SERS活性基底的制备一直是该技术最重要的研究领域, 对于扩大它的研究范围和应用领域起着重要的作用。 通过分析由于金属基底变化而引起的信号改变来检测DNA序列, 它的主要特点不在于被检测物质本身, 而是侧重基底物质对被检测物质的重要影响。 该检测方法对于DNA的信号检测极其灵敏和均一。 由于DNA碱基表现出特异的拉曼光谱而区别于其他杂质, 可以实现核酸的单碱基分析, 因此这种实时表征技术在基因分析中有较好的应用前景。

很多新型的微生物大分子, 如病原抗体免疫蛋白和抗原核酸等, 由于分子散射结构纵向的和横向的截面比较小, 难以直接通过采用SERS技术对其进行定量或定性检测。 分子信标与靶分子互补并结合分子信标构型变化引起的SERS信号变化可以用来检测基因, 它的主要特点在于被检测物质本身, 通过修饰拉曼活性结构以形成各种DNA探针, 利用信标构型的不断变化所产生导致的SERS拉曼信号变化来确定目标DNA含量和DNA序列。 目前乳腺癌、 登革热、 胰腺疾病、 沙眼、 HIV病毒等基因分析都已经通过分子信标SERS分析取得成功。

拉曼光谱由于具有探测细胞内部生色团分子振动的高度选择性和对于分子复合体的结构变化高度敏感性而得到了广泛应用。 DNA组成、 结构修饰以及反应性DNA损伤的SERS光谱表现出不同的特征峰。 离子介导级联放大策略的SERS光谱, 检测DNA可以提供不同物种的遗传特性, 了解遗传资源的高度多样性。 当生物成分复杂, 利用SERS进行指纹分析时, 会发现高度重叠的光谱会阻碍样品的鉴定。 因此, Kim等提出了高维SERS指纹方法, 为生物分子识别、 分类、 样本鉴定开辟一条新的途径。 当进行DNA或RNA多个组分同时测定时, SERS特征光谱的谱峰值变化很小, 通过在各个基因片段上连接不同的拉曼活性物, 形成具有不同拉曼特征光谱的探针标记物, 实现多组分基因分析。 这种阵列式无标记高维传感系统在分析复杂生物基质方面, 具有更可靠的潜力。

DNA在600~1 700 cm^-1的波段范围内一共有几十条拉曼光谱信息线, 分别代表腺嘌呤(A)、 胸腺嘧啶(T)、 鸟嘌呤(G)、 胞嘧啶(C)。 通过对这些DNA拉曼光谱进行科学分析, 可以快速获取相关信息, 包括DNA和整个DNA骨架的振动和转动等。 金属结合离子与DNA相互作用的同时也会直接影响DNA的构象, 使DNA双螺旋发生变性。 利用这一特点, 从分子水平研究药物与DNA的相互作用, 对新药研发具有重要意义。 Ngo等用SERS技术研究了小檗碱与小牛胸腺DNA的相互作用, 以Ag胶作为表面增强基质, 记录了小檗碱键合到DNA后的SERS光谱, 并对谱峰变化进行了分析与归类, 进一步探索了生物碱与DNA分子相互作用的模式和机理^[6]。 由于拉曼谱线对热处理比较敏感, 也可以通过分析这些谱线, 判断DNA的哪些基团哪些部位受到了损伤, 受到了多大程度的损伤。

(1) 对于低含量的DNA检测, 往往不足以获得可检测的拉曼信号。 为了克服这个缺点, 可以采用放大研究方法, 包括样品扩展法和信号放大法。 样品扩展主要基于聚合酶链反应(PCR), SERS与PCR相结合可以将目标基因扩增到可检测的水平, 此时检测拥有较高的灵敏度及良好的光谱选择性。 Isola等^[7]利用SERS活性标记作为引物, 通过PCR扩增HIV相关基因, SERS检测到拉曼标记以确定目标DNA序列的存在, 并将其应用于临床研究。

(2) 常规用于点突变检测的标准方法是PCR(聚合酶链反应, 及其修饰)和NGS(下一代测序), 检测相对费时费力, 而SERS技术可以准确地确定基因突变的位点, 它甚至可以分辨出肿瘤中低至1%的甲基化水平。 基于链置换扩增(SDA)的SERS可以检测每个基因的点突变, 这种检测方法精度很高, 当基因片段发生点突变时, 识别探针和基因发夹部分探针相互作用而形成SDA基因模板, 基因发夹部分还作为引物对基因进行扩增, 得到大量扩增片段, 产生强烈的SERS信号^[8]。 血液中循环核酸(circulating nucleic acid, cfDNA)是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。 由于SERS技术仅限于短DNA序列, 不适用于血液中无细胞DNA序列的检测。 Graham等利用PCR-SERS方法为简化、 同步和灵敏的检测血浆中的基因突变提供了希望。 这种结合标记引物多重PCR和SERS的方法, 避免了以往常规方法PCR、 高效液相色谱(HPLC)和测序等的分离过程, 可以利用SERS的窄谱带进行多重基因分型, 达到检测的目的^[9]。

(3) 金纳米纤维粉(GNF)作为SERS的激发源, 能产生了许多电磁热点, 具有足够的灵敏度和均匀性。 利用GNF-SERS信号的差异可以鉴定肿瘤组织的边界, 也可以得到异种器官或组织移植中代谢物的分子振动指纹, 对是否存在排斥反应进行分析。 研究发现肿瘤干细胞标记物CD44基因敲除降低了谷胱甘肽(HT)含量, 但肿瘤中的HT含量没有降低。 依据GNF-SERS检测结果, 鉴定敲除基因CD44对于肿瘤的致病机制, 分析CD44敲除条件下肿瘤维持HT含量的机制^[10]。

(4) Ashworth等于1869年提出循环肿瘤细胞的概念, 把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC), 在癌症诊断和监测中具有重要的临床意义。 SERS技术用于肿瘤生物学信息研究, 无需隔离单个CTC, 在治疗过程中, 可以实时监测癌细胞的表型演变, 并提供重要的信息^[11]。

(5) 传统的检测基因组DNA分子变化的方法包括但不限于焦磷酸测序和质谱分析。 这些方法经常导致原有DNA的化学修饰改变, 甚至改变天然DNA的结构, 从而使基因组DNA分子检测结果不可靠。 带有DNA的SERS探针提供必要的超灵敏、 多重检测属性, 可以全面了解基因组DNA表观遗传图, 涉及分子(甲基化)和结构(碱基组成)的分析, 具有实时性的优势。 利用有机半导体表面增强拉曼散射(SERS)探针可以研究肿瘤干细胞(CSC)的表观遗传特性, 该探针用于无标签基因组DNA检测非常精确, 是单分子DNA检测技术的进步, 可用作痕量检测, 拓宽了SERS的实际应用范围^[12]。

(6) DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列, A、 T、 C与G排列方式。 快速的DNA测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。 近年来使用SERS技术依据核酸释放核苷酸顺序的鉴定来表征核酸, 进行核酸的测序。 利用外切核酸酶处理DNA序列, 导致核苷酸的释放, 从反应室通过微流体通道直接进入纳米通道或微通道, 这个过程包含拉曼检测作用的重要热点, 核苷酸序列就得以检测出来。

基因的突变或甲基化可能导致疾病。 在疾病相关DNA靶点检测中, SERS检测技术对疾病诊断和基因治疗具有重要意义。 将DNA、 RNA等核酸生物标志物的SERS用于早期预警各种癌症和慢性疾病的可行性被不断验证, 正在发挥其特有的优势和作用。 SERS纳米传感器可以对正常、 病变组织的基因组DNA、 RNA和表达异常的拉曼光谱进行判别、 分析, 并观察其动态变化, 便于建立诊断识别模型^{[16, 17, 18]}。

(1) 无标记和无修饰的纳米SERS技术被用于DNA检测, 已成为早期癌症诊断的有力工具, 如循环肿瘤DNA(ct DNA)、 甲基化DNA等 。 Chen等^[19]将银纳米颗粒SERS技术应用于肝脏癌症组织切片, 改善组织切片的光谱信号, 获取了组织中生物成分变化的信息, 对癌组织和正常肝组织进行了检测区分。 Sim等^[20]构建了一种免标记、 超灵敏的SERS纳米等离子体生物传感器, 用于乳腺癌标志物micro RNAs的检测, 提高了SERS基底的重现性。 通过SERS基因探针与目标生物物种杂交检测HIV基因等疾病也已经取得成功。 使用磷酸盐主链的SERS信号作为内标, 即使在单个碱基水平上, 也可以实现对核碱基的定量检测, 可将鼻咽癌鉴别出来, 包括检测浓度改变、 特异性突变和甲基化修饰。

(2) DNA甲基化疾病检测的常规方法是甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)、 测序等方法, SERS光谱是DNA甲基化疾病检测的革命性技术。 通过对血液、 体液或细胞内基因的检测, 可以找到许多治疗和预防疾病的相关基因位点, 如癌症、 糖尿病和心脏病等。 有机半导体表面增强拉曼散射(SERS)探针用于无标签基因组DNA检测, 除了指出癌细胞和非癌细胞的基因组DNA的差异, 还能够追踪标记癌症干细胞(CSC)的基因表达, 对DNA表观遗传变化的分析有助于确定治疗癌症新药物的靶点。 检测循环系统的可能性肿瘤DNA(ctDNA)异常甲基化, 可以用于疾病的监测和复发的预测。 Li等通过SERS光谱法确定A549肺细胞中低剂量碳基纳米颗粒CNPs的诱导作用与基因组甲基化的增加有关, 提供了CNPs诱导细胞改变的生化信息, 光谱显示了脂质、 蛋白质甚至基因组区域的改变。 通过分析确定了CNPs可降低DNA甲基转移酶DNMT的表达, 导致全基因组的甲基化, 首次证明CNP诱导的基因表观效应^[21]。

(3) 基因突变的鉴定是癌症个体化治疗的关键, 癌症中的表观遗传改变, 如DNA导致基因沉默的突变。 直接使用测序作为检测突变的标准, 其灵敏度有限, 成本高, 培养时间长。 SERS技术仅限于短DNA序列, 不适用于血液中无细胞DNA(cfDNA)序列的检测。 结合PCR扩增的优势和SERS的高灵敏度, 可以利用SERS的窄谱带进行多重基因分型。 SERS结合等位基因特异性多重PCR(MAS-PCR)是检测和监测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中表皮生长因子受体(EGFR)突变的一种有效、 无创且经济的方法^[22]。

(4) SERS实现简单的超分辨率成像, 当一定频率的激光照射到样品表面时, 物质中的分子吸收了部分能量, 发生不同方式和程度的振动(例如: 原子的摆动和扭动, 化学键的摆动和振动), 然后散射出较低频率的光。 频率的变化决定于散射物质的特性, 不同原子团振动的方式是惟一的, 因此可以产生特定频率的散射光, 其光谱就称为“ 指纹光谱” , 可以照此原理鉴别出组成物质的分子的种类。 SERS光谱显示了多分子复杂生物事件的监测, 高质量光谱使人们能够识别与鉴定早期细胞凋亡条件相关的生物学效应, 这是细胞与纳米探针相互作用的结果。 SERS监测细胞凋亡, 与拉曼指纹关联起来, 分析线粒体膜电位的变化与线粒体的表达促凋亡标志物Caspase-3基因, 用来探测细胞在发生病理变化时其重要化学成分的变化, 揭示了细胞凋亡的原因。

病原感染的早期诊断和疾病控制一直很关键。 目前, 最常见的生物检测的常用方法主要是比色法, 细胞培养, 流式细胞术, 聚合酶链式反应(PCR)和酶联反应免疫吸附试验(ELISA), 这些方法虽然可靠、 具有高度特异性和选择性, 但费时费力, 以核酸为基础的分子诊断因其独特的功能而在医学诊断中占有重要地位, 但大部分需要2~3 d或更长时间用于病原体检测和鉴定, 难以应付突发事件, 公共健康和安全事件。 SERS技术对于病原体的检测和鉴定具有快速、 廉价。 原位、 高灵敏度和特异性, 准确性高的优势, 它的快速数据采集和光谱指纹技术引起了人们的极大关注^[23]。 基于SERS技术的DNA阵列/传感器的基因芯片的开发, 可用于目标DNA的多重传感。 此外, 金纳米线和金纳米粒子SERS被用来检测病原体或生物标志物快速敏感的疾病诊断, 受到了极大的关注, SERS与基因芯片结合可以实现多重检测和分析, 解决了病原检测的难题。

(1) 在病原检测过程中, 低浓度的靶序列十分具有挑战性。 Ngo等^[24]使用SERS纳米设备, 直接检测了未经核酸提取或靶扩增的裂解物中的病原体RNA等遗传标志物, 彻底改变以核酸为基础的诊断方法, 如直接在感染的红细胞裂解液中检测恶性疟原虫RNA。 与传统的基于PCR的靶点分析相比, 信号扩增分析具有特殊的操作优势, 迅速地检测和描述出由病毒传播引起的拉曼光谱信息。 SERS可以分别识别生物系统中的病毒、 疾患链及已经被切断或者删除的部分基因所形成的病毒。 Rana等^[25]利用碳纳米管阵列修饰SERS检测芯片进行病毒检测, 该芯片可富集人呼吸道样品或血液样品中的病毒颗粒。 同时纳米管阵列修饰有金纳米粒子构成SERS热点, 当激光打到病毒富集区时, 进入热点的病毒将发出明显的拉曼散射光, 不同的病毒有不同的拉曼散射光谱, 利用这一特性可以快速筛查待测样品中的病毒。 SERS纳米颗粒标记的核酸探针, 用DNA杂交技术同时检测了西尼罗河病毒、 呼吸道合胞病毒、 B型肝炎、 A型肝炎、 艾滋病毒、 天花病毒、 登革热、 HIV-1等多种致病病毒。 单分子SERS(SM-SERS)可以应用于多种甲型流感病毒亚型, 如H1N1、 人畜共患性呼吸道病毒(RVsZO)和新型冠状病毒SARS-CoV, 将病毒捕获在细胞间隙内等离体纳米颗粒上, 记录来自基因片段的SERS信号。

(2) SERS技术作为一个简单和低成本的平台被用来检测敏感细菌的DNA。 研究发现通过镀金的SERS基底增强了拉曼信号, 病理适应性lasR基因的突变可以改变绿脓杆菌生物标志物氰化氢(HCN)的表达, 进一步验证了铜绿假单胞菌是囊性纤维化患者慢性气道感染的主要原因。 由沙门氏菌引起的肠炎是一种常见的食源性疾病, 现在金纳米探针SERS技术已经建立了沙门氏菌DNA检测的综合分析方法。 研究者利用双链DNA的核酸外切酶切及SERS检测三种脑膜炎病原体的新方法。 两个互补DNA探针同时与靶序列杂交, 获得双链DNA用lambda核酸外切酶酶切后, 采用SERS技术成功检测到脑膜炎病原体。 Monaghan等^[26]利用SERS高特异性和敏感性以及它们对基因型靶点的识别能力的优点, 将SERS技术与微流控技术结合对衣原体沙眼的致病基因进行检测。 SERS检测平台已经证明是一种可靠的技术, 能够有效检测出葡萄球菌、 金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌和沙门氏菌、 鼠伤寒等病原菌。

合理有效的检测方法在药物研究中对人类健康和安全具有重要意义, 表面增强拉曼光谱作为一种新的检测手段, 对于药物的检测、 痕量分析有着重要的指导意义, 从分子层次上比较深入研究各种药物的组成构型变化和相互作用, 通过拉曼光谱法可以迅速地识别出中草药的真假, 已经成功地应用于药物检测领域^[27]。 此外, 药物分子与DNA的相互作用, 药物引起的分子结构、 基因的调控和代谢功能的改变, 解释了药物在生物体环境中的作用机制, 对于制备以DNA为主要作用靶标的更有效的新药来说很有意义。 Kogler等^[28]利用时间门控SERS(tG-SERS)对大肠杆菌生产的重组蛋白进行了分析, 使用批处理技术评估了hcntf、 hHspA1和hHsp27在复杂培养基中的表达发酵模式。

拉曼光谱已经成功应用于转基因品种的表达检测研究^{[29, 30]}, 利用组织化学染色、 激光共聚焦显微技术和共聚焦显微拉曼光谱技术观察了转基因杨木和其他对照组木质素和多糖物质在组织细胞壁层的微区分布及沉积规律, 并针对以上研究结果的变化规律进行总结分析。 以我国转基因作物水稻“ 华恢1号” 及其亲本为主要检测对象, 利用SERS技术、 紫外、 可见、 近红外光谱等技术对转基因水稻与其亲本进行对比的动态鉴别和检测分析, 设计了基于转基因水稻的动态检测分析平台。 在信号放大检测方法中, 转基因片段(tDNA)被用来触发模板长链特定结构之间的杂交, 固定在底物上, 并进行拉曼标记固定在纳米颗粒上的引物, 得到了含有大量拉曼标记引物的长链。 通过这种方法, 转苏云芽孢杆菌Bt基因片段(tDNA-Bt)可以与互补基因杂交, 利用SERS生物传感平台能检测到苏云金芽孢杆菌(Bt)转基因序列。 由于35S启动子基因是转基因生物的标记, 可用于滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)反应的RCA-SERS方法进行检测, 用以增强目标分子拉曼光谱。