草本泥炭购自吉林吉祥有限公司; 活性污泥取自包头市南郊污水处理厂, 并于冰箱中4 ℃保存; 氢氧化钾、 氢氧化钠、 氢氧化锂、 焦磷酸钠、 硫酸、 硫酸亚铁铵、 重铬酸钾均为分析纯, 购于天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2.1 泥炭甲烷发酵

准确称取100目40.000 0 g草本泥炭于锥形瓶中, 加入480 mL 3% NaOH溶液, 置于70 ℃水浴锅中加热110 min。 冷却至室温后调节pH至6.9~7.1, 迅速倒入300 mL活性污泥, 再次调节pH至6.9~7.1。 排出空气后置于51 ℃恒温水浴锅中发酵至日产气量为零时停止发酵, 残渣烘干后备用。 未采用NaOH预处理的泥炭甲烷发酵做对照实验, 每组均做三组平行实验。

1.2.2 腐植酸提取

准确称取5.000 0 g氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣和对照组(泥炭甲烷发酵)残渣, 以固液比(g· mL^-1) 1:4加入5% KOH、 NaOH、 LiOH和Na₄P₂O₇溶液。 浸泡24 h后加入100 mL蒸馏水, 在80 ℃下加热搅拌2 h, 反复离心后取上清液。 用5% H₂SO₄溶液调节pH至2~3, 再次离心, 取下层沉淀烘干备用。 5% KOH、 NaOH、 LiOH和Na₄P₂O₇提取氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣和对照组腐植酸分别命名为SPHA、 PHA、 SSHA、 SHA、 SLHA、 LHA、 STHA、 THA。

1.2.3 纯度与产率

取0.200 0 g 70目腐植酸, 用1% NaOH溶解至100 mL。 移取5.00 mL腐植酸溶液与5.00 mL 0.4 mol· L^-1 K₂Cr₂O₇、 15 mL浓硫酸于锥形瓶中, 置于100 ℃水浴锅中氧化30 min, 冷却到室温后加3~5滴邻菲罗啉指示液, 采用标定后的硫酸亚铁铵滴定, 当溶液由橙色变绿色再变为砖红色时即为终点, 同时做空白对照。 纯度计算公式如式(1)

A=0.03×(V0-V1)×c×VaC×m×Vb(1)

式(1)中: A为腐植酸纯度; 0.003表示碳的毫克当量, g; V₀为滴定空白组消耗的硫酸亚铁铵, mL; V₁为滴定样品消耗的硫酸亚铁铵, mL; c为硫酸亚铁铵的浓度, mol· L^-1; C为含碳比, 0.59; m为腐植酸样品重量, g; V_a为配制的腐植酸溶液的体积, mL; V_b为滴定所取的腐植酸溶液体积, mL。

产率计算公式如式(2)

B=A×mamb(2)

式(2)中: B为腐植酸产率; m_a为分离腐植酸的质量, g; m_b为残渣的重量, g。

1.2.4 光谱分析

紫外-可见光谱分析: 用碳酸氢钠溶解腐植酸样品至100 mg· L^-1并调节pH至7, 置于紫外-可见近红外分光光度计(CAYR 5 000, Agilent), 测定200~800 nm范围内的吸光度, 同时记录465和665 nm处吸光度值, 其比值记作E₄/E₆; 荧光光谱分析: 用碳酸氢钠溶解腐植酸样品至100 mg· L^-1并调节pH至7, 固定激发波长274 nm置于荧光光谱仪(LS55, Perkin Elmer)中, 扫描并记录其光谱图, 其狭缝宽度8 nm、 扫描速度1 000 nm· min^-1、 扫描范围275~650 nm。 傅里叶变换红外光谱分析: 准确称取1 mg腐植酸样品, 用傅里叶变换红外光谱仪(TENSOR Ⅱ , Bruker)测定并记录4 000~400 cm^-1的红外光谱。

图1为不同碱液萃取泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的产率, 由图1可知, 氢氧化钠预处理残渣腐植酸产率明显低于对照组, 氢氧化钾、 氢氧化钠、 氢氧化锂、 焦磷酸钠萃取预处理残渣腐植酸比对照组分别下降了12.6%、 8.57%、 2.52%、 2.66%。 研究发现甲烷发酵过程中, 微生物会降解腐植酸促进甲烷发酵的进程^[17], 而预处理又可以促进甲烷发酵^{[10, 18]}, 使得更多的腐植酸被降解消耗, 产率降低。 氢氧化锂萃取甲烷发酵泥炭残渣和氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的产率均最高, 分别达43.59%、 41.07%; 焦磷酸钠作为萃取剂时, 由于碱性降低^[19], 腐植酸产率较低。

图1

Fig.1

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	图1 泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的产率Fig.1 Yield of humic acids extracted from peat fermentation residue by different extractant

图2为不同碱液萃取泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的纯度, 由图2可知, 除氢氧化钾萃取腐植酸外, 氢氧化钠预处理残渣腐植酸与对照组腐植酸纯度差值在0.2%~0.9%范围, 表明氢氧化钠预处理对甲烷发酵残渣萃取腐植酸纯度影响较小。 氢氧化锂萃取氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣和对照组腐植酸的纯度均最高, 分别是70.4%、 70.6%; 氢氧化钠作为萃取剂时腐植酸纯度次之; 氢氧化钾萃取腐植酸纯度最低, 说明氢氧化锂提取腐植酸的纯度较高。

图2

Fig.2

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	图2 泥炭甲烷发酵腐植酸的纯度Fig.2 Purity of different humic acids extracted from peat fermentation residue by different extractants

不同萃取剂萃取氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣和对照组腐植酸的紫外-可见光谱如图3(a—d)所示, 并测定色谱纯腐植酸(Control)紫外-可见光谱图作为对照。 腐植酸紫外-可见光谱均在210~240 nm出现吸收峰, 后逐渐降低至趋于0, 这是因为腐植酸是高度不饱和芳香化合物, 使其在紫外区有强吸收^[20]。 E₄、 E₆分别指465、 665 nm处的吸光度值, 其比值E₄/E₆是表征腐植酸芳构化程度的重要指标^[21], 研究发现E₄/E₆比值与腐植酸芳香缩合程度、 分子量大小呈负相关趋势, 即比值越大分子量越小, 芳构化程度越低^[22]。

图3

Fig.3

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	图3 泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的紫外-可见光谱 (a): 5%KOH提取物; (b): 5%NaOH提取物; (c): 5%LiOH提取物; (d): 5%Na4P2O7提取物Fig.3 Ultraviolet-Visible Spectra of humic acid extracted from peat fermentation residue (a): 5%KOH extract; (b): 5%NaOH extract; (c): 5%LiOH extract; (d): 5%Na4P2O7 extract

如表1所示, 不同碱液萃取氢氧化钠预处理甲烷发酵腐植酸的E₄/E₆比值均明显低于对照组, 表明氢氧化钠预处理使残渣腐植酸芳构化程度增大, 且提取腐植酸样品的E₄/E₆比值范围与Ding^[23]的研究相似。 牛育华等^[24]研究发现腐植酸分子量M的计算公式为: lgM=-0.089 3E₄/E₆+5.193 5, 根据公式, 对照组腐植酸分子量范围在37 456~72 109之间, 氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣腐植酸分子量范围在49 730~83 717之间, 氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣腐植酸分子量明显升高, 说明泥炭甲烷发酵会导致腐植酸发生降解, 小分子量的组分被微生物降解消耗; 而氢氧化钠预处理的促进作用, 导致更多的腐植酸被降解为小分子后利用^[25], 导致氢氧化钠预处理后腐植酸芳构化程度增大, 分子量增大。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的E4/E6 Table 1 E4/E6 ratio of humic acid extracted from peat fermentation residue E4 E6 E4/E6 Control 0.16 0.43 2.63 SHA 0.05 0.17 3.76 PHA 0.04 0.23 5.22 THA 0.03 0.18 6.94 LHA 0.03 0.22 6.60 SSHA 0.11 0.32 3.03 SPHA 0.04 0.18 4.75 STHA 0.06 0.33 5.56 SLHA 0.07 0.29 3.94

表1 泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的E4/E6 Table 1 E4/E6 ratio of humic acid extracted from peat fermentation residue

不同碱性溶剂萃取对腐植酸E₄/E₆比值也有明显影响。 焦磷酸钠萃取氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣腐植酸与对照组腐植酸的E₄/E₆比值均最大, 分别为6.94、 5.56; 氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣腐植酸与对照组腐植酸的E₄/E₆比值均最小, 分别是3.76、 3.03。 表明由焦磷酸钠萃取得到的腐植酸芳构化程度较低, 分子量较小。

腐植酸结构复杂, 含有多种不饱和基团, 固定激发波长为274 nm, 吸收峰相互交叠形成如图4(a—d)所示的荧光光谱。 由图4可知, 不同腐植酸均在451~482 nm出现荧光峰, 表明存在类富里酸和类腐植酸物质^[26], 且与腐植酸标准品(Control)峰形相似, 证明提取物质确为腐植酸。 与腐植酸标准品(Control)的荧光光谱比较, 不同溶剂萃取氢氧化钠预处理泥炭甲烷发酵残渣腐植酸和对照组腐植酸的吸收峰出现了不同程度的红移或蓝移, 表明不同方式得到的腐植酸结构不完全相同, 腐植酸分子不饱和基团的种类和数量不同。 氢氧化钠萃取腐植酸(SHA)的荧光峰波长最小, 为451 nm; 焦磷酸钠萃取腐植酸(THA)的荧光峰波长最大, 是455 nm。 相比于对照组腐植酸, 氢氧化钠预处理甲烷发酵泥炭残渣腐植酸的荧光峰均发生红移, 氢氧化钾、 氢氧化钠、 氢氧化锂、 焦磷酸钠萃取氢氧化钠预处理甲烷发酵泥炭残渣腐植酸的荧光峰分别从对照组腐植酸的454、 451、 453和455 nm红移到468、 462、 459和483 nm。 Wang^[27]研究表明, 腐植酸类有机物在荧光区呈现红移, 表明分子量、 芳香性和缩聚度增加。 可确定氢氧化钠预处理甲烷发酵泥炭残渣腐植酸的芳构化程度较大, 与E₄/E₆比值结果相似。

图4

Fig.4

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	图4 不同腐植酸的荧光光谱 (a): 5%KOH提取物; (b): 5%NaOH提取物; (c): 5%LiOH提取物; (d): 5%Na4P2O7提取物Fig.4 Fluorescence spectra of humic acids extracted from peat fermentation residue (a): 5%KOH extract; (b): 5%NaOH extract; (c): 5%LiOH extract; (d): 5%Na4P2O7 extract

不同溶剂萃取氢氧化钠预处理甲烷发酵泥炭残渣和对照组腐植酸的红外光谱如图5(a—d)所示, 其中Control表示腐植酸标准品。 由图5(a—d)可知, 不同腐植酸的出峰位置相似, 但峰面积不同, 表明不同溶剂萃取得到的腐植酸中官能团种类大致相似, 只是官能团含量不同。 在3 800~3 500 cm^-1处, 腐质酸红外光谱出现多个吸收峰, 表明有—OH的存在^[28], 不同溶剂萃取得到腐植酸在此处的峰面积大小依次为: THA> LHA> PHA> SHA, 即焦磷酸钠萃取腐植酸的羟基含量较高; 甲基、 亚甲基伸缩振动吸收峰在2 980、 2 900 cm^-1附近^[29], THA峰面积均最大, 表明焦磷酸钠萃取腐植酸甲基、 亚甲基含量较高; 在1 780~1 680 cm^-1范围内, 是由醛、 酮、 羧酸中C=O的伸缩振动所引起^[30], SHA峰面积最大, LHA峰面积最小, 表明氢氧化钠萃取腐植酸可能含有较多的酮、 醛、 羧酸等结构; 芳烃中C=C的伸缩振动峰出在1 560~1 450 cm^-1范围内^[31], 峰面积大小依次为: SHA> LHA> PHA> THA, 表明氢氧化钠萃取腐植酸含有较多的苯环结构, 与E₄/E₆所得氢氧化钠萃取腐植酸芳构化程度较高的结论相互验证。 在1 060 cm^-1附近出现的吸收峰表征烷基醚C—O—C的伸缩振动^[32], THA峰面积最大, SHA峰面积最小, 表明焦磷酸钠萃取腐植酸的醚键含量较多。

图5

Fig.5

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	图5 泥炭甲烷发酵残渣腐植酸的红外光谱图 (a): 5%KOH提取物; (b): 5%NaOH提取物; (c): 5%LiOH提取物; (d): 5%Na4P2O7提取物Fig.5 Infrared spectra of humic acids extracted from peat fermentation residue (a): 5%KOH extract; (b): 5%NaOH extract; (c): 5%LiOH extract; (d): 5%Na4P2O7 extract

不同溶剂萃取氢氧化钠预处理甲烷发酵泥炭残渣和对照组腐植酸的红外光谱出峰位置大致相似。 在3 800~3 500、 2 980、 2 900、 1 060 cm^-1附近, 泥炭残渣腐植酸峰面积明显降低, 表明甲烷发酵后腐植酸的羟基、 甲基、 亚甲基、 醚键含量均降低; 在1 780~1 680、 1 650~1 560 cm^-1附近泥炭残渣腐植酸峰面积明显增大, 表明氢氧化钠预处理甲烷发酵泥炭残渣腐植酸羰基、 苯环含量较高, 再次验证了紫外-见光谱、 荧光光谱的结论。 甲烷发酵过程中, 简单的脂肪烃结构被微生物消耗利用, 而苯环等复杂的无法被微生物利用的结构仍存在于泥炭残渣中, 氢氧化钠预处理的促进作用导致更多的脂肪结构被消耗利用, 故氢氧化钠甲烷发酵泥炭残渣腐植酸芳构化程度较高。