小球藻(Chlorella sorokiniana FZU60)藻种由福建省海产品废弃物综合利用工程技术研究中心提供, 采用Mann and Myer's培养基培养, 培养温度30 ℃、 光照强度 250 μ mol· m^-2· s^-1, 以0.15 vvm速率通入浓度2.5%的CO₂作为碳源, 以200 r· min^-1的速率进行磁力搅拌。

1.2.1 光谱成像系统搭建

因异养小球藻浓度高, 透射光谱成像的噪声较大, 所以均采用漫反射形式。 高光谱图像采集系统主要由双利合谱GaiaField-V10E内置推扫高光谱相机、 卤素灯、 暗箱及计算机等部件组成, 其中, 高光谱相机波长范围在386~1 035 nm, 光谱分辨率为2.8 nm。 快照式多光谱图像采集系统如图1所示, 由快照式多光谱相机(XIMEA, MQ022HG IM SM4× 4 VIS、 MQ022HG IM SM5× 5 NIR)、 卤素灯、 暗箱、 样本平台和计算机等部件组成。 其中VIS相机可获得480~635 nm光谱范围内13个波段的光谱图像, 光谱分辨率约为10 nm, 单波段图像分辨率为512× 272 pixels; NIR相机可获得在665~950 nm光谱范围内25个波段的光谱图像, 光谱分辨率约为10 nm, 单波段图像分辨率为409× 217 pixels。 VIS和NIR相机镜头均采用35 mm定焦镜头(Edmund, #67-714)。

图1

Fig.1

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	图1 快照式多光谱图像采集系统示意图Fig.1 Schematic of the snapshot spectral image acquisition system

1.2.2 样本制备及生物质含量、 叶黄素含量测量

叶黄素作为类胡萝卜素的一种, 在进行光谱分析时, 易与其他类胡萝卜素的光谱信号重叠, 为了确定叶黄素的有效光谱测量波段, 参考Qu等^[17]分析叶绿素a吸收光谱峰值的方法, 取一定量的叶黄素标准溶于95%乙醇溶液配置成5、 25和50 μ mol· L^-1三个浓度的叶黄素标准品溶液, 采集并分析其高光谱曲线。 小球藻培养过程中, 每隔24 h取一次样, 测定该阶段的生物质含量、 叶黄素含量, 并进行多光谱图像的采集, 取样周期共7 d, 对于高浓度藻液进行适当稀释, 每个样本采集两次取平均, 共计112个样本。

生物质含量采用文献[5]所述的分光光度计比对法测量, 叶黄素含量采用文献[18]所述高效液相色谱仪检测法进行测量。 小球藻叶黄素含量由生物质产量与叶黄素含量乘积获得。

1.2.3 光谱图像的采集及校正

采用高光谱系统依次采集叶黄素标准品溶液、 乙醇溶剂、 水以及小球藻三种浓度梯度的高光谱图像, 相机镜头与载物台相距30 mm, 卤素灯距载物台150 mm, 光源入射角度与竖直方向成45° 夹角, 曝光时间5.2 ms。 通过快照式多光谱系统采集小球藻样本的漫反射光谱图像, 设置镜头距载物台450 mm, 卤素灯距载物台350 mm, 为避免样本光照的不均匀及局部过曝, 统一调整光源入射角度与竖直方向成30° 夹角, VIS和NIR多光谱相机的曝光时间分别为2.0和8.0 ms, 为保证样本的一致性, 两台相机同时拍摄。 为消除光源分布不均及相机暗电流噪声的影响, 须对采集的样本光谱图像进行黑白校正, 全白图像、 全黑图像分别通过采集反射率99%的聚四氟乙烯板和盖上相机镜头来完成, 校正公式如式(1)^[19]

$R=\frac{\ \ \ \ \ {{I}_{\text{raw}}}\ \ \ -\ \ \ {{I}_{\text{dark}}}\ \ \ \ }{{{I}_{\text{white}}}\ \ \ -\ \ \ {{I}_{\text{dark}}}}\ \ \ \ $(1)

式(1)中, R为校正后的光谱图像; I_raw为校正前原始光谱图像; I_dark为关闭光源的全黑图像; I_white为标准白板图像。 获取图像后, 为减少样本背景信息的干扰, 通过ENVI 5.1(ITT Visual Information Solutions, United States)软件提取感兴趣区域(region of interest, ROI), ROI取样本光谱图像正中央50× 50 pixels, 以该区域内的像素平均值作为样本光谱反射率, 实验数据建模分析主要通过Matlab R2020a(The Math Works, Natick, USA)软件来完成。

1.3.1 特征波长的选择

光谱检测中会存在无效甚至干扰的冗余波长, 利用合适的波长选择算法可以降低维数, 在一定程度上提升模型的速度和精度。 常规的波长选择算法大多以高光谱数据为导向, 起到快速消除大量冗余或逐一对单个波长寻优的作用^[20], 快照式多光谱相机波长数量较少, 特征波长的选择需要逐一评估形成最佳波长组合。 SPA是一种前向循环选择算法, 通过投影排序与回归分析得到特征波长组合, 可降低特征波长组合的共线性, 在光谱的定性和定量分析中应用广泛^[21]。 但该算法缺乏任一波长对特征波长组合的有效性判断, 导致选中的特征波长组合中含有冗余或缺失关键性变量, 而SFFS可以在不断的正向检查和反向消除过程中获取最佳特征子集。 设计的mSPA算法是对SPA的回归分析部分采用SFFS改进, 具体算法流程如图2所示。

图2

Fig.2

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	图2 mSPA流程图Fig.2 Flow chart of mSPA

mSPA算法由为波长投影排序和波长集合优选两部分组成。 首先通过SPA循环计算随机选定的波长在未选入波长上的投影, 保证新选入的波长与原有波长组合共线性最低, 重复操作, 得到所有波长的投影排序。 而后, 根据波长排序依次将对应列向量输入波长集合优选部分, 如图2中红色区域, 利用SFFS交叉验证评估该波长对于集合所建立的预测模型精度是否增加, 若增加, 则保留该波长, 否则考虑下一个波长, 为避免在添加波长后陷入局部最优状态, 在入选新的波长后进行消除操作, 若删除任一波长使得模型的精度提高, 则删除该波长, 保留新的波长子集W, 记录当前的RMSECV。 当RMSECV不随波长变量的输入降低时, 将该波长子集作为mSPA筛选的最优波长组合。 为验证该算法在快照式多光谱波长选择的优势, 实验选择了SPA、 遗传算法(genetic algorithm, GA)^[22]、 随机蛙跳(random frog, RF)^[23]作为对比算法。

1.3.2 模型的建立与评价指标

为构建目标组分与光谱信息间的回归预测模型, 实验采用线性建模方法多元线性回归(multiple linear regression, MLR)和非线性建模方法极限学习机(extreme learning machine, ELM)建立小球藻生物质产量及叶黄素含量的预测模型。 MLR结构简单, 可用于多个自变量的回归分析, 是光谱数据建模的经典线性方法^[24]; ELM 是一种单隐含层前馈神经网络算法, 具有较强的非线性映射能力, 学习效率高^[25]。

根据不同组分、 波长选择算法及建模方法分别建立模型, 利用量化的评价指标对不同模型精度进行比较, 以预测集决定系数 Rp2、 预测集均方根误差(root mean square error of prediction, RMSEP)及剩余预测残差(residual predictive deviation, RPD)作为评价指标。 Rp2越接近1, RMSEP越小, 模型的预测性能越好, 当RPD> 3.0时, 模型具有良好的稳定性及预测精度^[26]。

采用随机划分^[27]的方法划分样本集, 为减小单次随机划分对模型结果的影响, 以多次随机抽样控制生物质含量和叶黄素含量的预测集样本均包含在校正集样本范围内, 校正集、 预测集的平均值和标准差的差值尽可能小, 进而保证样本均匀分布, 具有代表性。 将112个小球藻样本按3∶ 1的比例划分校正集和预测集, 样本划分结果如表1所示, 得到校正集样本84个、 预测集样本28个, 预测集样本均包含在校正集样本范围内, 校正集和预测集的平均值(标准差)接近, 说明样本划分合理。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 样本集划分后小球藻生物质含量和叶黄素含量的统计结果 Table 1 Statistical results of biomass content and lutein content of Chlorella sorokiniana after sample set division 项目 样本集 样本 数量 最小值 最大值 平均值 标准差 生物质含量/ (g· L-1) 校正集 84 1.664 10.261 4.580 2.646 预测集 28 2.075 8.003 4.680 2.469 叶黄素含量/ (mg· g-1) 校正集 84 0.336 1.295 0.627 0.293 预测集 28 0.420 1.051 0.681 0.258

表1 样本集划分后小球藻生物质含量和叶黄素含量的统计结果 Table 1 Statistical results of biomass content and lutein content of Chlorella sorokiniana after sample set division

叶黄素标准品溶液样本及乙醇溶剂的光谱曲线如图3所示, 与乙醇溶剂的光谱曲线相比, 叶黄素标准品溶液在388~525 nm存在多个波峰、 波谷, 并且在不同浓度梯度的叶黄素中, 光谱反射率与叶黄素含量呈显著负相关, 变化趋势基本一致, 排除样本异常, 故该区域内包含较为丰富的叶黄素光谱信息, 且可发现随着叶黄素的浓度的增大, 反射率越低, 说明光谱的吸收更强烈; 在950~1 030 nm范围内的微小变化, 可能是叶黄素中的O— H键所造成的, 但光谱信号非常弱。 实验结果说明叶黄素光谱响应强的波段集中在可见光区域, 这与邹小波等^[28]研究中所述色素检测波段大都在集中在可见光区域一致, 因此, 本实验采用VIS相机检测小球藻叶黄素含量。

图3

Fig.3

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	图3 水、 乙醇溶剂及5、 25、 50 μ mol· L-1叶黄素标准品溶液的高光谱曲线Fig.3 Original spectral curves of 5, 25, 50 μ mol· L-1 lutein standard solutions and ethanol solvent

图4、 图5分别是低、 中、 高三种浓度梯度的小球藻高光谱曲线以及NIR与VIS两台快照式光谱相机采集的所有小球藻样本光谱曲线。 在图4中, 不同光谱曲线形状相似, 随着小球藻浓度升高, 光谱反射率曲线整体逐渐下降, 在388~520 nm范围出现波谷, 主要是细胞内类胡萝卜素(包含叶黄素)的吸收产生的^[9], 这也与叶黄素标准品的反射光谱峰谷区相近。 图5中500 nm附近同样也出现色素吸收波谷。 640~705 nm范围光谱反射率与叶绿素含量密切相关, 图4和图5在这个范围内均有明显的波谷, 藻液中水的O— H键伸缩振动会在950 nm附近产生波谷。 叶绿素含量可以很好的反映生物质产量^[8], 因此选择NIR相机检测小球藻的生物质产量。

图4

Fig.4

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	图4 低、 中、 高三种浓度的小球藻高光谱曲线Fig.4 Hyperspectral curves of Chlorella sorokiniana samples with different concentrations (low, medium, and high)

图5

Fig.5

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	图5 小球藻原始光谱曲线Fig.5 Original spectral curves of Chlorella sorokiniana

如图6所示, 为mSPA选择特征波长的过程(以生物质含量为例)。 波长经投影排序后逐个迭代选择, 随着迭代次数的增加, RMSECV逐渐减小直至不变, 当迭代次数为16时, RMSECV首次达到最小值0.277, 此时的波长组合即是mSPA优选特征波长的结果。 经mSPA、 SPA、 GA及RF选择生物质含量和叶黄素含量光谱特征波长的结果如表2所示。 在665~950 nm的生物质含量特征波长中, 四种算法所选择的波长集中在710 nm, 位于叶绿素的吸收区附近^[29], 并且mSPA和GA筛选的波长相对更少。 在488~635 nm的叶黄素含量特征波长中, mSPA优选出5个波长, 所有算法均选择出497、 523 nm这两个波长, 这与叶黄素所在的388~525 nm吸收区相关, 说明这两个波长包含着小球藻叶黄素关键光谱信息。

图6

Fig.6

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	图6 RMSECV随迭代次数的变化Fig.6 RMSECV changes with the number of iterations

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 生物质含量和叶黄素含量的光谱特征波长选择结果 Table 2 Spectral feature wavelengths selection results of both biomass content and lutein content 项目 波长选择方法 波长数量 所选波长/nm 生物质含量/(665~950 nm) mSPA 7 665、 727、 752、 766、 779、 788、 814 SPA 9 665、 700、 710、 727、 752、 779、 841、 878、 950 GA 7 710、 727、 752、 779、 788、 841、 851 RF 8 686、 710、 779、 788、 841、 851、 863、 920 叶黄素含量/(488~635 nm) mSPA 5 497、 523、 575、 628、 635 SPA 6 497、 510、 523、 575、 620、 635 GA 6 497、 523、 575、 620、 628、 635 RF 4 497、 523、 620、 635

表2 生物质含量和叶黄素含量的光谱特征波长选择结果 Table 2 Spectral feature wavelengths selection results of both biomass content and lutein content

为了分析特征波长选择算法对建模的影响, 分别对比了mSPA与全波长, SPA、 GA、 RF三种常用特征选择算法, 表3所示为采用不同特征波长选择算法的MLR建模。 对于生物质含量模型, mSPA用7个波长建立的模型精度最高, 模型的 Rp2为0.939, RMSEP为0.750 g· L^-1, RPD为3.290, 相比于全波长和另外三种波长选择算法所建立的模型, 模型精度有明显的提升, SPA筛选出9个特征波长, 但模型的效果比全波长模型差, 说明算法可能将包含组分光谱信息的波长错误剔除或保留的波长中有的所含信息量较低, 使得模型精度降低。 在叶黄素含量的预测模型中, 只有mSPA构建的模型精度略优于全波长模型, 全波长模型的 Rp2为0.839, RMSEP为0.102 mg· g^-1, RPD为2.539, 基于mSPA建立的模型 Rp2为0.859, RMSEP为0.095 mg· g^-1, RPD为2.718, 全波长模型精度较高的原因可能是VIS相机只有13个波长, 冗余度不高, 筛选波长可能会导致有效信息的丢失, 该结果证明了实验所提出算法的优势, 在全波长数量较少时依然能够选择出精准的波长组合, 减少不必要的波长并提高检测精度。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 生物质含量和叶黄素含量的特征波长MLR建模结果 Table 3 MLR modeling results band on feature wavelengths of both biomass content and lutein content 波长选择 方法 生物质含量 叶黄素含量 波长 数量 Rc2 Rp2 RMSEP/ (g· L-1) RPD 波长 数量 Rc2 Rp2 RMSEP/ (mg· g-1) RPD 全波长 25 0.938 0.929 0.810 3.047 13 0.842 0.839 0.102 2.539 mSPA 7 0.951 0.939 0.750 3.290 5 0.881 0.859 0.095 2.718 SPA 9 0.916 0.903 0.949 2.601 6 0.840 0.828 0.105 2.459 GA 7 0.942 0.931 0.798 3.093 6 0.814 0.796 0.114 2.259 RF 8 0.932 0.901 0.958 2.578 4 0.799 0.775 0.120 2.149

表3 生物质含量和叶黄素含量的特征波长MLR建模结果 Table 3 MLR modeling results band on feature wavelengths of both biomass content and lutein content

同理, 采用ELM对生物质含量和叶黄素含量的全波长和特征波长建立模型, 结果如表4所示。 在生物质含量和叶黄素含量的预测效果上, mSPA所建立的模型精度仍最高, Rp2分别为0.947和0.907, RMSEP分别为0.698 g· L^-1和0.077 mg· g^-1, RPD分别为3.535和3.338。 本实验所建立的生物质含量模型在精度和预测范围上均高于文献[8], 叶黄素模型精度高于类似研究^[28]中黄瓜叶片叶黄素模型的预测相关系数0.826 2, 证明本实验所建立的模型效果较好。 一定程度上ELM模型效果优于MLR模型, 对比采用SPA、 GA、 RF选择特征波长, mSPA所选择的特征波长数量少, 在MLR和ELM模型上各项指标均最佳, 并且mSPA-ELM的模型精度最高。 因“ 包络效用” 的存在, 色素含量与吸收系数之间并不是简单的线性关系, 而是一种复杂的非线性变化^[30], ELM作为一种非线性建模方法, 可以在小球藻生物质含量、 叶黄素含量与光谱信息间建立解释性更强的数学关系。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 生物质含量和叶黄素含量的特征波长ELM建模结果 Table 4 ELM modeling results based on feature wavelengths of both biomass content and lutein content 波长选择 方法 生物质含量 叶黄素含量 波长 数量 Rc2 Rp2 RMSEP/ (g· L-1) RPD 波长 数量 Rc2 Rp2 RMSEP/ (mg· g-1) RPD 全波长 25 0.908 0.878 1.065 2.319 13 0.898 0.879 0.088 2.932 mSPA 7 0.964 0.947 0.698 3.535 5 0.917 0.907 0.077 3.338 SPA 9 0.910 0.883 1.041 2.371 6 0.908 0.882 0.082 3.147 GA 7 0.935 0.929 0.815 3.031 6 0.875 0.867 0.092 2.792 RF 8 0.937 0.920 0.863 2.860 4 0.901 0.866 0.093 2.780

表4 生物质含量和叶黄素含量的特征波长ELM建模结果 Table 4 ELM modeling results based on feature wavelengths of both biomass content and lutein content

基于mSPA筛选出的光谱特征波长, 分别从VIS和NIR图像中提取特征波长对应的特征图像, 并根据相机位置固定, 采用提前配准得到的变换矩阵实现各波段图像像素点的对齐, 避免因相机视角不同而造成的差异, 得到配准后特征图像的感兴趣区域, 以最佳预测模型ELM计算出图像逐个像素点的生物质含量及叶黄素含量。

叶黄素含量(mg· L^-1)可表示为生物质含量(g· L^-1)和叶黄素含量(mg· g^-1)图像上对应像素点的乘积, 生成不同培养周期下的小球藻叶黄素含量可视化分布伪彩图, 如图7所示。 从蓝色到红色表示含量逐渐升高, 颜色越红, 产量越高。 整体上, 小球藻叶黄素含量表现出随着培养时间的增加而增加, 并且藻体分布不均匀, 藻细胞聚集现象明显。 在实际生产中, 小球藻叶黄素的产量需要综合分析生物质含量和叶黄素含量这两个因素, 培养初期生物质含量升高而叶黄素含量低, 培养末期, 生物质含量平缓而叶黄素含量提升^[31]; 不同的培养方式对微藻的生物质含量和叶黄素含量影响也不同, 例如自养条件下, 微藻生长缓慢, 可积累较高的叶黄素含量, 通过异养培养则可明显提高生物质含量, 但又会导致叶黄素含量降低^[32]。 结果表明NIR-VIS快照式多光谱联用可快速检测叶黄素产量的变化, 对培养过程中营养素补充、 搅拌、 通气等操作进行有效指导, 同样还可以根据叶黄素产量来判断收获时间, 提高经济效益和生产效率。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 不同培养周期下小球藻叶黄素产量的可视化Fig.7 Visualization of Chlorella sorokiniana lutein production under different culture cycles