试验蘑菇渣堆肥(MRC)和水稻秸秆堆肥(RSC)均采集自安徽科技学院农场。 堆肥原始物料分别按干基比蘑菇渣∶ 牛粪(1∶ 2)和秸秆∶ 牛粪(1∶ 1)进行好氧堆肥。 初始C/N比约为26, 含水率为65%, 每吨物料添加2 kg发酵菌剂(安徽莱姆佳生物科技股份有限公司, cfu≥ 10⁸个· g^-1, 纤维素酶≥ 30 μ g· g^-1, 淀粉酶≥ 10 μ g· g^-1)。 堆肥过程中每7天翻堆1次, 确保良好的通风。 堆肥35天后, 堆体温度趋于稳定, 发芽指数均高于88%, 继续翻堆进行二次发酵。 于堆肥50 d, 从堆体顶部、 中间和底部收集3份样品, 均匀混合后得到约2 kg成熟堆肥样品, 在实验室内进行冷冻干燥, 充分研磨后通过100目筛。

将研磨筛分后的样品与超纯水按固液比(w/v)1∶ 10进行堆肥DOM的提取, 在25 ℃以150 r· min^-1往复振荡24 h后, 室温条件下以8 000 r· min^-1离心20 min。 取上清夜通过0.22 μ m水系滤膜(Φ 90 mm, 津腾), 滤液即为原始DOM。

采用超滤法对DOM中不同分子量(MW)组分进行分析^[12]。 依次采用装载有10和5 kDa超滤膜(Φ 44.5, Millipore, 美国)的Amicon 8050型搅拌式超滤杯(Millipore, 美国)将堆肥DOM分级为高分子量(HMW, > 10 kDa)、 中等分子量(MMW, 5~10 kDa)和低分子量(LMW, < 5 kDa)3种组分。 采用N₂维持超滤过程的压力在0.1~0.2 MPa, 浓缩因子设定为8。 基于DOC定量, 采用的UF技术对两类堆肥DOM的分级回收率为97%~105%。

采用日本Shimadzu的TOC-VCPN分析仪测定溶解性有机碳(DOC)浓度。 采用岛津UV-2600分光光度计测定UV-Vis光谱, 扫描波长范围为200~700 nm, 扫描间隔为1 nm。 使用日立F4600分光光度计进行EEM光谱扫描, 激发波长(Ex)范围为200~400 nm, 发射波长(Em)范围为290~520 nm。 狭缝宽度为5 nm, 扫描速度为12 000 nm· min^-1, PMT电压为700 V。 所有光谱分析均以超纯水作为空白进行背景扣除。

剩余溶液进行冷冻干燥处理, 得到固体粉末DOM。 取1 mg粉末DOM与60 mg光谱纯KBr混合压片。 采用Nicolet iS50 FTIR光谱仪(Thermofish, 美国)进行红外光谱(FTIR)分析, 扫描范围为4 000~400 cm^-1, 分辨率为4 cm^-1, 扫描次数为64。

1.4.1 光谱参数

由UV-Vis光谱和EEM光谱中提取了多种光谱参数, 包括吸收系数a、 SUVA₂₅₄、 E₂/E₃、 S_R、 FI、 HIX和BIX, 用以表征DOM及其MW组分的来源、 结构和性质^{[4, 13]}。 各参数具体计算方法见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 光谱参数描述 Table 1 Descriptions of spectral parameters 光谱参数 计算方式 参数及描述 吸收系数α α λ =2.303Aλ /l Aλ 为波长λ 处的吸光度; l为光程路径(0.01 m) SUVA254 SUVA254=100A254/DOC A254为254 nm处吸收值, DOC为溶解性有机碳浓度(mg· L-1); SUVA254值与DOM的芳香度呈正相关 E2/E3 E2/E3=α 250/α 365 250与365 nm下吸光度的比值; E2/E3与DOM的芳香度和相对分子质量呈负相关 光谱斜率比值SR SR=S275~295/S350~400 α λ =α λ 0exp(Sλ 0-λ ) S275~295和S350~400分别为270~350和350~400 nm波长范围内的曲线斜率, λ 0是参照波长(nm) 荧光指数(FI) FI= IEm=470nmIEm=520nm, Ex=370 nm Ex=370 nm, Em为470和520 nm处的荧光发射强度比值; FI> 1.9表示DOM主要源于微生物活动, 以内源输入为主; FI< 1.4则以陆源输入为主(异生源特征明显) 腐殖化指数(HIX) HIX=∫Em=435~480nm∫Em=300~345nm,Ex=254 nm Ex=254 nm, Em在435~480与300~345 nm区域积分比值; 表征DOM腐殖化程度, HIX值越大表明DOM腐殖化程度较高, 结构越复杂 自生源指数(BIX) BIX= IEm=380nmIEm=430nm, Ex=310 nm EX=310 nm, Em为380与430 nm处荧光强度比值; BIX值越大, 自生源贡献越强, 生物可利用性越高

表1 光谱参数描述 Table 1 Descriptions of spectral parameters

1.4.2 EEM-PARAFAC分析

三维荧光光谱结合平行因子分析模型(EEM-PARAFAC)能够实现对堆肥DOM中不同类型荧光组分的识别和定量^{[4, 13]}。 本研究采用Matlab 2017b中的DOM Fluor工具包(www.models.life.ku.dk)对堆肥DOM及其不同MW组分(24个)的EEM进行平行因子(PARAFAC)分析, 具体方法参见文献[4]。 经过2~7个组分的模型拟合, 通过分半法、 残差分析法和核心一致性比较, 确定最优组分为4个, 并得到各组分的最大荧光强度(F_max)用以半定量分析。

图1为堆肥DOM及其MW组分的DOC含量。 MRC和RSC的DOC分别为4.68和5.38 g· kg^-1, 与已报道畜禽粪便、 市政污泥等堆肥中DOC的含量(3.6~10.8 g· kg^-1)处于同一数量级^{[3, 7, 13]}。 尽管不同堆肥DOM含量有一定的差异, 但是其分子量级组分的分布规律基本一致。 图1显示, HMW组分是MRC和RSC DOM的主要组成, DOC含量分别为3.52和3.62 g· kg^-1, 分别占总DOC的80%和71%。 相对而言, 堆肥DOM中MMW和LMW组分的含量(占比)较低, 分别为0.51~0.75 g· kg^-1(12%~15%)和0.38~0.75 g· kg^-1(9%~15%)。 结果说明堆肥DOM主要由HMW组分构成, 与前期报道的牛粪、 污泥、 蘑菇渣和厨余垃圾等堆肥DOM以高分子有机质组成为主的结论一致^{[1, 9]}。 有研究显示, 堆肥过程中小分子量DOM组分(如蛋白质类、 糖类等)更容易被微生物利用发生降解或聚合生成高分子有机物, 形成稳定的腐殖质, 进而使得大分子DOM的比例显著升高^{[4, 9]}。 本研究中, 两种堆肥DOM中> 5 kDa组分占比高达85%~91%, 高于Wei等^[9]报道的牛粪、 蘑菇渣堆肥中> 5 kDa的相对含量(43%~60%)。 导致这种差异的原因可能由于堆肥原料、 堆肥方法和DOM分级方法(切向和正向超滤方式)的不同。

图1

Fig.1

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	图1 堆肥DOM及其分子量级组分的DOC含量Fig.1 DOC content of compost DOM and its molecular weight components

堆肥DOM中不同MW组分的特征UV-Vis光谱(以DOC校正)如图2(a, b)所示。 MRC和RSC DOM中不同MW组分的UV-Vis光谱信号强度均呈现出HMW> MMW> LMW的趋势。 结果表明随着分子量的增加, DOM的芳香度、 不饱和度和腐殖化程度逐渐增强。 不同MW的DOM的UV-Vis光谱峰型也存在差异。 比如, HMW组分基本保留原DOM在270~280 nm处的吸收峰, 表明源自木质素及其衍生物中芳香族C=C结构主要富集在高分子量组分中^[13]; 而MMW和LMW组分在200~250 nm处存在较弱的吸收峰, 表明< 10 kDa组分含有较多的羧基、 酰胺基等非芳香族的官能团或硝酸盐类的物质^[14]。

图2

Fig.2

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	图2 (a)MRC和(b)RSC DOM及其MW组分的特征UV-Vis光谱Fig.2 The normalized UV-Vis spectra of DOM and its MW components in (a) MRC and (b) RSC compost

MRC和RSC DOM中不同分子量组分的SUVA₂₅₄、 E₂/E₃和S_R如表2所示。 SUVA₂₅₄是表征DOM芳香化程度的重要参数, 其值越大, DOM的芳香度越高^{[15, 16]}。 表2显示MRC和RSC DOM中分子量组分的SUVA₂₅₄值均呈现HMW> MMW> LMW, 说明两种堆肥DOM的分子量越大其芳香族结构越多。 值得注意的是, RSC DOM中HMW组分的SUVA₂₅₄值远高于MMW和LMW组分, 说明RSC DOM的芳香族化合物具有较大分子量, 主要富集在HMW中。 E₂/E₃值一般与DOM的腐殖化程度、 芳香性和相对分子质量呈负相关^[4]。 本研究中, MW DOM的E₂/E₃值基本呈现为HMW< MMW< LMW规律, 表明堆肥中DOM的分子量和腐殖化程度随分子量的减小而减小, 与SUVA₂₅₄值反映的结果一致。 结合MW组分的分布特征, 可以看出HMW组分是决定堆肥DOM的芳香族结构和不饱和共轭基团等分子组成的重要物质。 S_R值通常被用于表征堆肥DOM的芳构化程度和相对分子量, 且S_R值越小, 芳构化程度越强、 分子量越大^[15]。 但在表2中, 不同类型堆肥MW DOM的S_R值差异并不大, 说明S_R不适合用于评估不同MW的DOM的芳香度和分子量的大小。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 堆肥DOM及其MW组分的光谱特征参数 Table 2 Spectral parameters of DOM and their MW fractions derived from MRC and RSC SUVA254 E2/E3 SR FI HIX BIX MRC DOM 5.32± 0.10b 3.57± 0.01c 0.64± 0.01a 1.81± 0.02c 10.94± 0.38b 0.61± 0.01c HMW 6.11± 0.26a 3.44± 0.02c 0.63± 0.01a 1.71± 0.02d 11.85± 0.54a 0.54± 0.01d MMW 4.33± 0.45c 4.27± 0.11b 0.58± 0.03b 1.87± 0.02b 11.51± 0.38a 0.69± 0.02b LMW 3.85± 0.25d 4.56± 0.24a 0.58± 0.01b 2.06± 0.02a 8.49± 0.24c 0.80± 0.01a RSC DOM 9.97± 0.19b 3.11± 0.01c 0.54± 0.00b 1.77± 0.01c 11.76± 0.44b 0.56± 0.01c HMW 13.23± 0.37a 3.07± 0.02c 0.53± 0.01b 1.63± 0.01d 19.58± 0.76a 0.46± 0.01d MMW 3.92± 0.33c 3.86± 0.22b 0.59± 0.04a 1.96± 0.02b 6.17± 0.53c 0.70± 0.03b LMW 1.73± 0.20d 4.18± 0.46a 0.53± 0.02b 2.25± 0.06a 5.97± 0.35c 0.88± 0.05a

表2 堆肥DOM及其MW组分的光谱特征参数 Table 2 Spectral parameters of DOM and their MW fractions derived from MRC and RSC

基于EEM-PARAFAC共解析得到堆肥DOM及其MW组分中的4类荧光物质, 包括3种类腐殖质(C1—C3)和1种类蛋白质(C4), 不同荧光组分的EEM如图3所示。 据报道, C1(Ex/Em=215 (305)/405 nm)归属为类富里酸组分^[16]; C2(Ex/Em=225(325)/ 465 nm)归属为短波类腐殖酸组分^{[4, 13]}; C3(Ex/Em=265(340)/450 nm)为长波类腐殖酸组分^[17], 与C2相比具有更大的分子量^[4]; C4[Ex/Em=200(220, 275)/320 nm]可归属为类蛋白质^{[4, 17]}。

图3

Fig.3

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	图3 EEM-PARAFAC解析得到的四类荧光组分Fig.3 The four fluorescence components identified by EEM-PARAFAC

图4(a, b)为MRC和RSC DOM及其MW组分中C1—C4的相对含量分布情况。 MRC和RSC DOM均以类腐殖质(C1+C2+C3)组分为主, 占总荧光物质强度的84%~87%。 该结果与已报道的鸡粪稻壳、 麦秸等堆肥以类腐殖质组成为主(80-85%)的结果一致^{[4, 13]}。 结果同时也表明堆肥DOM是一类腐殖化程度较高、 稳定性较好的有机质^{[1, 4, 13]}。 然而两种堆肥DOM在类腐殖质组成上也存在显著的差异。 MRC DOM以类富里酸(C1)组成为主, 占比约为36%, 高于类腐殖酸C2(29%)和C3(19%)。 然而, RSC DOM则以长波类腐殖酸(C3)组分为主, 其相对含量约为42%, 显著高于类富里酸C1(26%)和短波类腐殖酸C2(19%)。 由此可知, RSC中含有较多的高分子类腐殖质, 而MRC则以低分子的类富里酸和腐殖酸组成为主。 对于MW组分, 两种堆肥HMW组分均以长波类腐殖酸(C3)组成为主(34%和85%), 且远高于在MMW和LMW组分中的分布(1%~4%), 表明堆肥DOM中长波类腐殖酸基本富集在HMW组分中。 这与长波类腐殖酸具有较大的分子量结论一致^{[4, 16]}。 值得注意的是, C3在RSC的HMW组分中占比约为MRC的HMW组分的2.5倍, 间接表明RSC和MRC、 DOM在化学组成上的差异主要与HMW组分的荧光组成分布有关。 此外, MMW和LMW组分则以类富里酸(C1)组成为主(41%~53%)。 短波类腐殖酸(C2)组分也主要分布在MMW和LMW组分中, 相对含量为25%~36%。

图4

Fig.4

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	图4 (a)MRC和(b)RSC DOM及其MW组分中C1—C4的相对含量Fig.4 The relative abundances of C1—C4 within DOM and their MW fractions derived from (a) MRC and (b) RSC

HIX、 FI和BIX是表征堆肥DOM来源和组成的重要荧光参数。 其中, HIX值越大表明DOM的腐殖化程度越高^{[4, 5, 10, 15]}。 DOM的HIX值略高于MRC DOM, 表明前者具有较强的芳香度和腐殖化程度。 该结果与UV-Vis光谱特征反映结果以及RSC DOM中含有较多的长波类腐殖酸结果一致。 对于两种类型堆肥, 其MW组分的HIX分布规律基本一致, 即HMW> MMW> LMW(表2)。 结果表明堆肥DOM的分子量越大, 其腐殖化程度越强。 值得注意的是, RSC DOM中HMW组分的HIX值远高于其他的MW组分。 表明RSC DOM中的腐殖质主要富集在HMW组分中, 与HMW组分含有大量的长波类腐殖酸(C3, 85%)结果一致[图4(b)]。 FI和BIX是评价DOM来源的重要参考, 值越大(FI> 1.9, BIX> 0.8)表明自生源DOM贡献越大^[5]。 两种堆肥的FI和BIX值均呈现出: LMW> MMW> HMW, 说明分子量越小自生源贡献越多^{[4, 8, 16]}。 两堆肥的LMW和MMW组分的FI值几乎均大于1.9, 而LMW组分的BIX均大于0.8, 表明来源于微生物降解的有机质是堆肥DOM中< 10 kDa组分, 尤其是LMW组分重要来源。 总之HMW组分可以评价堆肥DOM的腐殖化程度, 而LMW组分可以指示堆肥DOM的自生源贡献。

基于光谱学参数和荧光组分相对含量进行聚类分析, 得到堆肥DOM及其MW组分的聚类图(图5)。 从聚类结果可以看出, MRC DOM及其HMW和MMW聚为一类。 这些组分具有较大的SUVA₂₅₄和HIX以及较小的E₂/E₃, 表明它们具有较高的芳香度和腐殖化程度。 MRC LMW组分则与RSC MMW和LMW组分归为一类。 与上一类组分相比, 此类组分具有较高的自生源贡献及较低的腐殖化程度。 同时, 该结果间接表明MRC中LMW组分可以作为MRCDOM的特征指示物, 用以描述其与其他组分结构间的相似性。 RSC中HMW组分与其他DOM和MW组分具有显著的差异性, 表明RSC DOM的化学组成和分子结构的主要决定物质来源于HMW组分。

图5

Fig.5

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	图5 堆肥DOM及其MW组分的聚类分析Fig.5 Hierarchical cluster analysis for compost DOM and their MW fractions

为探究堆肥DOM及其MW组分的结构差异, 进行了FTIR光谱分析, 结果见图6(a, b)。 不同类型DOM及其MW组分具有类似的红外光谱特征, 包括3 400 cm^-1处的O—H伸缩振动^{[5, 17]}; 2 929 cm^-1的脂肪族C—H伸缩振动^{[5, 17]}; 1 631~1 660 cm^-1的芳香族化合物环内C=C振动, 也可能是羰基或羧基化合物的C=O伸缩振动^{[5, 17]}; 1 395 cm^-1的羧酸的O—H弯曲振动和酚类的C—O伸缩振动^[17]; 1 115 cm^-1的醇或醚的C—O伸缩振动^{[5, 17]}; 1 008~1 030 cm^-1的类碳水化合物C—O伸缩振动或芳香族的C—H变形振动^[17]。 这些相似的光谱特征表明不同类型DOM及其MW组分含有类似的分子结构。

图6

Fig.6

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	图6 (a)MRC和(b)RSC堆肥DOM及其MW组分的FTIR谱图Fig.6 FTIR spectra of (a) MRC and (b) RSC DOM and their MW fractions

如图6(a, b)所示, 不同类型样品之间的吸收峰类型及其强度也存在一定的差异。 与MRC DOM相比, RSC DOM及其MW组分在1 255 cm^-1处具有显著的吸收峰, 表明后者含有较多的酚或羧酸C—O基团。 类似吸收峰也在猪粪和秸秆联合堆肥DOM中发现^[17]。 不同MW的分子结构也存在差异。 两种堆肥DOM在1 584 cm^-1附近的吸收峰只富集在其HMW组分中。 根据Wang等^[18]的研究, 这是DOM中木质素及其衍生物或酰胺化合物的芳环C=C骨架振动, 说明HMW组分含有更多的苯环等疏水性结构, 与SUVA₂₅₄、 HIX及EEM-PARAFAC分析得到结果一致。 MRC和RSC DOM中MMW和LMW组分呈现出更为明显的1 631和1 660 cm^-1的吸收峰, 表明低分子量组分含有较多的羰基或羧基官能团。 MRC LMW组分在1 395 cm^-1处具有较强的吸收峰, 表明LMW富集有较多的羧酸结构; RSC MMW组分在1 255和1 115 cm^-1处具有很强的吸收峰, 说明其含有大量的羧酸官能团; RSC MMW和LMW组分在833和694 cm^-1处具有明显的吸收峰, 与N—H官能团有关^[6]。 不同类型MW组分的分子结构存在显著的差异, DOM的来源也是影响MW组分结构的重要因素。