本研究于2022年8月22日, 选取位于哈尔滨市道外区的黑龙江哈东沿江湿地省级自然保护区(河流湿地, HL)、 白渔泡国家湿地公园(湖泊湿地, HP)和介于以上两块天然湿地间的水田(ST)、 鱼塘(YT)人工湿地, 采集表层底泥。起点坐标分别为HL: 126° 52'58.78″E, 45° 55'58.46″N; HP: 126° 53'45.06″E, 45° 53'44.55″N; ST: 126° 53'4.14″E, 45° 55'30.48″N; YT: 126° 53'10.11″E, 45° 55'21.47″N。除ST种植水稻外, 湿地植物主要为芦苇(Phragmites australis)、 香蒲(Typha orientalis)、 稗(Echinochloa crus-galli)和荇菜(Nymphoides peltata)。依据人工湿地小面积区划作业特征, 在各样地内每间隔30 m设置一个长宽均为1 m的样方, 重复3次。各样方内利用直径5 cm活塞式柱状底泥采样器取0~15 cm处底泥, 将4个顶点和中心点的底泥充分混匀, 去除石块、 植物根系等杂质, 得到匀质底泥保留500 g作为一个样品。

取5.0 g冻干样品, 加入20 mL超纯水, 室温条件下振荡2.5 h, 4 ℃条件下1 200 r· min^-1离心10 min, 保留上清液。使用0.45 μ m孔径的玻璃纤维滤膜进行过滤, 保留滤液即为DOM溶液。使用Jena Multi N/C 2100型TOC分析仪, 测定DOM溶液中溶解性有机碳的含量, 加入超纯水至样品的溶解性有机碳的浓度为15 mg· L^-1。使用Hitachi F-7000型荧光光谱仪, 测定表层底泥DOM样品三维荧光光谱, 激发光源为450 W氙弧灯, 光电倍增管电压为700 V, 激发波长(Ex)和发射波长(Em)的扫描范围均为200~600 nm, 间隔为5 nm, 扫描速度为2 400 nm· min^-1。使用超纯水作为空白校正散射。每个样品重复3次测定。

取0.5 g冻干样品, 使用Omega Bio-Tek E.Z.N.A. ^® DNA试剂盒提取总DNA, 方法参考说明书。使用Thermo Fisher Nano Drop 2000型紫外-可见光分光光度计检测DNA浓度和纯度, 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。聚合酶链式反应扩增引物为ITS1F: 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3' ITS2R: 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3。反应体系: 4 μ L的5× FastPfu Buffer, 2 μ L的2.5 mmol· L^-1 dNTPs, 正反引物各0.8 μ L, 0.4 μ L FastPfu聚合酶, 0.2 μ L牛血清白蛋白, 10 ng模板DNA, 加ddH₂O至20 μ L。反应参数: 95 ℃条件下3 min变性, 55 ℃条件下30s退火, 72℃条件下45s延伸, 35个循环; 72 ℃条件下10 min延伸。使用2%琼脂糖凝胶电泳法和Axygen Biosciences试剂盒回收产物, 并使用Promega Quanti Fluor TM-ST型蓝色荧光定量系统检测产物DNA质量后, 送上海美吉生物医药科技有限公司使用Illumina MiSeq平台进行高通量测序, 每个样品重复3次。

参考文献[4], 使用Perkin Elmer FL WinLab软件收集荧光光谱数据, 利用MathWorks MATLAB R2022a软件中的Removescatter包进行去散射处理, 之后利用DOMFluor包对去散射数据进行平行因子分析, 确定荧光组分数, 并绘制三维荧光光谱图。利用SPSSAU(https://spssau.com/)分析不同样品间DOM各种荧光组分最大荧光强度(Fmax)的差异显著性, 并利用WPS Office Excel做柱形图。利用美吉生信云平台(https://www.majorbio.com/)分析真菌群落组成, 对物种进行分类鉴定, 绘制门水平相对丰度柱状图, 并计算Chao1丰富度指数、 Shannon多样性指数、 Simpson优势度指数, 分析不同样品间优势门相对丰度的差异显著性。利用Cloudtutu平台(https://www.cloudtutu.com/), 基于Pearson相关系数对DOM各荧光组分Fmax与真菌群落门水平相对丰度、 多样性指数做Mantel’ s test分析, 绘制相关性热图。

如图1, 利用去散射数据绘制出三维荧光光谱图, 参考文献[4]和[6], 表层底泥DOM中共识别出4种荧光组分, 包括相对大分子量的类富里酸组分C1(Ex=240 nm, Em=415 nm)和类胡敏酸组分C2(Ex=270 nm, Em=465 nm), 相对小分子量的类色氨酸组分C3(Ex=230 nm, Em=340 nm)和类酪氨酸组分C4(Ex=200 nm, Em=300 nm)。4种荧光组分常见于湿地及农业环境中^{[6, 10, 11]}。C1和C2来自于动、 植物残体等, 指示陆源性输入, 其中C2为典型陆源难降解生物物质; C3和C4源于浮游植物、 微生物降解的氨基酸类、 芳香性蛋白类产物, 也受到农田退水的影响^{[4, 5]}。

图1

Fig.1

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	图1 表层底泥DOM三维荧光组分 C1: 类富里酸组分; C2: 类胡敏酸组分; C3: 类色氨酸组分; C4: 类酪氨酸组分Fig.1 Three dimensional fluorescence components of surface sediment DOM C1: Fulvic-like acid component; C2: Humic-like acid component; C3: Tryptophan-like component; C4: Tyrosine-like component

Fmax可用于代表各DOM荧光组分的相对浓度^[4], 本研究中表层底泥DOM荧光组分C1—C4相对比例依次为29.06%、 21.42%、 25.84%和23.68%, 即类富里酸相对浓度高于类胡敏酸, 两种类蛋白质相对浓度接近。各样品中4种DOM荧光组分之和占总组分之和的比例依次为22.36%(HL)、 25.27%(HP)、 24.13%(ST)和28.25%(YT), 可见YT中DOM浓度相对较高, 这可能由投入鱼饲料所导致。如图2, YT中C1和C2相对浓度较高, 与HL中的差异不显著, 而显著高于HP和ST; C3相对浓度在HP和ST中差异不显著, 而ST显著高于HL和YT; C4相对浓度在HP中显著高于HL, 而在其余样品间差异不显著。可以看出, 表层底泥DOM荧光组分C2和类蛋白质可用于区分河流湿地和湖泊湿地, 而C1、 C2和C3可用于区分水田和鱼塘, 作为识别底泥DOM特征关键因子, 评价湿地环境质量^{[4, 11]}。

图2

Fig.2

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	图2 表层底泥DOM荧光组分荧光强度差异 不同字母间代表差异显著(p< 0.05)Fig.2 Difference of fluorescence intensity between fluorescence components of surface sediment DOM Different letters represent significant differences

湿地表层底泥真菌群落门水平相对丰度如图3, 除未分类类群(unclassified_k_fungi)外, 共有7个门的相对丰度大于1%。同前人研究结果^{[7, 9]}, 本研究中子囊菌门(Ascomycota)相对丰度最高, 其次为担子菌门(Basidiomycota)、 罗兹菌门(Rozellomycota)。子囊菌门相对丰度依次为53.87%(HL)、 27.11%(HP)、 58.06%(ST), YT中子囊菌门相对丰度高达85.86%, 显著(p< 0.05)高于其余样品。担子菌门、 罗兹菌门在HP中的相对丰度分别为35.27%、 14.29%, 均显著(p< 0.05)高于其余样品。

图3

Fig.3

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	图3 表层底泥真菌门的相对丰度Fig.3 Relative abundance of fungal phylum of surface sediment

如图4, 在真菌群落门水平上, HL、 HP和ST中Chao1丰富度指数差异不显著(p> 0.05), 均显著(p< 0.05)高于YT。HL和ST中Shannon多样性指数、 Simpson优势度指数差异均不显著(p> 0.05), HP中Shannon多样性指数显著(p< 0.05)较高, Simpson优势度指数显著(p< 0.05)低于其余样品, 而在YT中与之相反。说明相比于天然湿地, 水产养殖对表层底泥真菌群落产生的干扰高于水稻种植, 使真菌群落趋向特定类群, 提高了真菌群落的优势度, 降低了丰富度和多样性。

图4

Fig.4

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	图4 表层底泥中真菌群落多样性指数 不同字母间代表差异显著(p< 0.05)Fig.4 Diversity index of fungal community of surface sediment Different letters represent significant differences(p< 0.05)

利用表层底泥DOM荧光组分Fmax与真菌群落门水平相对丰度(大于1%)及多样性指数做Mantel’ s test分析。如图5, C1与C2成显著(Pearson’ s p< 0.001)正相关, 即DOM荧光组分中相对大分子量的类富里酸和类胡敏酸具有相同来源。C1、 C2均与类蛋白质成负相关, C3与C4成正相关, 但相关性均不显著(Pearson’ s p> 0.05)。Wang等^[2]认为DOM分子多样性与真菌群落多样性间相关性不显著, 但本研究中C1、 C2与真菌群落多样性具有显著(Mantel’ s p< 0.05)相关性, C2与真菌群落组成具有显著(Mantel’ s p< 0.05)相关性, 而相对小分子量的类蛋白质与真菌群落组成及多样性均无显著(Mantel’ s p> 0.05)相关性, 说明真菌群落可参与表层底泥中陆源性DOM的形成与转化过程, 是养分循环的关键因素^[2], 但相对小分子量的荧光组分不只受到真菌群落的影响, 细菌群落驱动不稳定DOM组分降解, 其影响应更为显著^{[2, 9]}。

图5

Fig.5

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	图5 表层底泥DOM荧光组分与真菌群落组成及多样性间相关性Fig.5 Correlation between DOM fluorescence components and fungal community composition and diversity of surface sediment

进一步结合表层底泥DOM荧光组分和真菌群落多样性指数及门相对丰度的Pearson相关性(图6)分析可知, Chao1丰富度指数与DOM荧光组分间均成负相关, 但均不显著(p> 0.05)。Shannon多样性指数和Simpson均匀度指数与C1、 C2均具有显著(p< 0.05)相关性, 即真菌群落多样性升高、 均匀度降低时, 导致相对大分子量的类富里酸和类胡敏酸降解、 转化使相对浓度降低。

图6

Fig.6

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	图6 表层底泥DOM荧光组分和真菌群落多样性指数及门相对丰度的相关性Fig.6 Correlations among DOM fluorescence components and fungal community diversity index and phylum relative abundance of surface sediment

子囊菌门具有较多腐生型物种^[12], C1、 C2与子囊菌门均成显著(p< 0.05)正相关, 即相对大分子量荧光组分的相对浓度高时子囊菌门富集。C1与壶菌门(Chytridiomycota)(p< 0.01)和单毛壶菌门(Monoblepharomycota)(p< 0.05)成显著负相关, 同时, C2与担子菌门、 罗兹菌门、 壶菌门、 单毛壶菌门均成显著(p< 0.05)负相关, 支持了Hu等^[8]的观点, 同样支持了Wang等^[2]提出DOM分子多样性与子囊菌门相关性高于担子菌门的观点。C3、 C4与真菌群落各门的相对丰度相关性均不显著, 再次表明类蛋白质组分与真菌群落的关系不明显, 这在一定程度上支持了Ma等^[9]的观点。