The values in the table are mean± standard deviation (n=3); Data followed by different letters within the same column signifies a statistically significant difference (p< 0.05), the same below.

表5 ATR-FTIR光谱官能团峰面积比值(%) Table 5 ATR-FTIR spectral functional group peak area ratio (%)

2.2.2 FTIR分析不同施肥处理对土壤官能团结构的影响

从FTIR测定结果可知, 土壤红外光谱特征峰主要在3 438、 3 436、 3 435、 3 421、 1 436、 1 438、 1 026和787 cm^-1处(图2), 整体上与ATR测定结果相似。 这也说明该土壤中有机质的化合物组分主要为羧酸类、 醇类、 苯酚、 多糖等物质(图2, 表4)。

分析有机化合物组分峰面积比值(表6), 酚、 醇类化合物, 50%NPK+50%M(15.35%± 1.93%)与SNPK(15.61%± 0.23%)处理显著高于CK(13.12%± 1.29%), 因有机肥分解产生大量酚类、 醇类中间产物, 且秸秆还田进一步增加此类物质输入; FTIR法对— OH官能团的高灵敏度(3 400 cm^-1峰显著), 使其能精准捕捉这一变化, 而ATR法因水分干扰无法检出。 碳水化合物, NPK(42.76%± 0.87%)、 50%NPK+50%M(41.05%± 0.29%)、 SNPK(43.72%± 0.22%)处理显著高于CK(32.65%± 0.22%), 仅100%M处理(31.75%± 3.99%)与CK无差异, 推测单施高量有机肥时, 微生物对碳水化合物的分解速率大于合成速率, 而化肥配施或秸秆还田可促进微生物合成碳水化合物(如胞外多糖), 提升土壤肥力。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 FTIR光谱官能团峰面积比值(%) Table 6 FTIR spectral functional group peak area ratio (%) 处理 酚、 醇类 烷烃类 碳水化合物 芳香族化合物 CK 13.12± 1.29b 8.73± 0.10c 32.65± 0.22b 2.23± 0.05b NPK 14.03± 0.70ab 9.59± 0.70abc 42.76± 0.87a 2.84± 0.29a 50%NPK+50%M 15.35± 1.93a 10.48± 0.08a 41.05± 0.29a 1.77± 0.08c 100%M 14.50± 0.62ab 9.37± 0.87bc 31.75± 3.99b 1.83± 0.30c SNPK 15.61± 0.23a 10.15± 0.34ab 43.72± 0.22a 1.99± 0.02bc

表6 FTIR光谱官能团峰面积比值(%) Table 6 FTIR spectral functional group peak area ratio (%)

通过组内与组间进行数据共享, 以提高学生的综合数据处理能力。 成果展示包括个人实验数据、 小组数据、 班级数据、 结果图表与实验结论。 要求每组不拘泥于汇报形式, 如PPT、 短视频、 流程图等, 充分展示实验过程亮点(如成功的FTIR压片过程经验)。

教师制作并发放《小组互评量化表》, 根据汇报情况, 从数据准确性、 逻辑清晰度、 问题解决质量等维度进行打分, 得分最高组获“ 最佳协作小组” 称号, 纳入课程分值计算的一部分。

在成果汇报中, 多组学生结合“ 方法互补性” 提出创新性分析视角: 如第三组(负责50%NPK+50%M处理)通过ATR法的“ 芳香族稳定性” 与FTIR法的“ 酚、 醇类提升” 数据, 自主提出“ 有机无机肥配施的协同机制” , 其汇报逻辑被纳入后续课程的典型案例; 第四组(负责100%M处理)发现FTIR法压片吸潮导致数据波动, 提出“ 压片后立即用保鲜膜密封” 的改进方案, 该方案已用于优化实验操作流程。

实验结束后开展“ 技术拓展项目探究” , 鼓励学生探索“ ATR-FTIR/FTIR对比模式分析其他类样品检测技术” 或“ ATR-FTIR/FTIR 对比模式可迁移的其他分析技术” (如气相色谱/质谱联用法的顶空进样与液体进样模式对比分析), 并将合理建议纳入下一轮课程设计。

2022— 2023学年, 有3组学生提出的拓展项目已实施, 如ATR-FTIR/FTIR对比分析不同作物秸秆的官能团差异; 气相色谱顶空进样与液体进样模式对比; 气相色谱质谱法测定土壤中硝基苯含量分析参数优化, 其中“ 气相色谱质谱法测定硝基苯含量” 项目已形成校级创新计划课题, 进一步验证了本教学模式对学生创新的推动作用。