引用本文
徐荣, 敖冬梅, 徐鑫, 王占林, 胡颖, 刘赛, 乔海莉, 徐常青. 基于红外光谱与聚类分析法的宁夏产地枸杞子品种鉴别研究[J]. 光谱学与光谱分析, 2024,44(5): 1386-1391.
XU Rong, AO Dong-mei, XU Xin, WANG Zhan-lin, HU Ying, LIU Sai, QIAO Hai-li, XU Chang-qing. Study on the Identification Method of Lycium Barbarum Cultivars in Ningxia Based on Infrared Spectrum and Cluster Analysis [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2024,44(5): 1386-1391.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2024)05-1386-06  
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基于红外光谱与聚类分析法的宁夏产地枸杞子品种鉴别研究
徐荣1, 敖冬梅2,*, 徐鑫1,2, 王占林1,2, 胡颖2, 刘赛1, 乔海莉1, 徐常青1,*
1.中国医学科学院药用植物研究所, 北京 100193
2.北京城市学院生物医药学部, 北京 100094
*通讯作者 e-mail: admei302@163.com; cqxu@implad.ac.cn

作者简介: 徐 荣, 女, 1981年生, 中国医学科学院药用植物研究所研究员 e-mail: rxu@implad.ac.cn

收稿日期: 2022-09-08 修订日期: 2023-09-22
基金: 国家“十四五”重点研发计划项目(2022YFC3501502), 中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(CIFMS 2021-I2M-1-031), 宁夏回族自治区重点研发计划重大(重点)项目(2019BBF02030)资助
摘要

宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)为宁夏传统道地中药材, 因其良好的药食两用价值, 已引种至甘肃、 新疆、 青海等省区。 因长期引种和改良, 宁夏枸杞品种繁多, 是影响其质量的重要因素之一。 本研究采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)对宁夏中宁产地的宁杞1号、 4号、 5号、 7号、 0909号、 10号共6个品种的枸杞子进行测定, 一维红外光谱及二阶导数光谱范围均为4 000~650 cm-1, 得到图谱后进行图谱解析; 采用谱带较密集的指纹区(1 800~650 cm-1)计算红外光谱图的相似系数; 然后结合SMICA聚类分析法对不同品种枸杞子的红外指纹图谱进行聚类比较。 结果表明, 不同品种枸杞子样品的一维红外光谱图较为相似, 峰的位置、 峰高和峰形都较为接近, 其共同吸收峰较多, 仅在3 282~3 288、 1 239~1 242和1 143~1 147 cm-1附近的吸收峰强度、 峰位置、 峰形状有所不同, 说明不同品种枸杞子中多糖类、 苷类、 蛋白质类、 脂类和黄酮类等成分的种类和含量有所差异。 二阶导数光谱中, 宁杞1号、 4号、 7号在2 880 cm-1处吸收峰不明显, 0909号在969 cm-1处吸收峰不明显。 不同品种枸杞子的相似度范围在0.948 9~0.992 8之间, 说明不同品种枸杞子存在一定差异, 其中, 宁杞7号与其他品种的平均相似度系数最小, 为0.964 0, 说明其成分特异性最高。 0909号与宁杞10号相似系数为0.992 8, 相似度最高。 采用Assure ID软件以各药材吸收波数为变量进行聚类分析, 宁杞1号与其他品种的差异均较小, 类间距在2.17~2.97范围内; 0909号与其他品种间的差异最大, 类间距在2.97~8.06范围内。 聚类模型中, 不同品种枸杞子的识别率均为100%, 仅宁杞1号的拒绝率较低, 为66%, 易与其他品种枸杞子混淆, 0909号的拒绝率和识别率均为100%, 最易区分。 类模型图中, 0909号与宁杞5号、 0909号与宁杞7号两两分开, 可以明显鉴别出不同品种的样品。 采用已知品种的枸杞子对聚类分析模型进行验证, 其识别率和拒绝率与聚类分析模型相同。 不同品种枸杞子类模型图与一维红外光谱、 二阶导数图谱、 相似度、 类间距、 识别率和拒绝率结果相互印证, 佐证了宁杞1号为大多数宁杞系列品种的来源品种, 而09系列品种0909号与其他品种有较大差异。 因此, 红外光谱与聚类分析法相结合可以快速、 无损地鉴别不同品种枸杞子, 对枸杞子药材生产和新品种选育具有一定的指导作用。

关键词: 红外光谱法; 聚类分析法; 枸杞子; 不同品种; 鉴别
中图分类号:R282 文献标志码:A
Study on the Identification Method of Lycium Barbarum Cultivars in Ningxia Based on Infrared Spectrum and Cluster Analysis
XU Rong1, AO Dong-mei2,*, XU Xin1,2, WANG Zhan-lin1,2, HU Ying2, LIU Sai1, QIAO Hai-li1, XU Chang-qing1,*
1. The Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
2. Biochemical School, Beijing City University, Beijing 100094, China
*Corresponding authors
Abstract

Lycium barbarum(Lycii Fructus, wolfberry) is a valuable traditional Chinese medicinal material for medicine and food. Ningxia Zhongning wolfberry cultivars have been introduced to Gansu, Xinjiang, Qinghai and other provinces. Due to long-term introduction and improvement, there are many varieties of Lycium barbarum, one of the important factors affecting the quality of Lycii Fructus. This study used Fourier transforms infrared spectroscopy (FTIR) to determine the collected Lycii Fructus of Ningqi No.1, No.4, No.5, No.7, No.0909 and No.10 from Zhongning, Ningxia. The range of the one-dimensional infrared spectrum and the second derivative spectrum was 4 000~650 cm-1. After obtaining the spectrum, the infrared spectrum's similarity coefficient was calculated using the fingerprint region (1 800~650 cm-1) with dense spectral bands. Then, the infrared fingerprints of different varieties of Lycii Fructus were classified and compared with SMICA cluster analysis. The results show that the one-dimensional infrared spectroscopy of different varieties of Lycium barbarum samples are relatively similar, with the location, peak height and peak shape of the peaks being relatively close. Their common absorption peaks are more numerous, and only the intensity, peak location and peak shape of the absorption peaks at around 3 282~3 288, 1 239~1 242 and 1 143~1 147 cm-1 are different, indicating that the polysaccharides, glycosides, proteins, lipids, and The types and contents of polysaccharides, glycosides, proteins, lipids, flavonoids and other components in different varieties of Lycium barbarum varied. In the second-order derivative spectra, the absorption peaks of NingQi 1, 4 and 7 were not apparentat 2 880 cm-1, and 0909 at 969 cm-1. The similarity of different varieties of Lycii Fructus ranges from 0.9489 to 0.9928, indicating certain differences among different varieties. Ningqi 7 has the lowest average similarity coefficient of 0.9640, indicating that its component specificity is the highest. The similarity coefficient of No.0909 and Ningqi 10 is 0.992 8, the two varieties with the highest similarity. The cluster analysis was carried out using the Assure ID software with the absorption wave number of each medicinal material as a variable. The class spacing between Ningqi No.1 and other varieties was small, ranging from 2.17 to 2.97. The class spacing between No.0909 and other varieties was the largest, ranging from 2.97 to 8.06. In the clustering model, the recognition rate of different varieties of Lycii Fructus is 100%, only the rejection rate of Ningqi No.1 is 66%, which can easy to be confused with other varieties of Lycii Fructus, and the rejection rate of No.0909 is 100%, which is the easiest to distinguish. In the class model diagram, No.0909 and Ningqi No.5, No.0909 and Ningqi No.7 are separated in pairs, which can identify the samples of different varieties. The cluster analysis model was verified using known varieties of Lycii Fructus, and its recognition and rejection rates were the same as those of the cluster analysis model. The results of the one-dimensional infrared spectrum, second derivative spectrum, similarity, class spacing, recognition rate and rejection rate of different varieties of Lycii Fructus showed that Ningqi No.1 was the original variety of other varieties of Lycii Fructus, and No.0909 was significantly different from other varieties. Therefore, the combination of infrared spectrum and cluster analysis can quickly and nondestructively identify different varieties of Lycii Fructus, which has a certain guiding role in the breeding and production of Lycii Fructus in Ningxia.

Keyword: Infrared spectroscopy; Cluster analysis; Lycium barbarum; Different varieties; Identification
引言

中药枸杞子(Lycii Fructus)为茄科多年生灌木宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)的干燥成熟果实, 《中国药典》记载其具有滋补肝肾、 益精明目的功效[1]。 《本草纲目》中记载枸杞子为平补之药, “ 除邪热, 明目轻身, 可用于虚劳亏损、 眩晕耳鸣、 内热消渴、 目眩不明等病症” 。 现代研究表明, 枸杞子中化学成分较为丰富, 主要包括枸杞多糖、 生物碱类、 黄酮类、 有机酸类等成分[2], 枸杞子能够作为治疗阿尔兹海默病、 糖尿病、 骨质疏松症及缓解视疲劳、 预防视网膜损伤、 延缓衰老等药物的重要来源[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]。 宁夏枸杞原产于宁夏、 青海、 新疆、 甘肃、 陕西等省区, 目前以栽培为主, 除上述地区外, 我国中部、 南部及东北不少省区也已引种栽培[2]。 由于长期的引种和改良, 枸杞子品种繁多, 成为影响枸杞子品质的主要因素之一。 目前, 关于枸杞子中主要质量指标成分含量的检测方法、 枸杞子的品种质量差异及其质量影响因素的研究逐渐增多。 孙红亮[10, 11]采用紫外分光光度法分别测定山西产地的11个宁夏枸杞品种枸杞子中甜菜碱和总黄酮含量, 同时采用ICP-MS法和原子荧光光度法测定了锌等6种金属元素含量和总硒含量, 得出不同品种枸杞子中甜菜碱、 总黄酮、 6种金属元素含量差异极显著, 硒含量差异不显著, 为筛选适宜山西省栽培的优质枸杞子品种提供了理论依据。 刘玲玲等[12]基于高光谱技术研究了宁夏、 甘肃、 青海、 新疆、 内蒙古产枸杞子中枸杞多糖、 总黄酮、 甜菜碱和维生素C等4种质量指标成分含量的快速无损检测模型, 实现了枸杞子中4种成分含量的快速有效检测, 为中药枸杞子的快速无损检测提供了一种新途径。

我国枸杞栽培历史悠久, 可达一千余年, 唐《千金翼方》中就记载了关于枸杞栽培较为成熟的技术方法[2]。 宁夏作为栽培枸杞的发源地, 品种日益繁多。 宁杞系列品种是从当地传统农家种麻叶系列或天然杂交宁夏枸杞中研究培育而成的优良品种, 经过多年人工栽培育种, 已经形成了遗传性状较为稳定的“ 宁杞1号” 等系列品种, 其中“ 宁杞1号” 、 “ 宁杞4号” 、 “ 宁杞5号” 、 “ 宁杞7号” 、 “ 宁杞10号” 和“ 0909号” 等在宁夏枸杞产区种植面积较大, 已成为宁夏地区主要的栽培品种。 全国栽培的宁夏枸杞大多数引自宁杞系列品种, 不同品种枸杞子之间的质量差异程度目前鲜有报道。 单凭《中国药典》项下性状鉴别、 薄层色谱, 含量测定等方面的检查已经不能很好地满足市场对其质量评价的要求, 现有研究难以全面反映宁杞系列枸杞子品质差异性和质量影响因素。 同时, 传统分析方法前处理繁杂、 耗时长、 存在一定的不足。 因此, 无论是种植生产还是销售使用, 都亟待建立一种宁杞系列枸杞子品种特异性鉴别方法, 从而选择更优质的品种来满足市场需求。

傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)因具操作简便、 制样简单、 用样量小、 分析速度快、 重现性好、 既有专属性指纹又具宏观性和整体性等优势, 已在中药材的鉴别、 质量评价等定性和定量分析方面得到广泛应用。 随着化学计量学的迅速发展, 各种功能强大的光谱处理软件可快速分析具有红外吸收光谱基团的特性, 开展定性、 聚类和定量分析, 使这一强大的分析手段实现了在食品、 药品、 农作物等多个领域的广泛应用[13]。

本工作采用红外光谱结合SMICA(soft independent modding of class analogy)聚类分析法研究了来自宁夏地区6个不同品种枸杞子的鉴别特征及模型, 选定的样品包括宁杞1号、 宁杞4号、 宁杞5号、 宁杞7号、 0909号、 宁杞10号, 6个品种均应用5点取样法采自同一地块的不同植株, 种植方式一致, 包含不同的采样时间和加工方式, 样品具有一定的代表性和系统性, 为枸杞子新品种选育提供了科学依据, 并可指导生产实践活动, 以保证药材市场需求和人们安全、 高质量用药。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Spectrum GX型傅里叶变换红外光谱仪(Perkin-Elmer公司)及ATR附件; Assure ID软件(PerkinElmer公司); AB265-S(1/10万)电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); 玛瑙研钵; WS70-1红外快速干燥箱(杭州齐威仪器有限公司)。

1.2 样品处理

枸杞子样品来源于宁夏中宁县杞鑫枸杞种植公司, 宁杞1号、 4号、 5号、 7号、 10号、 0909号各20余份, 分别进行现场晾干和烘干处理, 经中国医学科学院药用植物研究所徐常青研究员鉴定为茄科宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将样品于50 ℃烘箱中烘制24 h, 打成粗粉, 再将粗粉于45 ℃烘箱中烘制24 h, 打成细粉, 过150目筛, 保存在干燥器中备用。

1.3.2 光谱测定

室内温度保持在20 ℃, 相对湿度保持在20%, 光谱范围4 000~650 cm-1, 分辨率为4 cm-1, 累计扫描16次, 扫描时实时扣除H2O和CO2的干扰, 以空气为背景, 每个样品重复3组。

1.3.3 数据处理

每个样品获得的3张红外光谱图, 进行加和运算取其平均图谱作为该样品的红外光谱图。 得到图谱后采用Spectrum V10.5.6软件进行基线自动校正, 13点平滑、 吸光度归一化为1.3。 二阶导数谱范围为4 000~650 cm-1, 用Spectrum V10.3.6软件中的compare软件, 以S1为设置参比, 计算红外光谱图谱带较密集的指纹区(1 800~650 cm-1)的相似系数并选取13点平滑计算二阶导数谱。 选取1 800~650 cm-1范围内谱峰信息丰富的区域波段, 采用AssureID软件进行SIMCA聚类分析, 建立聚类模型, 带入其他已知品种枸杞子样品对模型进行验证。

2 结果与讨论
2.1 不同品种枸杞子的红外光谱

从图1可以看出, 不同品种枸杞子样品的一维光谱较为相似, 峰的位置、 峰高和峰形都较为接近。 不同品种枸杞子的共同吸收峰有3 282~3 288、 3 009~3 010、 2 923~2 924、 2 854、 1 744、 1 622~1 623、 1 399~1 400、 1 239~1 242、 1 143~1 147、 1 029~1 030、 817、 876和776~777 cm-1。 不同之处在于宁杞4号、 宁杞7号、 宁杞10号在867 cm-1处吸收峰明显较高, 而宁杞1号、 宁杞5号和0909号在867 cm-1处吸收峰不明显。

图1 不同品种枸杞子一维红外光谱图比较Fig.1 Comparison of one-dimensional infrared spectra of different varieties of Lycii Fructus

由表1中3 280 cm-1附近为O—H羟基伸缩振动或N—H键伸缩振动吸收峰, 主要由枸杞多糖、 氨基酸和苷类等物质中相关官能团吸收产生。 3 010 cm-1处为=CH伸缩振动峰, 推测主要为脂肪酸类成分的特征吸收。 2 924和2 854 cm-1处的吸收峰为亚甲基饱和C—H键的伸缩振动吸收峰, 推测可能来源于脂肪类化合物、 枸杞糖蛋白等成分。 1 740 cm-1处为脂羰基C=O伸缩振动吸收峰, 主要由酯类中脂肪类化合物或挥发油类成分产生。 1 620 cm-1附近的吸收峰为酰胺Ⅱ 带中肽键的C=O伸缩振动, 判断可能源于枸杞子中的蛋白类或黄酮类成分。 1 400 cm-1处包含蛋白质分子中—CONH—中C—N键的伸缩振动吸收峰。 1 030 cm-1处为枸杞中纤维素、 糖蛋白和低聚糖等C—O键伸缩振动引起的吸收峰。 817、 867、 777 cm-1附近的吸收峰多为多糖或者可溶性糖、 苷类等碳水化合物成分的C—OH弯曲振动引起。

表1 不同品种枸杞子主要红外吸收峰及其指认 Table 1 Main infrared absorption peaks and their identification of different varieties of Lycii Fructus

图1中3 282~3 288 cm-1处附近、 1 239~1 242 cm-1处附近、 1 143~1 147 cm-1处附近的吸收峰相对峰强度、 峰位置、 峰形状有所不同, 说明不同品种枸杞子在多糖类、 苷类、 蛋白质类、 脂类、 黄酮类等成分的种类和含量有所差异。 宁杞4号、 宁杞7号和宁杞10号在867 cm-1处吸收峰强度不同, 说明不同品种在长链亚甲基、 糖环、 烷烃类成分的含量有所不同。

根据上述宁夏产区不同品种枸杞子样品的中红外光谱特征, 枸杞子中的主要成分多糖、 蛋白质、 氨基酸、 黄酮类、 脂肪类化合物等成分均在红外光谱中显现, 不同品种枸杞子样品在具体成分的种类和含量上有明显差异, 故可以根据枸杞子的红外光谱指纹特征差异来进行不同品种的鉴别和区分。

2.2 不同品种枸杞子的二阶导数图谱分析

图2为不同品种枸杞子样品的红外二阶导数图谱, 与一维图谱的吸收峰相比, 在二阶导数图上的吸收峰明显被均匀铺开, 使在不同范围的红外特征吸收峰差异更加显而易见。 通过图谱可以看到, 不同品种枸杞子在4 000~650 cm-1范围内的吸收峰较为相似, 均在2 971~2 972、 2 944、 2 864~2 865、 2 839~2 841、 1 760~1 761、 1 730、 1 475~1 476、 1 041~1 091、 969~997和790~791 cm-1处有共同吸收峰。 差异在于宁杞1号、 宁杞4号、 宁杞7号在2 880 cm-1处吸收峰不明显, 而其他品种吸收峰明显; 0909号与其他五个品种相比, 在969 cm-1处无吸收峰。 由此可见, 在二阶导数红外图谱上, 因其有更高的分辨率, 可以更直观、 清楚地看到不同品种枸杞子样品之间的相似和差异。

图2 不同品种枸杞子的二阶导数谱Fig.2 Second derivative spectra of different varieties of Lycii Fructus

由表2可见, 不同品种枸杞子二阶导数图谱的相似度范围在0.948 9~0.992 8之间, 说明不同品种枸杞子药材存在一定的差异。 其中, 宁杞7号与其他品种的平均相似度系数最小, 为0.964 0, 说明其成分特异性最高。 品种之间两两相比结果显示, 宁杞1号与宁杞4号最相似, 相似系数为0.974 5; 宁杞4号与宁杞5号最相似, 相似系数为0.976 3; 宁杞5号与宁杞10号最相似, 相似系数为0.990 8; 宁杞7号与宁杞4号最相似, 相似系数为0.967 3; 0909号与宁杞10号最相似, 相似系数为0.992 8, 是相似度最高的两个品种。

表2 不同品种枸杞子红外光谱二阶导数谱的相似度比较 Table 2 Comparison of similarity of second derivative infrared spectra of Lycii Fructus from different varieties
2.3 不同品种枸杞子的聚类分析

2.3.1 聚类模型诊断

2.3.1.1 聚类模型类间距分析

类间距是指不同类别聚类中心之间的距离, 间距数值越大, 类与类之间的差异越明显。 因此, 类间距能够反映不同类别之间的相似度或差异度, 能够判别聚类效果。 表3为不同品种枸杞子样品的类间距, 宁杞1号与其他品种的类间距均较小, 最相似的为宁杞7号, 类间距为2.17; 与0909号差异最大, 类间距为2.97。 宁杞4号与其他品种的类间距均较大, 其中与宁杞5号最相似, 类间距为5.84; 与0909号差异最大, 类间距为8.06, 也是所测品种中差异最大两个品种。 类间距最低的两个品种为宁杞5号与和宁杞10号, 为2.47。 宁杞7号与宁杞5号最相似, 类间距为2.92; 与宁杞4号差异最大, 类间距为6.46。 0909号与宁杞1号仍为最相似, 其与相似度比较结果有一定的相似性, 但数值差异更加明显。

表3 不同品种枸杞子样品的类间距 Table 3 Inter material distances of Lycii Fructus samples from different varieties

2.3.1.2 聚类模型识别率和拒绝率分析

识别率即接受程度, 就是样品处于该模型区域内的概率, 而拒绝率就是建立的模型对于其他不属于可识别样品的拒绝程度。 当识别率与拒绝率均为100%时, 样品的聚类效果较好。 由表4可见, 不同品种枸杞子的识别率均为100%, 但宁杞1号的拒绝率较低, 为66%, 结合品种分析原因为宁杞1号为原始品种, 其余品种多数从宁杞1号选育而来, 与其相似程度高, 故宁杞1号拒绝率较低, 样品间存在一定的重合。 不同品种中0909号的拒绝率最高, 为100%, 因此该品种最易与其他品种区分。

表4 不同品种枸杞子样品的识别率和拒绝率 Table 4 Recognition rate and rejection rate of Lycii Fructus samples of different varieties

2.3.1.3 类模型图分析

图3、 图4分别为0909号与宁杞5号、 0909号与宁杞7号的类模型, 同一品种的样品很好地聚集在每个方形区内, 两个不同集合之间并无重叠, 可以明显鉴别出不同品种的样品。 其他品种枸杞的聚类模型都有不同程度的重叠, 因此不再附图。 不同品种枸杞子类模型图与二阶导数图谱、 相似度、 类间距、 识别率和拒绝率结果相互印证, 表明了宁杞1号为其他枸杞子品种的原始品种, 0909号拒绝率最高, 与其他品种有较大差异。

图3 0909号与宁杞5号枸杞子的聚类模型图Fig.3 Clustering graph of No.0909 and Ningqi No.5 Lycii Fructus

图4 0909号与宁杞7号的聚类模型图Fig.4 Clustering graph of No.0909 and Ningqi No.7 Lycii Fructus

2.3.2 聚类模型校验

以识别率和拒绝率为验证标准, 采用宁杞1号、 4号、 5号、 7号、 10号、 0909号对聚类模型的可行性进行了检验, 结果识别率与拒绝率同上。

3 结论

采用傅里叶红外光谱结合SIMCA聚类分析法, 建立了一种快速、 无损地对不同品种宁夏枸杞子进行鉴别的聚类分析模型。

红外光谱与SIMCA聚类分析法结合研究表明, 不同品种枸杞子一维红外图谱及二阶导数图谱在峰位置、 峰强度、 峰形状方面均显示出了差异。 使用二阶导数图谱结合相似度对不同品种的枸杞子进行分析, 结果表明0909号与宁杞10号相似系数最高, 为0.992 8, 是相似度最高的两个品种。 使用Assure ID软件的SIMCA聚类分析法对不同品种枸杞子进行鉴别, 根据类间距的差异, 验证了相似度评价的结果, 同时根据聚类模型的识别率和拒绝率实现了不同品种枸杞子的快速鉴别, 其中宁杞1号与其他品种拒绝率最低, 可能因为宁杞1号为其他品种原始品种; 0909号拒绝率最高, 证明其与其他品种有较大差异。 研究表明中红外光谱结合聚类分析法建立的模型可以快速鉴别出宁夏地区枸杞子的品种差异。

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