本论文所涉及的药品均为市售, 四苯基-1, 3-丁二烯(TPB)化学结构如图1, 试剂信息如表1所示。

图1

Fig.1

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	图1 TPB的化学结构Fig.1 Chemical structure of TPB

表1

Table1

表1(Table1)

表1 试剂信息表 Table1 Reagent information table 试剂 纯度 制造商 四苯基-1, 3-丁二烯 > 99.0% 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司 四氢呋喃 AR 国药集团化学试剂有限公司 盐酸四环素(Tetracycline hydrochloride, TC) ≥ 98% Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. 盐酸金霉素(Chlortetracycline hydrochloride, CTC) ≥ 98% Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. 土霉素(Oxytetracycline, OTC) ≥ 98% Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. 强力霉素(Doxycycline, DOX) ≥ 98% Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. 磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine, SMM) ≥ 98% Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. 磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine, SDM) ≥ 98% Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. 磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole, SMZ) 生物技术级 Shanghai Macklin Biociemical Co., Ltd. 磺胺异恶唑(Sulfisoxazole, SIZ) 99% Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. 加替沙星(Gatifloxacin, GAT) 98% Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. 诺氟沙星(Norfloxacin, NOR) ≥ 98% Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. 1 mol· L-1盐酸溶液 - - NaOH - - 去离子水 - -

表1 试剂信息表 Table1 Reagent information table

F-7100荧光光谱仪(日本, 日立)、 UH-5300紫外光谱仪(日本, 日立)、 ZF-1紫外分析仪(中国, 杭州齐威)、 Cary Eclipse荧光分光光度计(美国, Varian)、 BAS124S电子天平(德国, 赛多利斯)、 滨松量子产率设备(日本, 滨松)。

1.3.1 TPB储备液的配制

称量0.0018 g固体TPB于10 mL离心管, 加入四氢呋喃(THF)至10 mL, 最终配制成5.0× 10^-4 mol· L^-1的TPB储备液。

1.3.2 抗生素溶液的配制

称取一定质量的抗生素(图2), 具体用量见表2, 向研磨样品中加入四氢呋喃至10 mL, 最终配制成10 mmol· L^-1的悬浮液, 用于荧光传感实验。

图2

Fig.2

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	图2 抗生素类药物的化学结构Fig.2 Chemical structure of antibiotics

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 抗生素种类及质量 Table 2 Types and quality of antibiotics 抗生素类别 抗生素名称 称取质量/g 四环素类抗生素 盐酸四环素(TC) 0.048 1 盐酸金霉素(CTC) 0.051 5 土霉素(OTC) 0.046 0 强力霉素(DOX) 0.044 4 磺胺类抗生素 磺胺间甲氧嘧啶(SMM) 0.028 0 磺胺二甲氧嘧啶(SDM) 0.031 0 磺胺甲恶唑(SMZ) 0.025 3 磺胺异恶唑(SIZ) 0.026 7 喹诺酮类 诺氟沙星(NOR) 0.031 9 加替沙星(GAT) 0.037 5

表2 抗生素种类及质量 Table 2 Types and quality of antibiotics

1.3.3 水体积分数80%的抗生素混合溶液的配制

用移液枪移取0.30 mL的TPB储备液、 0.30 mL抗生素溶液、 2.40 mL蒸馏水于5.0 mL离心管中, 上下翻转混匀, 制成H₂O体积分数为80%的H₂O-THF溶液, TPB溶液的最终浓度为5.0× 10^-5 mol· L^-1, 抗生素溶液最终浓度为1 mmol· L^-1。

使用荧光光谱仪测定固体TPB的激发光谱和荧光发射光谱, 测试结果见图3, TPB的最大激发波长为365 nm, 最大发射波长为435 nm。

图3

Fig.3

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	图3 TPB的固体荧光发射光谱Fig.3 Solid state fluorescence emission spectrum of TPB

取一定量的TPB固体粉末分别在日光和365 nm紫外灯下照射并观察, 现象如图3插图所示, 发现TPB固体有很强的荧光特性。

另取一定量试样, 采用稳态/瞬态荧光光谱仪测试固体TPB的荧光量子产率, 结果发现, 在365 nm的激发波长下, TPB的量子产率为51.9%。

TPB固体具有很强的荧光特性, 为探究不同溶剂比对TPB荧光的影响, 按表3的含量配制了不同水体积分数的混合溶液。 调节激发波长为365 nm, 扫描范围385~600 nm, 进行荧光测试并记录数据。 结果如图4所示, 在水体积分数小于70%时, 随着体系含水量的增加, 体系荧光强度略有增强, 在水体积分数大于70%时, 聚集诱导发光效应成为主导因素, 导致TPB溶液的荧光强度迅速增加, 且含水率越高, 荧光强度越强。 机理解释如下: 在TPB的THF溶液中加入少量水(f_w≤ 50%), 其发射减弱由于典型的扭曲分子内电荷转移(TICT)效应。 TICT是由供电子和接受电子组成的有机分子中常见的光物理现象。 在极性环境下, 这些分子发生了分子内电子从给体到受体的快速转移, 分子内的D-A构象由共面结构转变为扭曲构象。 随着水含量的进一步增加(f_w≥ 70%), TPB分子由于其疏水效应而形成纳米团聚体。 纳米团聚体中的疏水环境缓解了TICT效应, AIE效应成为主导因素。 即水溶液条件下, AIE分子处于聚集态, 彼此的牵制作用限制了分子内部的运动, 通过荧光辐射的方式散发能量, 产生聚集诱导发光效应, 导致TPB混合物的荧光强度增加^{[18, 19]}。 含水率越高, 荧光强度越大。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 样品组成表 Table 3 Sample composition 水所占 百分量/% 所配样品 体积/mL 水用量 /mL THF用量 /mL TPB储备液 用量/mL 0 3.00 0.00 2.70 0.30 10 3.00 0.30 2.40 0.30 50 3.00 1.50 1.20 0.30 70 3.00 2.10 0.60 0.30 72 3.00 2.16 0.54 0.30 76 3.00 2.28 0.42 0.30 80 3.00 2.40 0.30 0.30

表3 样品组成表 Table 3 Sample composition

图4

Fig.4

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	图4 不同溶剂比的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of different solvent ratios

将水体积分数为10%和80%的TPB溶液放于比色皿中, 在365 nm紫外灯下照射并观察, 现象如图4插图所示, 在水体积分数为80%条件下, 体系荧光强度较高, 荧光现象明显, 而在水体积分数为10%的条件下, 荧光强度较低, 荧光现象不明显。 实验结果直观表明体系荧光强度随着水体积分数的增加而增加。

为研究四环素、 喹诺酮类、 磺胺类抗生素对TPB的荧光猝灭程度, 将不同种类抗生素包括盐酸四环素(Tetracycline hydrochloride, TC)、 盐酸金霉素(Chlortetracycline hydrochloride, CTC)、 土霉素(Oxytetracycline, OTC)、 强力霉素(Doxycycline, DOX)、 磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine, SMM)、 磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine, SDM)、 磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole, SMZ)、 磺胺异恶唑(Sulfisoxazole, SIZ)、 加替沙星(Gatifloxacin, GAT)、 诺氟沙星(Norfloxacin, NOR)按上述方法配制成水体积分数均为80%, 浓度均为1 mmol· L^-1的混合溶液, 振荡摇匀。 并配制一份H₂O体积分数为80%的不含抗生素的溶液作为对照。 进行荧光测试并记录数据。 以上所有抗生素的探究过程均重复上述步骤。 结果如图5所示, 发现仅TPB存在下, 453 nm处有明显的荧光发射峰。 而四环素类抗生素如盐酸四环素、 盐酸金霉素、 土霉素、 强力霉素作用后, 453 nm处荧光发射峰消失, 荧光猝灭比超过90%, 而喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素作用后, 荧光强度略有降低。 由荧光光谱可见, 四环素类抗生素对TPB荧光的猝灭效果最佳。

图5

Fig.5

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	图5 水体积分数为80%时, 相同浓度的抗生素溶液加入后的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectrum of antibiotic solution with the same concentration added when the volume fraction of water is 80%

图6为不同抗生素的紫外-可见吸收漫反射光谱, 因同一种类抗生素光谱相近, 以盐酸四环素、 磺胺二甲氧嘧啶、 诺氟沙星为例。 可以看出, 在250~400 nm范围内四环素类抗生素的吸收光谱和TPB的荧光激发光谱(见图3)有相当程度的光谱重叠, 并且比其他抗生素的重叠更多, 荧光强度明显降低, 满足荧光内滤效应(internal filtration effect, IFE)^[20]的条件。 即当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时, 处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上, 或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光, 使荧光猝灭, 而猝灭剂被激发, 这种猝灭俗称“ 内滤作用” 。 因此, 当四环素类抗生素溶液加入TPB溶液后, 吸收TPB的激发光能量, 导致体系同步荧光强度降低。

图6

Fig.6

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	图6 不同种类抗生素紫外-可见吸收漫反射光谱Fig.6 Ultraviolet-visible absorption diffuse reflectance spectra of different antibiotics

图7为盐酸四环素浓度对猝灭TPB程度的影响。 分别配制了20, 70, 280, 380和481 mg· L^-1的盐酸四环素溶液, 按前述方法配制成水体积分数为70%的混合溶液, 盐酸四环素的终浓度为0.041 6, 0.145 5, 0.582 1, 0.790 0和1 mmol· L^-1, 进行荧光测试并记录数据。 结果表明, 随着盐酸四环素溶液浓度的增加, 体系荧光强度逐渐降低, 即荧光团的荧光发射强度随着分析物浓度的增加而减少。 因此, 荧光强度的变化能反映盐酸四环素溶液浓度的变化^[15], 可用于定量检测四环素类抗生素。

图7

Fig.7

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	图7 加入不同浓度盐酸四环素溶液后的荧光光谱图Fig.7 Fluorescence spectrum after adding tetracycline hydrochloride solution with different concentrations

在水体积分数(f_w=70%)的H₂O-THF溶液中, 用不同浓度的盐酸四环素溶液处理探针TPB。 如图8所示, 最大荧光强度与盐酸四环素浓度在0.041 6~1 mmol· L^-1范围内符合线性方程y=-1.338x+ 984.20, R²=0.997 7, 标准偏差S的计算公式如式(1)

S=∑(xi-x̅)2n-1(1)

图8

Fig.8

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	图8 盐酸四环素溶液的荧光强度与浓度的线性关系曲线Fig.8 Linear relationship curve between fluorescence intensity and concentration of tetracycline hydrochloride solution

式(1)中, S为标准偏差, x_i为第i个数据点, x̅为所有数据点的平均值, n为数据点的个数。 并通过检测限公式DOL=3S/k(S为标准偏差, k为直线斜率)计算检测限为0.042 7 mmol· L^-1。 结果表明, TPB对盐酸四环素响应灵敏, 荧光强度与盐酸四环素溶液的浓度有很好的相关性, 且盐酸四环素对TPB具有很好的猝灭作用。 可以建立一种较快速、 简单、 准确的荧光检测盐酸四环素含量的方法, 同时也为其他具有类似结构的抗生素的分析检测提供参考。

为进一步验证TPB对四环素类抗生素的选择性, 进行了抗干扰性实验验证, 在水体积分数为80%的条件下, 将四环素类抗生素如盐酸四环素、 盐酸金霉素和强力霉素, 与非四环素类抗生素如磺胺间甲氧嘧啶、 磺胺二甲氧嘧啶、 磺胺甲恶唑、 磺胺异恶唑、 诺氟沙星和加替沙星等量混合, 最终抗生素溶液浓度为1 mmol· L^-1, 进行荧光检测, 测试结果如图9(a—c)所示, 发现非四环素类抗生素对四环素类抗生素的荧光猝灭效应干扰较小, 即TPB对四环素类抗生素的选择性较高, 抗干扰能力较强。

图9

Fig.9

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	图9 (a) 盐酸四环素, (b) 盐酸金霉素, (c) 强力霉素, 与竞争抗生素共存时的荧光强度对比, (d) 不同pH条件下, 加入盐酸金霉素溶液后的荧光光谱Fig.9 (a) Tetracycline hydrochloride, (b) Chlortetracycline hydrochloride, (c) Doxycycline, comparison of fluorescence intensity coexisting with competitive antibiotics, (d) Fluorescence spectra after adding Chlortetracycline hydrochloride solution with different pH

在探究出四环素类抗生素对TPB溶液产生猝灭效应后, 进一步探究pH对四环素类抗生素猝灭TPB的影响, 以盐酸金霉素为例, 在水体积分数为80%的条件下, 用1 mol· L^-1盐酸和用氢氧化钠固体配制的1 M氢氧化钠溶液进行pH值的调节, 最终配制pH为1、 2、 3、 7、 11、 12的盐酸金霉素溶液, 进行荧光测试并记录数据。 结果表明, 如图9(d)所示, 盐酸金霉素溶液在碱性条件下不稳定, 对TPB的荧光猝灭效果不佳, 而在pH≤ 7的条件下, 盐酸金霉素对TPB高度猝灭。

分析pH对盐酸金霉素猝灭TPB的影响原因: CTC在D环的10位上有一个氯原子, 反应活性受到氯(R1)取代CTC的影响。 这些取代可以直接改变分子上反应位点的酸碱度, 引起空间位阻, 或增强或削弱四环素类抗生素中存在的交叉共轭体系^[21]。 也有可能是pH值的变化引起了结构构象的变化, 产生了反应中心的空间位阻^[22], 从而导致碱性条件下, 盐酸金霉素对固体TPB的猝灭效果较差, 而在pH≤ 7的条件下, 盐酸金霉素对TPB高度猝灭。

应用荧光检测技术, 进行湖水、 海水及牛奶中四环素类抗生素定量检测。 首先分别取一定量湖水和海水, 过滤除去水中悬浮物, 再用滤膜过滤, 另取5.00 mL的牛奶, 加入1.00 mL 乙腈、 4.00 mL Tris-HCl缓冲溶液(pH 3)、 1.00 mL 100%(w/v)三氯乙酸溶液, 涡旋振荡10 min, 用醋酸纤维滤膜过滤。 然后进行溶液的配制: 向离心管中加入0.30 mL TPB储备液, 0.30 mL 盐酸四环素溶液, 2.40 mL处理后的湖水, 配制成水体积分数为80%, TPB溶液的最终浓度为5.0× 10^-5 mol· L^-1, 抗生素溶液最终浓度为1 mmol· L^-1的混合溶液, 盐酸四环素的海水、 牛奶混合溶液配制过程同上。 测试并记录相关实验数据。 结果如图10。 加入盐酸四环素溶液后, 湖水、 海水、 牛奶体系荧光强度均明显减弱, 且可以通过荧光强度的变化间接反映四环素类抗生素溶液浓度的变化。 因此, 将TPB制作成荧光探针可以实现湖水、 海水和牛奶中四环素类抗生素的定量检测。

图10

Fig.10

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	图10 海水、 湖水、 牛奶与对照组的荧光光谱图Fig.10 Fluorescence spectra of seawater, lake water, milk and control group

与其他方法及结果进行讨论和比较, 具体如表4, 表5。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 本实验与其他方法对比 Table 4 Comparison between this experiment and other methods 研究内容 探究条件 本实验 其他同类型实验 参考文献 水体积分数对 荧光强度的影响 荧光探针类型 TPB TPB [15] 溶剂体系 H2O-THF H2O-THF 研究对象 四环素类抗生素 Fe3+ 最佳水体积分数 80% 随着水体积分数的增加, 体系荧光强度明显增强 不同种类抗生素对TPB 的荧光猝灭程度 四环素类抗生素 对TPB高度猝灭 - 四环素类抗生素荧光 强度与浓度的关系 荧光探针类型 TPB CdTe量子点 [23] 溶液的pH值 pH≤ 7 pH=6.5 狭缝宽度 5 nm 5 nm 荧光强度与浓度 的相关性 TPB对盐酸四环素响应灵敏, 荧光强度与浓度具有很好的相关性, 线性回归方程为y=-1.338x+984.20, R2=0.997 7, 检出限为0.042 7 mmol· L-1 四环素在一定的浓度范围内与体系荧光猝灭强度有着一定的线性关系, 线性方程为Δ F(体系荧光猝灭强度)=2.308 2+9.679 3c(μ g· mL-1) , R2=0.999 5, 检出限为0.025 μ g· mL-1 四环素类抗生素 荧光猝灭效果与 pH值的关系 酸性 荧光猝灭效果较好 回收率较差 吸附量较大 [24, 25] 中性 荧光猝灭效果最佳 回收率较好 吸附量最大 碱性 荧光猝灭效果较差 回收率较差 吸附量最小 TPB的抗干扰能力 较强, 不易受其他非四环素类抗生素的影响 探究AIE型荧光探针在 Fe3+检测上的应用时, 发现TPB的抗干扰能力较强 [15]

表4 本实验与其他方法对比 Table 4 Comparison between this experiment and other methods

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 本实验进行的实际样品检测与其他方法对比 Table 5 The actual samples tested in this experiment were compared with other methods 方法 本实验 其他方法 参考文献 预处理 结论 预处理 结论 湖水 见本文2.6 该技术较为成熟完善, 应用性强, 可以应用到湖水中抗生素的检测中 在室温下, 将水样用0. 45 μ m玻璃纤维滤膜过滤后准确量取500 mL于烧杯中, 用盐酸调至pH 4. 0, 加入0.5 g Na2EDTA充分混匀, 待上柱净化、 富集 在北京养鱼河水中, 喹诺酮类、 氯霉素类、 四环素类、 磺胺类4类15种抗生素均能被检测出 [27] 海水 见本文2.6 该技术可以针对水产品养殖水样中是否含有抗生素进行定量检测 量取100 mL水样, 经0.22 μ m的滤膜过滤后, 加入0.025 g Na2EDTA, 再用甲酸或氨水调节pH值至6.0~8.0。 取调节后的水样1.0 mL, 加入10 μ L内标使用液后, 混匀, 直接进样 在42种抗生素中, 12种抗生素有检出 [28] 牛奶 见本文2.6 该方法技术简单快速、 成本较低, 可以应用于含抗生素的食品检测中 将牛奶样品放置于微型离心管中, 用超声波清洗器超声20 min后加0.5 mL, 10%三氯乙酸摇匀, 放置20 min后, 放入离心机中, 于12 000 r离心5 min, 上层液体通过0.45 μ m的水系醋酸纤维滤膜过滤, 收集滤液 在所检测的185份样品中, 共有16份样品检测出残留的土霉素; 共有2份样品检测出残留的四环素 [26]

表5 本实验进行的实际样品检测与其他方法对比 Table 5 The actual samples tested in this experiment were compared with other methods