采用实验室自主研发的仪器, 激光器中心波长为532 nm(连续工作模式, 横向工作模式: TEM00, 激光功率为30 mW, 谱线宽度小于0.003 nm)血液样品通过注射器注入密封瓶, 通过仿生心脏在仿生管里流动, 仿生血管直径3 mm, 壁厚0.5 mm, 血液在管中的流速为0.42 mL·(s·mm²)^-1, 测试完成后回收到废液瓶统一处理。 实验用到的血液样本由拱北海关提供, 每条光谱的曝光时间为5 s, 采用Nova拉曼光谱仪, 光谱记录范围535~635 nm, 分辨率为0.3 nm。 向后的拉曼信号依次通过40倍奥林巴斯显微镜物镜, 二向色分光镜(DS), 和超长边滤光镜(ULEF), 最后由耦合镜收集到光谱仪中进行记录。 光路示意图和仪器实物如图1(a)和图1(b)所示。

图1

Fig.1

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	图1 (a)光路示意图, (b)仪器实物图Fig.1 (a) optical pathway diagram; (b) the photo of the instrument

实验前采集的猪、 马、 鸽、 鸡、 鸭、 鹅六种动物的新鲜血液, 每种血液取自30个供体动物, 供体动物雌雄均有, 用PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)塑料试管盛放新鲜血液, 使用EDTA(乙二胺四乙酸)作为抗凝剂, 先将新鲜血液放入-25 ℃冰箱中冷冻处理24 h, 然后对冷冻血液进行解冻处理, 每种解冻的动物血液取1 mL, 将其与10 mL生理盐水按照1∶10的比例混合稀释, 稀释后再次放入-25 ℃冰箱冷冻处理, 预处理后的血液样本可以多次重复使用。 将处理后的样品放入密封瓶, 利用仿生心脏泵使样品流动起来, 对激光聚焦区域进行拉曼光谱检测, 每次采集下一物种血液光谱之前, 仿生血管内通入纯净水, 直至废液瓶中液体完全无色, 防止不同样品之间互相污染。 选取6个物种共536条光谱数据(其中猪94条, 马115条, 鸽89条, 鸡85条, 鸭75条, 鹅78条)。 实验结束后, 通过废液瓶收集血液。

采集得到的光谱信息不仅包括与属性有关的信息, 还有背景噪声等干扰, 所以在对血样进行分类前, 需要对光谱进行预处理。

截取拉曼频移为500~1 800 cm^-1, 使用BEADS算法^[7](Baseline Estimation and Denoising with Sparsity)对原始的536条光谱数据进行去基线, 去除荧光背景和噪声, 使用Python自带的numpy库的convolve函数对光谱数据平滑, 窗口设为1, 最后对去噪后的数据进行归一化处理。

图2(a)为原始光谱, 图2(b)为预处理后的光谱图, 六种动物共有的特征峰位于677, 754, 974, 1 174, 1 228, 1 306, 1 340和1 377 cm^-1等位置, 通过查阅文献, 这些谱峰对应的分子振动模态如表1^{[8, 9, 10, 11, 12]}, 未在图中标注的峰代表血红蛋白、 氨基酸等血液成分中的生物分子的振动, 仅从特征峰的位置无法准确分辨, 需要通过算法进一步特征提取和分类。

图2

Fig.2

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	图2 (a)原始光谱, (b)预处理后的光谱Fig.2 (a) original spectrum, (b) spectra after pretreatment

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 六种动物全血特征峰对应分子振动模态 Table 1 Molecular vibration modes corresponding to characteristic peaks of six animal’ s whole blood Position/cm-1 Assignment Reference 677 Ring breathing vibrational mode of Guanine (680 cm-1) Ring breathing modes in the DNA (678 cm-1) [8](672)[9] 754 Symmetric breathing vibrational mode of Tryptophan (760 cm-1) Symmetric breathing vibrational mode of tryptophan (755 cm-1) [8](752) [9-10] 974 C—C stretching β -sheet of proteins (980 cm-1) =CH bending of lipids (980 cm-1) [8, 10] 1 174 C—H bending tyrosine (proteins) (1 176 cm-1) [8](1 169) [10] 1 228 Amide Ⅲ (β sheet structure) (1 224 cm-1) [10](1 226) [9](1 248) 1 306 CH3/CH2 twisting or bending mode of lipid/collagen (1 307 cm-1) [9](1 311) [10](1 306) 1 340 CH deformation vibrational mode of proteins and carbohydrates) (1 342 cm-1) [10](1 337) [8](1 335) 1 377 δCH3 symmetric (lipid assignment) [8](1 373) [9](1 374) 1 400 C=O symmetric stretch, CH2 deformation, NH in-plane deformation (1 398/1 400 cm-1) [9](1 398) [10](1 397) 1 430 CH2 scissoring (1 436 cm-1) CH2 deformation (lipid) (1 437 cm-1) [10](1 430) [8](1 423) 1 550 Tryptophan (1 548 cm-1) [9](1 549) [8](1 544) 1 588 Carbon particles (1 590 cm-1) C=N and C=C stretching in quinoid ring (1 593 cm-1) [9](1 582) [8](1 582) 1 638 Amide Ⅰband (protein band) (1 640 cm-1) [9](1 638) [8](1 636)

表1 六种动物全血特征峰对应分子振动模态 Table 1 Molecular vibration modes corresponding to characteristic peaks of six animal’ s whole blood

通过算法进行物种识别的时候, 主要分为两个步骤: 降维和分类。 总体的算法流程如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 AFSA-SVM算法流程Fig.3 AFSA-SVM flow chart

2.2.1 降维

光谱数据中含有大量的冗余信息, 需要对预处理后的光谱数据进行降维处理, 为下一步分类做准备。 采用线性判别分析(LDA)的方法, 考虑数据的标签, 是一种有监督的降维方法^{[13, 14]}, 目标是使投影的方向类内方差小, 类间方差大, 被广泛地用于降维和特征提取。

预处理后的光谱数据为406维(拉曼频移在500~1 800 cm^-1范围内有406个像素点), 将其降至3维, 前三个主成分的贡献率分别为86.4%, 7.3%, 3.7%, 总计达到97.4%。 猪和马作为哺乳动物, 血液成分和禽类有很大差别, 而四种家禽中, 鸡和鸽与其他两种区分度较大, 鸭和鹅同属雁形目动物, 光谱相似性较高, 难以完全区分。 图4为使用LDA对光谱数据降维后的可视化结果。

图4

Fig.4

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	图4 LDA降维后可视化Fig.4 Visualization results after LDA dimensionality reduction using LDA

2.2.2 分类

采用支持向量机^[15](SVM)对降维后的血液数据进行分类, 以准确率最高为目标, 采用人工鱼群算法(AFSA)对支持向量机(SVM)的关键参数进行优化。

SVM的核函数选用高斯核(RBF), 把样本数据映射到高维空间, RBF核应用范围最广且对数据有良好的适应性, 相比于多项式核函数, 需要更少的参数。 RBF核有两个重要的参数, 惩罚因子C和γ。 C表示对分类误差的宽容度, γ做为支持向量影响半径的倒数, 调节这两个参数。

人工鱼群算法(AFSA)是Li提出的一种仿生优化算法^[16]。 模仿人工鱼的聚群、 追尾和觅食行为, 通过多条人工鱼同时进行寻优, 达到鱼群中各个体的局部寻优, 从而在群体中凸显全局最优解。 (C, γ)为每条人工鱼X_i, 支持向量机准确率为F, 目标为找到F(C, γ)的最大值, 以测试集的分类准确性作为鱼群食物浓度的好坏评价, 建立如式(1)和式(2)模型

maxF(C, γ)(1)

s.t.C∈[2-8, 28]γ∈[2-8, 28](2)

具体的寻优过程为图5(a)所示, 相比于传统的网格搜索法, 人工鱼群算法可以在连续的超参数空间进行搜索, 不局限于离散的网格点, 可以更好地发现超参数C和γ之间的非线性关系, 提高搜索效率, 更快收敛。 同时, AFSA算法还具有较好的全局搜索能力, 能够在参数空间中广泛搜索, 避免陷入全局最优解。 初始化鱼群时, 设置一些固定参数值, 鱼群规模为50, 最多试探次数try_number=200, 感知距离visiual=0.6, delta=0.618, 最大迭代次数MAXGEN=80, 步长step=0.5。 使用AFSA优化支持向量机参数的过程如图7所示, 最终得到最优的C为0.20, g为0.134, 得到的测试集的准确率为97.2%。 参数寻优的结果如图5(b)所示。

图5

Fig.5

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	图5 (a) AFSA-SVM模型收敛过程, (b) AFSA-SVM寻优结果Fig.5 (a) convergence process of AFSA-SVM model, (b) optimum results of AFSA-SVM

为了表明AFSA-SVM算法的优越性, 与决策树dt^[17]、 随机森林rf^[18]、 高斯朴素贝叶斯bnb、 Adaboost^[19]四种算法进行比较, 几种算法均按照训练集0.7, 测试集0.3的比例划分。 分别从测试集整体准确率和F1分数两个维度来考量。 在准确率方面, 五种算法的准确率分别为97.2%, 93.7%, 93.7%, 84.6%和68.5%, 如表2所示。 AFSA-SVM具有显著优势。 F1分数^[20]是精确率precision与召回率recall的调和平均数, 如式(3), 只有当精确率和召回率都大的时候, F1才有较大取值。 可以看出, AFSA-SVM, 决策树和随机森林的F1都达到了1, 表示对猪、 马、 鸽、 鸡的分类准确性达到了100%, 鸭和鹅的准确率AFSA-SVM略高于决策树和随机森林, 高斯贝叶斯和Adaboost对鸽、 鸭、 鹅的分类效果都比AFSA-SVM逊色很多。

F1=2·precision·recallprecision+recall(3)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 五种算法的实验结果 Table 2 Accuracy of five algorithms Algorithm Accuracy/% AFSA-SVM 97.2 dt 93.7 rf 93.7 bnb 84.6 adaboost 68.5

表2 五种算法的实验结果 Table 2 Accuracy of five algorithms

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 五种算法的F1-score实验结果 Table 3 F1-scores of five algorithms F1-score Algorithm AFSA-SVM dt rf bnb adaboost Pig 1 1 1 1 1 Horse 1 1 1 1 1 Pigeon 1 1 1 0.91 0.51 Chicken 1 1 1 1 1 Duck 0.86 0.82 0.78 0 0 Goose 0.86 0.82 0.76 0.73 0

表3 五种算法的F1-score实验结果 Table 3 F1-scores of five algorithms

由算法的分类结果, 对哺乳动物的分类效果优于禽类, 鹅和鸭同属雁形目下的鸭科, 亲缘关系非常相近, 反映在光谱上的差异也不明显, 故这两个物种的分类效果不如其他四种。 可从表2和图6直观地看出5种算法的分类结果。

图6

Fig.6

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	图6 五种算法的F1分数Fig.6 F1-scores of five algorithms