EA、 UA~D、 NaH₂PO₄和Na₂HPO₄(上海源叶生物科技有限公司); HSA(美国sigma公司)。

U-2910紫外可分光光度计和F-7000荧光分光光度计(日本日立有限公司); PE28 pH计[梅特勒-托力多仪器(上海)有限公司]。

1.2.1 紫外光谱分析

取3 mL 2 mg· mL^-1 HSA溶液(0.1 mol· L^-1 pH 7.4的PBS缓冲溶液配制)于比色皿中, 添加20 μ L 1 mmol· L^-1的EA和UA~D溶液, 混匀后于25 ℃水浴5 min, 用紫外分光光度计扫描样品。具体参数: 波长190~450 nm, 扫描速度200 nm· min^-1, 步幅5 nm, 狭缝宽度为1.5 nm。

1.2.2 内源荧光光谱分析

采用F-7000荧光分光光度计研究EA和UA~D对HSA内源荧光的影响。取3 mL 2 mg· mL^-1 HSA溶液于1 mL比色皿中, 向其中添加20 μ L 1 mmol· L^-1的EA和UA~D溶液, 混匀后25 ℃水浴5 min, 在280 nm激发波长下, 记录发射光谱300~400 nm的荧光光谱, 激发与发射波长的狭缝宽度均设为2.5 nm, 电压为700 V。

1.2.3 荧光滴定实验

取3 mL 1 mg· mL^-1的HSA溶液于荧光比色皿中, 分别加入10 μ L 1 mmol· L^-1的EA、 UA~D溶液, 重复滴加6~8次, 混匀后分别于298、 304和310 K下水浴5 min, 测定其荧光光谱和最大荧光强度值。具体参数为: 激发波长280 nm, 发射波长300~450 nm, 电压700 V, 激发与发射波长的狭缝宽度均设为2.5 nm。

采用Stern-Volmer方程计算EA和UA~D的荧光猝灭常数(K_sv)和猝灭速率常数(K_q), 公式如式(1)^[9]

F0F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q](1)

式(1)中, F、 F₀分别表示体系添加和不添加EA和UA~D时HSA的荧光强度; [Q]为EA和UA~D的浓度; τ ₀(10^-8 s)为不加猝灭剂时HSA的平均荧光寿命。

EA和UA~D与HSA的结合常数(K_a)和结合位点数(n)可通过双对数方程Double-Logarithmic计算^[10], 见式(2)

logF0-FF=logKa+nlog[Q](2)

通过van’ t Hoff方程计算EA和UA~D热力学参数, 包括焓变(Δ H° )、 熵变(Δ S° )和酶自由能(Δ G° )变化, 见式(3)和式(4)

lnKa=-ΔH°/RT+ΔS°/R(3)

ΔG°=ΔH°-TΔS°(4)

式中, R为气体常数; T为反应体系的温度。

1.2.4 同步荧光测定

采用F-7000荧光分光光度计分析EA和UA~D对HSA色氨酸和酪氨酸微环境的影响。分别往3 mL 2 mg· mL^-1的HSA溶液中逐滴加入1 mmol· L^-1的EA和UA~D, 混匀后25 ℃水浴反应5 min, 测定样品的荧光光谱和最大荧光吸收值。激发起始波长分别设为280与310 nm, 发射波长分别设为265~400和250~400 nm, 激发和发射波长的狭缝宽度均设为5.0 nm。

1.2.5 三维荧光测定

分别取3 mL 2 mg· mL^-1 HSA溶液于比色皿中, 添加20 μ L 1 mmol· L^-1的EA和UA~D溶液, 混匀后25 ℃水浴5 min, 测定其在激发和发射波长扫描范围均为200~600 nm时的荧光光谱, 激发和发射波长的狭缝宽度均为5.0 nm, 扫描速率为12 000 nm· min^-1。

1.2.6 分子对接

采用AutoDocktools 1.5.6软件研究HSA与EA和UA~D相互作用的分子机制。HSA的三维结构图(1AO6)从Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)下载, EA、 UA~D的3D结构图由ChemBio3D Ultra 14.0软件绘制, 并以最低能量保存为pdb文件, 并用AutoDockTools 1.5.6软件优化处理结构图, 保存为PDBPT文件后, 进行分子对接模拟分析。网格盒设置为60× 60× 60, 网格间距为0.375 Å , 采用拉马克遗传算法(Lamarckian genetic algorithm, LGA)进行分子对接计算, 其他参数均为默认值, 对接次数为100, 选择结合能量最低的蛋白质-配体复合物为目标, 采用Discovery Studio Visualizer软件对其进行可视化处理。

1.2.7 数据分析

所有实验重复3次, 结果以平均值(标准偏差表示, 采用SPSS Statistics 22.0软件对数据进行统计分析, 采用Origin 2019绘制图谱, 并以Duncan进行显著性差异分析, p< 0.05认为具有显著性差异。

HSA蛋白分子中含有带苯环的芳香族氨基酸如酪氨酸和色氨酸, 因此其在紫外区(190~450 nm)有吸收, 可通过紫外吸收值的高低判断其是否与小分子化合物发生了结合^[11]。由图1(a), 天然HSA的紫外吸收值最低, 加入EA和UA~D后, 其紫外吸收值由1.072分别增加至1.145、 1.164、 1.218、 1.369、 1.275。以上结果表明EA和UA~D与HSA发生结合, 并形成了复合物, 而添加UC后HSA的紫外吸收值增加最多, 说明UC与HSA的结合能力最强。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 EA和UA~D对HSA紫外光谱(a)和荧光图谱(b)的影响Fig.1 Effect of EA and UA~D on the UV (a) and fluorescence spectrum (b) of HSA

EA、 UA~D对HSA内源荧光强度的影响如图1(b)所示, 天然HSA具有最大荧光吸收, 添加EA和UA~D后, 其峰值分别从3 870降至2 811、 3 079、 3 422、 1 808和2 019, 表明EA和UA~D能猝灭HSA的内源荧光, 其与HSA发生了结合并形成了复合物^[12], UC的猝灭效果最强, 其次为UD。UA使HSA的最强荧光吸收峰发生了蓝移(左移1 nm), UC和UD使最强荧光吸收峰发生了红移(分别右移0.4 和0.8 nm), 说明UC、 UD与UA的加入分别导致HSA的微环境向亲水和疏水方向移动^[13]。

2.2.1 荧光动力学分析

当激发波长为280 nm时, 小分子化合物通过激发态反应、 分子重排、 能量转移、 形成基态络合物等方式猝灭蛋白质的荧光, 采用荧光滴定实验可分析EA和UA~D与HSA相互作用关系^[14]。如图2所示, 在不同的温度下, Stern-Volmer曲线呈现良好的线性关系, 说明EA和UA~D均通过单一的方式猝灭HSA的荧光。如表1所示, EA、 UA、 UC和UD的K_SV值随反应温度的升高而降低, 在304 K时, 其K_q的值分别为9.59× 10¹²、 7.69× 10¹²、 9.84× 10¹²和20.27× 10¹² L· mol^-1· s^-1, 远大于最大猝灭速率常数, 表明EA、 UA、 UC和UD是通过与HSA结合形成基态络合物而静态猝灭HSA的荧光^[12]。

图2

Fig.2

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	图2 在298、 304和310 K下, EA和UA~D猝灭HSA荧光的Stern-Volmer曲线和双对数曲线Fig.2 The Stern-Volmer and double logarithmic plots forthe fluorescence quenching of HSA by EA and UA~D at 298, 304 and 310 K

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同温度下HSA与EA和UA~D相互作用的荧光猝灭常数、 结合常数、 和热力学参数 Table 1 The quenching constants, binding constants, number of binding sites and thermodynamic properties for the interaction of HSA with EA and UA~D at different temperatures T/ K KSV/(104 L· moL-1) Kq/(1012 L· mol-1· s-1) n Ka/(104 L· moL-1) Δ H° / (kJ· mol-1) Δ S° / (J· mol-1· K-1) Δ G° / (kJ· mol-1) 298 9.80 9.80 1.306 237.30 -36.39 EA 304 9.59 9.59 1.322 281.71 19.35 0.19 -37.51 310 9.10 9.10 1.340 321.00 -38.63 298 8.57 8.57 1.202 69.47 -33.44 UA 304 7.69 7.69 1.189 54.50 -48.06 -0.05 -33.15 310 7.33 7.33 1.147 32.73 -32.85 298 19.68 19.68 1.355 717.79 -39.11 UB 304 19.87 19.87 1.333 572.53 -28.60 0.04 -39.33 310 20.10 20.10 1.309 459.09 -39.54 298 9.95 9.95 1.127 38.90 -31.85 UC 304 9.84 9.84 1.080 22.96 -59.92 -0.09 -31.28 310 9.04 9.04 1.052 15.27 -30.72 298 20.33 20.33 1.155 88.47 -33.69 UD 304 20.27 20.27 1.234 197.42 137.72 0.58 -37.14 310 17.56 17.56 1.375 763.84 -40.59

表1 不同温度下HSA与EA和UA~D相互作用的荧光猝灭常数、 结合常数、 和热力学参数 Table 1 The quenching constants, binding constants, number of binding sites and thermodynamic properties for the interaction of HSA with EA and UA~D at different temperatures

2.2.2 结合常数和热力学常数分析

如表1所示, 在298、 304和310 K下, EA和UA~D的结合位点数为1.052~1.375之间, 接近于1, 表明其在HSA上有一个或者一类结合位点, 两者之间结合的摩尔比例为1∶ 1。随着温度的升高, UA~C的K_a值出现降低的趋势, 表明UA~C-HSA复合物的稳定性随温度的升高而降低, UB的K_a值最大, 其与HSA结合力最强^[3]。

由表1, UA和UC与HSA相互作用的Δ S° 、 Δ H° 和Δ G° 值均小于零, 说明UA和UC与HSA的结合是一个自发进行的放热过程, 氢键和范德华力是其主要驱动力^[15]。UB与HSA相互作用的Δ H° 和Δ G° 值小于零, 而Δ S° 值大于零, 表明两者的结合是自发进行的放热过程, 其主要驱动力为静电相互作用力。EA和UD与HSA相互作用的Δ S° 和Δ H° 值均大于零, 而Δ G° 值小于零, 说明EA和UD与HSA结合是一个自发进行的吸热过程, 疏水相互作用是形成EA/UD-HSA复合物的主要相互作用力^[16]。

同步荧光光谱可以反映荧光基团微环境的变化, Δ λ =15和60 nm分别表示EA和UA~D对HSA酪氨酸和色氨酸微环境的影响^[17]。如图3所示, 随着EA和UA~D浓度的增加, HSA酪氨酸和色氨酸残基的最大荧光吸收值呈现降低的趋势, 其对色氨酸的猝灭效果显著强于酪氨酸, 表明EA和UA~D主要与HSA的色氨酸残基发生了结合。EA、 UC和UD使HSA酪氨酸和色氨酸残基的最大荧光吸收峰发生了红移(0.8~1.4 nm), UA和UB使酪氨酸的最大荧光吸收峰发生了轻微的蓝移(0.2 nm), UB使色氨酸的最大荧光吸收峰发生了轻微的红移(0.2 nm)。以上结果说明, EA、 UC和UD会增加HSA色氨酸和酪氨酸微环境的亲水性, UB会增加HSA色氨酸和酪氨酸微环境的疏水性, UA则会增加HSA酪氨酸微环境的疏水性, 其中EA对HSA微环境的改变效果最显著, 其次是UC和UD, UA的影响最弱^[9]。

图3

Fig.3

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	图3 EA和UA~D与不同浓度HSA相互作用的同步荧光光谱Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of HSA with different concentrations of EA and UA~D for Δ λ =15 nm and Δ λ =60 nm

EA和UA~D对HSA三维荧光的影响如图4所示, Rayleigh峰(E_x=E_m)表示瑞利散射峰, 峰1(E_x=280 nm, E_m=330 nm)为酪氨酸和色氨酸残基的光谱特征峰, 其能反映HSA多肽骨架的结构的改变^[18]。添加EA和UA~D之后, HSA的Rayleigh峰的荧光强度显著增加, 峰1的荧光强度显著减低, 且UC对峰1的影响最大, UB和UC次之。以上结果表明EA和UA~D与HSA的结合引起了其构象的变化。峰1荧光强度值的降低可能是因为EA和UA~D与HSA的结合位点靠近酪氨酸和色氨酸残基^[19]。

图4

Fig.4

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	图4 EA和UA~D对HSA三维荧光光谱的影响Fig.4 Effect of EA and UA~D on three-dimensional fluorescence spectrum of HSA

采用分子对接技术进一步探究了EA和UA~D与HSA相互作用的分子机制。HSA有两个主要结合位点, Ⅱ A子结合域为位点1, Ⅲ A子结合域为位点2, 本研究主要模拟分析了EA和UA~D与HSA位点1和位点2的结合作用, 发现EA和UA~D与HSA位点1和位点2的结合能分别是-5.74、 -5.98, -6.11、 -6.78和-6.99、 -6.92, -6.12、 -6.37, -5.55、 -6.5。EA、 UA、 UC和UD与HSA结合位点2有最低结合能, UB则与HSA结合位点1有最低结合能, 采用Discovery Studio软件对最低结合能的对接模型进行可视化分析, 其结果见图5(a, b)。

图5

Fig.5

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	图5 EA (a)和UA~D (b)与HSA相互作用的二维和三维结构图Fig.5 Tertiary (a) and two-dimensional structure (b) of the interaction between EA and UA~D with HSA

EA与HSA的氨基酸残基Lys436、 Asp187、 Lys432、Asn429、 Gln459结合形成7个氢键, UA与氨基酸残基Arg410、 Arg485和Leu430形成3个氢键, UB与氨基酸残基Leu481形成1个氢键, UC与氨基酸残基Ile388、 Tyr411形成2个氢键, UD与氨基酸残基Ile388、 Tyr411形成2个氢键。EA和UA~D分别与4、 6、 6、 11和9个HSA氨基酸残基发生疏水相互作用, 涉及的氨基酸残基包括Ala191、 Val456、 Lys199和Trp214等。结果表明氢键和疏水相互作用是EA和UA~D与HSA结合的主要作用力, 与热力学研究结果一致。EA和HSA能形成更多的氢键, 表明EA-HSA复合物的结构最稳定^[20]。计算机模拟发现参与EA、 UC和UD非共价结合的氨基酸残基显著多于UA和UB, 与前期研究发现的EA、 UC、 UD对HSA微环境影响程度强于UA与UB一致。EA和UA~D可通过与HSA的活性氨基酸结合而起到屏蔽HSA糖基化活性位点的作用。

EA和UA~D与HSA的相互作用机理: 自发的情况下, EA和UA~D可通过氢键、 范德华力、 静电相互作用力和疏水相互作用等驱动力与HSA的活性氨基酸进行结合, 并以静态的方式猝灭HSA的荧光, 通过改变HSA酪氨酸和色氨酸的微环境而影响其空间构象, 进而屏蔽HSA的糖基化位点, 达到抑制糖基化的作用。EA含有的羟基数目最多, 与HSA形成的复合物更稳定, 表明羟基对其抑制糖基化能力具有重要的贡献。UA~D具有相似的结构, 但UC和UD与HSA的结合能力显著强于UA和UB。相比于UA~B, UC和UD的B环上多了2个羟基, 形成了更多的氢键, 说明B环上的羟基能促进其与HSA的结合。Zhang等和Ma等的研究也有相似的结果^{[21, 22]}。