实验仪器选用了Princeton公司生产的TriVistaTMM555CRS微区三级拉曼光谱检测仪。 配置OLYMPUS的10倍放大物镜、 CCD探测器, 液氮制冷温度为-120 ℃; 激发光源为532 nm的半导体激光器(长春镭仕光电科技有限公司MW-GL型), 激光线宽为0.1 nm, 激光功率范围为0~500 mW。 实验室墙壁反射率< 3%, 尘埃浓度为3× 10⁵(≥ 0.5 μ m· m^-3)。

玉米淀粉(CAS号: 9005-25-8)、 叶黄素(CAS号: 22388-89-2)分析纯均来自于阿拉丁试剂(上海)有限公司, 所有试剂无需进一步提纯即可使用; 实验用玉米样品来自于吉林省松原粮食集团与吉林省农业科学院的国储库玉米储备粮, 其储存年份分别为2018年、 2019年、 2020年, 并于2021年12月份开始实验, 挑选颗粒饱满、 表面光滑、 无损伤的玉米粒, 对纵切后的玉米粒使用锉刀将待测表面磨平, 以消除因表面不平带来的实验误差, 设备流程图如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 实验流程图Fig.1 Experimental flow chart

对仪器进行校准后, 将待测样品放在清洁后的载玻片上, 聚焦并采集其拉曼光谱, 在采集光谱之前使用激光持续照射样品120 s以降低荧光背景干扰, 所采集光谱的波长范围为400~1 800 cm^-1。

本研究中大分子的理论计算与优化均基于DFT理论实现。 DFT是一种量子化学计算方法, 主要用于理论预测分子的拉曼光谱。 由于大部分生物质分子主要由C, H, O, N等轻元素组成, 而Becke提出的Becke交换泛函(B3)和Lee、 Yang、 Parr提出的LYP相关泛函(LYP)在轻元素构成的分子理论计算中被广泛应用, 故采用B3LYP泛函来计算这些分子的拉曼光谱, 其表达式如式(1)

EXCB3LYP=aHFEXHF+(1-aHF)ELSDAX+axΔEXB88+(1-aC)ECVWN+aCECLYP(1)

式(1)中, EXLSDA表示局域自旋密度近似(local spin density approximation, LSDA) 交换泛函; ΔEXB88表示Becke88(B88)交换泛函, 是对LSDA的梯度校正部分; ECVWN表示广义梯度近似(local density approximation, LDA)形式的VWN(wilk and nusair, Vosko)相关泛函; 而 ECLYP则表示广义梯度近似(generalized gradient approximation, GGA)形式的LYP相关泛函。

类胡萝卜素存在于红色与黄色的蔬菜水果中, 是一类天然色素的总称, 其内部含有一系列共轭双键和甲基支链, 是一类高度不饱和多烯化合物, 叶黄素作为类胡萝卜素中的一种, 其化学式为C₄₀H₅₆O₂, 相对分子量为568.85。 类胡萝卜素的拉曼信号强度可以很好地反映作物、 水果的新鲜度, 是生物中的天然色素, 广泛存在于蔬菜、 花卉、 水果等植物中^[5]。 本研究以叶黄素代指玉米中所含类胡萝卜素, 使用软件对其分子结构进行优化。 采用B3LYP/3-21G基组对初始结构进行粗优化, 在得到的优化结构的基础上, 选择B3LYP/6-311+G(d, p)基组进行再优化, 其结构式与优化后的空间结构如图2、 图3所示(图中给出了各原子的名称和编号)。

图2

Fig.2

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	图2 叶黄素分子结构式Fig.2 Chemical structural formula of Lutein

图3

Fig.3

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	图3 优化后的叶黄素分子空间结构Fig.3 Optimized structure of Lutein

结合DFT理论, 用6-311+G(d, p)基组计算并得到了叶黄素分子的理论拉曼光谱; 对拉曼光谱仪校准后, 得到对应分析纯的实际测量光谱, 积分时间为1 s, 积分次数为1次, 波长范围为400~1 600 cm^-1。 图4(a, b)分别为叶黄素理论计算所得光谱及实验拉曼光谱的对比结果。

图4

Fig.4

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	图4 叶黄素分析纯的(a)理论拉曼光谱与(b)实验拉曼光谱比较Fig.4 Comparison of the (a) theoretical Raman spectrum and the (b) experimental Raman spectrum of Lutein analytical pure

观察叶黄素分子理论拉曼各谱峰的振动形式, 对其振动模归属进行指认, 见表1。 根据频率和振动方式的不同, 将振动分为5类。 在800 cm^-1波段之前, 拉曼活性较弱, 没有发现较明显的拉曼谱峰; 在999 cm^-1波段, 出现的谱峰主要由— CH₃摇摆振动引起; 在1 158、 1 193和1 272 cm^-1波段, 谱峰主要由C— C伸缩振动引起, 位于1 158 cm^-1处的拉曼峰强度最高; 在1 457 cm^-1波段, 出现的谱峰主要由— CH₃变形振动引起; 在1 528和1 598 cm^-1波段, 出现的谱峰主要由多烯链上的C=C伸缩振动引起, 位于1 524 cm^-1处的拉曼峰强度最高, 与文献中的结果较为吻合。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 叶黄素分析纯实验与理论振动频率与归属 Table 1 Experimental and theoretical vibration frequency and attribution of Lutein Analytical Pure Raman shift cAssignment aTheoretical /cm-1 bExperimental /cm-1 968[6] 955.1(m) ρ (— CH2)[6] 999(w)/1 008[6] 1 006.0(w) ν (— CH3) 1 158(m)/1 151[6] 1 157.5(m) ν (C— C) 1 193(w)/1 198[6] 1 192.0(m) v(C=C), ρ (— C— H) ρ (— CH3) 1 272(w)/1 279[6] 1 267.9(w) ρ (— C— H), ρ (— CH2), ν (C— C) 1 457(w)/1 456[6] 1 443.9(w) asym. δ (— CH3) 1 528(s)/1 527[6] 1 524.8(s) v(C=C), δ (— CH3) Note: a Calculated were number at B3LYP/6-311+ g(d, p) basis sets of theory; b s: strong; m: medium; w: weak; cδ : deformation; ρ : rocking; τ : torsion; s: symmetric; as: asymmetric; ν : stretching

表1 叶黄素分析纯实验与理论振动频率与归属 Table 1 Experimental and theoretical vibration frequency and attribution of Lutein Analytical Pure

淀粉广泛存在于植物的须根与种子中, 是高等植物常见的组分, 也是碳水化合物储藏的主要形式, 在为人类提供能量与营养方面起到了重大作用, 其分子式为(C₆H₁₀O₅)_n, 其结构式与优化后的空间结构如图5、 图6所示(图中给出了各原子的名称和编号), 并对其振动模归属进行指认, 整理归纳于表2。

图5

Fig.5

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	图5 玉米淀粉分子结构式Fig.5 Chemical structural formula of corn starch

图6

Fig.6

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	图6 优化后的分子空间结构Fig.6 Optimized structure of corn starch

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 玉米淀粉分析纯拉曼特征振动归属 Table 2 Experimental and theoretical vibration frequency and attribution of Corn Stasch Analytical Pure Raman shift cAssignment aTheoretical /cm-1 bExperimental /cm-1 478.5(s) 478.3(s) τ (C— C)、 ρ (C— O) 584.1(w) 573.0(w) τ (C— O— C)、 ν (C— C)[7, 8] 855.4(m) 860.1(m) δ (— CH2) 950.8(w) 942.3(m) ν (C— C)、 τ (C— O— H)、 ν (C— O) 1 087.5(s) 1 085.7(s) ρ (— CH2)、 ρ (C— O— H) 1 131.0(m) 1 130.9(s) ρ (— CH)、 ν (C— O) 1 261.5(w) 1 261.5(w) τ (C— O— H)、 ν (C— C) 1 342.3(m) 1 342.1(s) ρ (— CH2) 1 385.8(w) 1 382.7(s) ρ (— CH2)、 τ (C— O— H)[7, 8] * 1 462.9(m) τ (— CH)、 τ (— CH2)、 τ (C— O— H)[7, 8] Note: a Calculated were number at B3LYP/6-311+g(d, p) basis sets of theory; b s: strong; m: medium; w: weak; cδ : deformation; ρ : rocking; τ : torsion; s: symmetric; as: asymmetric; ν : stretching

表2 玉米淀粉分析纯拉曼特征振动归属 Table 2 Experimental and theoretical vibration frequency and attribution of Corn Stasch Analytical Pure

玉米淀粉分析纯的拉曼光谱如图7(a, b)所示, 可将振动分为3类: 400~800 cm^-1处的振动是由于糖苷环骨架的弯曲振动^[7]; 800~1 200 cm^-1处的振动是C— O和C— C键的特征伸缩振动以及糖苷键中C— O— C的弯曲振动^[9]; 1 200~1 500 cm^-1处的振动富含结构信息, 糖类化合物的拉曼光谱在此处显示出部分振动特征^[10]。

图7

Fig.7

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	图7 玉米淀粉分析纯的(a)理论拉曼光谱与(b)实验拉曼光谱比较Fig.7 Comparison of the (a) theoretical Raman spectrum ofcorn starch and the (b) experimental Raman spectrum of corn starch analytical pure

考虑到光漂白效应, 为确保能够得到最佳的背景信号, 随机挑选三个年份的玉米至少5粒以上, 并对每粒玉米的5个点位进行测量, 在测量后取其平均值以达到减少误差。 图8分别为2018年、 2019年、 2020年三个年份贮藏的玉米粮表面(a)及纵切部分(b)的拉曼光谱对比图。

图8

Fig.8

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	图8 三个不同储存年份玉米粮表面(a)与纵切面(b)的拉曼光谱对比Fig.8 Comparison of Raman spectrum of the (a) surface and the (b) longitudinal section of corn grain from three different storage years

拉曼光谱同时采集了拉曼信号和荧光信号且荧光信号较强, 而荧光信号在拉曼光谱检测中一般被视为背景噪声, 为消除荧光信号做进一步分析, 使用离散傅里叶变换(fast Fourier transform, FFT)对光谱降噪并进行基线校正, 图9为光谱处理后的结果, 将其与计算的分子光谱对比后标记出其所在拉曼峰位。

图9

Fig.9

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	图9 三个不同储存年份玉米粮预处理后的拉曼光谱(表面)及其与叶黄素、 玉米淀粉分子光谱对比Fig.9 Comparison of molecular spectrum of lutein, corn starch and the three different storage years of corn grain Raman spectrum after pretreatment

对玉米表面的拉曼光谱进行滤波并校正处理后, 可以看出其在476、 1 006、 1 156、 1 459、 1 519、 1 597和1 633 cm^-1附近处有拉曼振动。

475~485和1 450~1 460 cm^-1处的拉曼峰是鉴定样品是否含有淀粉的标志之一, 其强度、 频移大小与直链淀粉与支链淀粉的含量相关^[11]。 在三个不同年份玉米外表壳的拉曼光谱中, 淀粉存在的拉曼峰强小, 振动较为微弱, 表示淀粉在玉米外壳上的存在。

作为一种标记物质, 类胡萝卜素在生物基质中的存在可以通过拉曼光谱中的三个显著波段推断, 这三个波段通常出现在993~1 021、 1 151~1 179和1 510~1 536 cm^-1, 分别归属于多烯骨架C— CH₃摇摆振动、 多烯链C— C伸缩振动、 多烯链C=C伸缩振动。 代表叶黄素含量的拉曼峰1 006、 1 156和1 519 cm^-1, 其峰强度随储存时间延长有下降趋势, 表明其叶黄素物质含量的增加。

于1 600、 1 634和1 686 cm^-1附近的拉曼峰表示着木质素的存在, 主要由芳香环骨架弯曲振动与松柏醛C=C双键的伸缩振动引起^[12]。 其中1 686 cm^-1的拉曼峰仅在储存年份为2019年的玉米中被发现, 可能是因为该年份玉米在储藏过程中被氧化, 外表壳上的木质素发生了酸解反应引起了内部物质的变化。

对玉米纵切面的拉曼光谱进行滤波并校正处理后, 可以看到相较于玉米表面部分的拉曼光谱, 该部分有着更为丰富的光谱信息, 除了位于476、 1 006、 1 156、 1 459和1 519 cm^-1已经发现的拉曼峰, 在865、 944、 1 080、 1 129、 1 260、 1 338、 1 378和1 456 cm^-1附近处还发现了新的拉曼峰, 而位于1 600、 1 634和1 686 cm^-1的拉曼峰则几乎无法被看到, 表明木质素仅存在于玉米的外表壳部分。

在图8(b)的基础上, 对原始光谱进行预处理后, 以最大峰强对光谱进行归一化, 所得到的分峰光谱如图10所示, 并将该部分拉曼峰峰强、 半高宽(full width at half maxima, FWHM)值、 相对峰面积汇总于表3。 其中为凸显三年份玉米之间峰面积的区别, 计算了2018年、 2019年份玉米拉曼特征峰的相对峰面积R_x。 相对峰面积是以储存年份为2020的玉米光谱(即样品c)的各拉曼峰为标准峰来计算400~1 800 cm^-1的相对峰面积, 计算公式为

Rx=PxP2020(2)

式(2)中, R_x为x处拉曼峰相对峰面积; P_x为x处拉曼峰面积; P₂₀₂₀为储存年份为2020年玉米的各拉曼峰峰面积。

图10

Fig.10

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	图10 三个不同储存年份玉米粮(纵切面)预处理后的分峰光谱Fig.10 Peak spectra of corn grains (longitudinal section) pretreated with three different storage years

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 分峰拟合后所得拉曼峰的相对峰强、 FWHM值、 相对峰面积Rx Table 3 The data of Rel. Intensity, FWHM value and Rel. Area of Raman Peak by peakfit Sample Raman shift 476 cm-1 863 cm-1 943 cm-1 1 260 cm-1 1 338 cm-1 1 378 cm-1 Rel. Intensity a 0.54 0.10 0.15 * 0.17 0.08 b 0.28 0.09 0.09 0.07 0.14 0.09 c 0.21 0.06 0.08 0.04 0.04 0.03 FWHM a 0.54 0.10 0.15 * 0.17 0.08 b 0.28 0.09 0.09 0.07 0.14 0.09 c 0.21 0.06 0.08 0.04 0.04 0.03 Sample Raman shift 476 cm-1 863 cm-1 943 cm-1 1 260 cm-1 1 338 cm-1 1 378 cm-1 Sum Rel. Area of Raman Peak Rx a 2.68 0.84 0.90 * 3.20 1.48 9.1 b 1.46 1.36 0.70 3.64 2.70 3.39 13.4

表3 分峰拟合后所得拉曼峰的相对峰强、 FWHM值、 相对峰面积Rx Table 3 The data of Rel. Intensity, FWHM value and Rel. Area of Raman Peak by peakfit

于475、 863、 944、 1 260、 1 338和1 378 cm^-1附近处峰位与玉米淀粉分析纯实际测量峰位基本一致, 是淀粉存在的表现之一, 其表明相比于外表壳部分, 玉米粒内部淀粉含量更加丰富。 玉米淀粉中的主要成分为直链淀粉、 支链淀粉与抗性淀粉^[13]。 随着储存年份的增加, 位于该波段的整体拉曼峰面积呈现出先增大后减小的趋势, 分析认为由于颗粒被氧化, 其内部所含的淀粉先因老化而使直链淀粉在其中占比增加, 从而导致拉曼峰面积变大; 而在淀粉老化的过程中, 同时会形成一种抗性淀粉, 以阻止其继续老化, 从而使直链淀粉的占比降低, 减小了拉曼峰的面积。 由于直链淀粉的含量仍趋于上升趋势, 因此拉曼峰强度依然随储存年份增加而增大。

FWHM值可用于描述淀粉结构短程有序性, FWHM值越低, 表明了其中形成了更多有序的结构^[14]。 各拉曼峰的FWHM值呈总体下降趋势, 可能是由于其中的淀粉分子随时间延长, 原本松散的分子链逐渐并拢, 相邻分子间的氢键逐渐结合, 部分分子完成了从无序结构到有序结构的转变, 这与玉米淀粉老化的机理基本一致。 位于1 080 cm^-1处的拉曼峰只出现在2018年、 2019年储存的玉米光谱中, 且随储藏时间延长, 峰强增大, FWHM值减小; 而位于1 129 cm^-1处的拉曼峰只出现在储存年份为2019年、 2020年的玉米光谱中, 且随储存时间延长, 拉曼峰强度减小, FWHM值减小; 而位于1 192 cm^-1处的拉曼峰只存在于2020年份的玉米光谱中。 这一部分的拉曼峰多由葡萄糖单体振动产生, 可能代表着淀粉内某种糖类物质之间的相互转换, 可作为判断玉米储存年份的特征峰。

将1 006、 1 155和1 519 cm^-1附近拉曼峰强、 峰面积值整理于表4, 并对峰强、 峰面积值做与年份相关的线型拟合。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 分峰拟合后所得拉曼峰的峰强、 峰面积值 Table 4 The data of Raman intensity and Raman peak area by peakfit Sample Raman shift 1 006 cm-1 1 155 cm-1 1 519 cm-1 Rel. Intensity 2018 0.11 0.45 0.33 2019 0.15 0.52 0.48 2020 0.25 0.79 0.87 Rel. Area of Raman Peak Rx 2018 1.63 6.05 6.60 2019 2.81 9.42 11.75 2020 4.23 11.19 22.82

表4 分峰拟合后所得拉曼峰的峰强、 峰面积值 Table 4 The data of Raman intensity and Raman peak area by peakfit

该处拉曼峰可以表示叶黄素含量的大小, 其峰强值、 峰面积值皆与时间成负相关关系, 验证了之前对于类胡萝卜素类物质外渗的猜测; 而图11为线性拟合后的效果, 拟合系数均超过0.9, 拟合程度较好, 说明这三处拉曼峰的峰强、 相对峰面积随时间延长而持续减少且其下降速度具有线性关系, 表示玉米纵切部分的叶黄素含量随储存时间变化在减少, 验证了对于类胡萝卜素类物质外渗的猜测, 位于该部分的拉曼峰分别归属于多烯骨架上的C— CH₃摇摆振动、 多烯链上的C— C伸缩振动、 多烯链上的C=C伸缩振动, 1 006 cm^-1附近的拉曼峰强度值与峰面积值相对于其他两个峰最小, 且随时间变化最轻微, 体现出在相同的激光照射强度下, — CH₃键与光子之间发生的非弹性碰撞较为轻微, 因此变化幅度较小; 其余拉曼峰峰强与峰面积随储存时间延长变化程度均有不同程度的变化, 表明叶黄素的流失对化学键振动均有不同程度的影响, 其中对C=C双键的伸缩振动影响最大。

图11

Fig.11

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	图11 不同年份玉米在1 006 cm-1(a)、 1 155 cm-1(b)、 1 519 cm-1(c)处拉曼峰峰强、 峰面积值线性拟合结果Fig.11 Results of linear fitting of Raman peak intensity and peak area values of maize at 1 006 cm-1 (a), 1 155 cm-1 (b) and 1 519 cm-1 (c) in different years