根据资源调查和文献综述, 为了扩大分布特性, 购买了四个代表性产地的铁皮石斛样品共130组, 分别来自云南文山(一年生, 文山市皓霖商贸有限公司)32组, 广西金秀(三年生, 金秀县瑶山绿农生态农业开发有限公司)32组, 安徽霍山(五年生, 霍山牙尖土特产有限公司)32组, 浙江台州(三年生, 浙江凤凰源生物科技股份有限公司)34组, 采集到的干燥茎样品放在带有标签的保存袋中进行下一步分析。

QE-Pro拉曼光谱仪(Ocean opticis公司, 光谱范围: 2 870~200 cm^-1, 分辨率: 0.42 nm)。 RPB4拉曼探头(如海光电)。 785 nm激光器(如海光电)。 UV6100紫外-可见分光光度计(上海元析仪器)。 SMART-N纯水仪(Heal Force公司)。

拉曼光谱采集系统: 激光器、 QE-Pro拉曼光谱仪、 光纤、 计算机系统等, 铁皮石斛光谱采集过程与数据前处理过程如图1所示。 实验参数设置: 积分时间2 000 ms(在不损伤样品的情况下信噪比最高), 平均次数2次, 激光功率为320 mW, 采样间距为1 mm。 采集前对铁皮石斛干条表面进行擦拭处理, 避免其他无关痕量物质干扰。 将每份铁皮石斛样品采集五次拉曼光谱, 取均值作为样品最终拉曼谱。 整个采集光谱过程均在暗室内操作以减少荧光干扰。 每组数据光谱范围为2 870~200 cm^-1, 后续将光谱数据随机排列后输入建立的预测模型中, 80%的数据作为校正集, 20%的样品作为测试集。

图1

Fig.1

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	图1 铁皮石斛光谱采集与数据前处理流程示意 Fig.1 The schematic diagram of spectrum acquisition and data preprocessing of Dendrobium officinale

铁皮石斛总黄酮含量的测定参考2020年版《中国药典》总黄酮含量检测方法^[11]。 对照品溶液的制备: 称取对照品芦丁20 mg溶解于80%乙醇溶液中, 转移至100 mL容量瓶定容。 取0、 0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0、 2.4 mL对照品溶液分别置于10 mL玻璃试管中, 分别加蒸馏水至2.4 mL, 加入5%NaNO₂溶液0.4 mL, 混匀放置6 min; 加入10%Al(NO₃)₃溶液0.4 mL, 混匀放置6 min; 加入4%NaOH溶液4 mL, 混匀放置15 min; 于吸收波长510 nm处测定吸光度, 横坐标为芦丁含量、 纵坐标为吸光度得出回归曲线方程。 准确称取2.0 g过三号筛铁皮石斛粉末, 滤纸封住后置于索氏提取器, 加入120 mL 80%乙醇加热回流1.5 h。 适量活性碳脱色1 h, 过滤, 光照15 min, 取处理好的样品溶液12 mL用80%乙醇定容至25 mL。 精密量取供试品溶液2.4 mL, 自“ 加入5%NaNO₂溶液0.4 mL” 起测定吸光度, 利用回归曲线方程计算出溶液中总黄酮含量。

合理的数据预处理能有效的减少干扰并最大限度地挖掘出特征光谱信息。 采用的光谱数据预处理方法有基线校正、 归一化、 Savitzky-Golay卷积平滑(SG平滑)、 标准正态变量变换(SNV)、 多元散射校正(MSC)^[12]。 以上方法可以减小仪器噪声、 光散射等影响。 特征波长选择从原始光谱中选择一些对研究对象贡献最大的波长。 选择特征波长降低变量的数量, 减少建模复杂度, 有助于获得更准确的性能。 本研究采用CARS来选择最优波长^[13]。

预测模型的选取对于预测样品中的活性成分至关重要。 对比PLS、 SVM和CNN-LSTM模型来预测铁皮石斛中总黄酮含量。 传统的机器学习算法不具有自动提取特征并调节自身参数的能力, 而对于深度学习模型, CNN模型采用权值共享与局部连接的方式, 可直接自动提取光谱数据的局部特征^[14]。 LSTM将提取出来的特征进行训练, 不断调整自身参数达到有效预测铁皮石斛总黄酮含量的目的^[15]。

针对CNN-LSTM模型, 采用拉曼光谱数据数据作为预测模型的输入, 对应的铁皮石斛总黄酮含量数据作为输出。 通过反复的迭代实验发现, 只通过提高CNN-LSTM网络层数不能提高预测的准确度, 在提高网络的层数之后, 训练的参数在不断增加, 而需要预测的总黄酮含量信息简单, 在经过多次迭代之后, 网络的预测模型过度提取校正集特征, 从而造成了过拟合现象, 在训练期间, 采用Dropout方法来减少模型的过拟合现象^[16]。 Dropout方法主要通过将CNN-LSTM网络中的神经元以P的概率随机丢弃, 从而使这些神经元不参与CNN-LSTM网络的训练过程, 使得模型能够合理提取校正集信息, 从而具有较强的抗过拟合性能。

整个CNN-LSTM网络训练模型结构如图2所示。 输入数据通过CNN-LSTM网络的过程: 光谱数据在经过合适的预处理后, 经过卷积层和池化层的特征筛选和降维处理后进入LSTM网络, LSTM网络中的遗忘门、 输入门和输出门通过对CNN处理过的数据进行非线性变换等操作后不断迭代, 从而寻找合适的参数, 使得LSTM网络能够从CNN筛选过的特征数据中学习到铁皮石斛的产地信息, 最后将训练好的CNN-LSTM网络数据通过回归层输出预测值。 CNN-LSTM网络需要通过对校正集的铁皮石斛光谱数据和总黄酮含量信息进行训练确定模型的最优参数, 本文采用Adam算法进行参数优化。 将一维的拉曼光谱数据输入到CNN-LSTM网络中, 所构造的CNN-LSTM网络模型以及相关的参数为:

图2

Fig.2

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	图2 CNN-LSTM结构Fig.2 The architecture diagram of CNN-LSTM

(1)卷积神经网络层: 卷积层包括卷积核和池化核, 卷积核大小为1, 数量32, 大小设定维度向量, 对应拉曼光谱数据, 激活函数为ReLu。

(2)长短期记忆神经网络层: LSTM网络设置2层, 隐藏单元数目设置为128和32, 激活函数设置为为ReLu。

(3)Dropout层: 以25%的概率对神经元进行随机化清零。

(4)全连接层: 神经元个数设置为1, 对应总黄酮含量数据。

(5)回归输出层: 该层为输出层, 用于计算回归任务的均方根误差损失。

(6)训练参数: 最大迭代次数400, 批尺寸20, 学习率0.005。

光谱数据预处理和提取以及预测模型的建立均在MATLAB R2020b上进行。 通过校正集、 测试集相关系数(R_c、 R_p); 校正集、 测试集均方根误差(RMSEC、 RMSEP)评价模型的预测性能。 以R_c和R_p最高、 RMSEC和RMSEP最低的模型作为最优模型。

图3为样品的拉曼原始光谱。 由于光谱的头部和末端均存在噪声, 故只选取了2 806~900 cm^-1范围内的光谱进行建模。 将四个产地拉曼光谱进行背景扣除后, 再进行标准正态变量变换, 如图4所示, 其中731、 1 115、 1 180、 1 592和1 656 cm^-1处峰的形成是由于黄酮类物质的C—C—O等基团振动引起^{[17, 18, 19]}。 但是铁皮石斛成分复杂, 拉曼光谱反映的是其多种生物活性物质叠加的整体效应。 由于化合物分子间的相互作用, 铁皮石斛拉曼特征峰和某个单独的活性成分拉曼峰相比会有所偏移。 所以这些波长不能简单地用于检测特定成分的含量, 后续采用数据分析方法探讨光谱与总黄酮含量的关系。

图3

Fig.3

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	图3 铁皮石斛原始拉曼光谱Fig.3 The raw spectra profile of Dendrobium officinale

图4

Fig.4

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	图4 光谱特征Fig.4 Spectral characteristics

芦丁对照品吸光度与含量回归方程为y=0.537x+0.016, R²=0.999, 表示芦丁在0.08~0.48 mg含量范围内与吸光度线性关系良好。 测定四个产地的铁皮石斛总黄酮含量如表1所示, 校正集铁皮石斛总黄酮含量覆盖了预测集的范围, 使模型更加稳定。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 铁皮石斛总黄酮含量 Table 1 Total flavonoid content of Dendrobium officinale 样本类型 样本 数量 总黄酮含量/(mg· g-1) Min Max Mean SD 云南文山 32 1.06 1.50 1.25 0.11 广西金秀 32 1.05 1.46 1.21 0.12 安徽霍山 32 1.09 1.50 1.20 0.10 浙江台州 34 1.05 1.68 1.27 0.17 校正集 104 1.05 1.68 1.25 0.15 预测集 26 1.06 1.65 1.26 0.16

表1 铁皮石斛总黄酮含量 Table 1 Total flavonoid content of Dendrobium officinale

建立了铁皮石斛中总类黄酮预测校准模型的传统方法(PLS和SVM模型)。 将铁皮石斛归一化光谱数据作为模型输入, 比较不同的预处理方法, 使用CARS筛选波长或全波长, 铁皮石斛总黄酮含量数据作为模型预测输出。 通过使用全光谱和波长筛选, 两个模型的输入变量数量有所不同, 预测结果如表2所示。 从图5可以看出, 采样运行次数为9时, 交叉验证均方根误差(RMSECV)最低, 此时筛选的变量数量为639个, 经MSC预处理, 设置主因子数为6后, PLS模型具有较高的预测准确度, R_c、 R_p分别为0.982和0.948, RMSEC、 RMSEP分别为0.028和0.050 mg· g^-1, 预测结果图如图7(a)所示。 而对于SVM模型, 基于网格搜索法对参数C和γ 进行筛选, 从图6可以看出, 最佳C和γ 分别为32和0.041, 此时R_c、 R_p分别为0.997和0.943, RMSEC、 RMSEP分别为0.013和0.056 mg· g^-1, 准确率较高。 SVM模型预测结果如图7 (b)所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 PLS和SVM模型预测总黄酮含量结果 Table 2 The prediction results of total flavonoids by PLS and SVM models 模型 预处理 模型参数 数据类型 特征数量 Rc RMSEC/(mg· g-1) Rp RMSEP/(mg· g-1) PLS None k(7) CARS 639 0.954 0.044 0.923 0.059 SG k(11) Full 1 967 0.976 0.032 0.922 0.060 SNV k(6) CARS 639 0.980 0.030 0.944 0.052 MSC k(6) CARS 639 0.982 0.028 0.948 0.050 SVM None C(32) γ (0.041) Full 1 967 0.997 0.013 0.943 0.056 SG C(32) γ (0.041) Full 1 967 0.993 0.018 0.922 0.066 SNV C(8) γ (0.002) Full 1 967 0.959 0.046 0.928 0.062 MSC C(8) γ (0.002) Full 1967 0.959 0.046 0.929 0.062

表2 PLS和SVM模型预测总黄酮含量结果 Table 2 The prediction results of total flavonoids by PLS and SVM models

图5

Fig.5

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	图5 CARS特征波长筛选过程Fig.5 The sifting process of characteristic wavelength by CARS

图6

Fig.6

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	图6 网格搜索法寻优过程 (a): SVR参数选择结果(等高线); (b): SVR参数选择结果(3D视图)Fig.6 The optimization process of grid search method (a): Parameter selection results of SVR (contour map); (b): Parameter selection results of SVR (3D view)

图7

Fig.7

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	图7 模型预测结果 (a): PLS模型; (b): SVM模型Fig.7 Themodel prediction results (a): PLS model; (b): SVM model

使用CNN-LSTM作为建模方法, 铁皮石斛光谱数据处理方式同2.3节。 训练过程过程如图8(a, b)所示。 表3显示了CNN-LSTM的预测精度。 在使用SNV预处理后选择全光谱, CNN-LSTM模型的R_c、 R_p分别为0.983和0.964, RMSEC、 RMSEP分别为0.032和0.047 mg· g^-1, 该模型预测铁皮石斛总黄酮含量精度最高, CNN-LSTM对铁皮石斛总黄酮含量预测效果如图9所示。 研究发现CNN-LSTM模型只需要通过CNN对特征进行提取并结合LSTM对冗余长序列数据进行有效去除并调节自身参数的能力, 便可以有效地对铁皮石斛总黄酮含量进行预测。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 CNN-LSTM模型训练过程 (a): 训练过程中均方根误差变化趋势; (b): 训练过程中损失函数变化趋势Fig.8 The training process of CNN-LSTM model (a): Variation trend of root mean square error in the training process; (b) Variation trend of the loss function in the training process

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 CNN-LSTM模型预测总黄酮含量结果 Table 3 The prediction results of total flavonoids by CNN-LSTM model 模型 预处理 数据类型 特征数量 Rc RMSEC/(mg· g-1) Rp RMSEP/(mg· g-1) CNN-LSTM None Full 1 967 0.900 0.061 0.830 0.086 SG Full 1 967 0.878 0.071 0.837 0.084 SNV Full 1 967 0.983 0.032 0.964 0.047 MSC Full 1 967 0.965 0.041 0.959 0.053

表3 CNN-LSTM模型预测总黄酮含量结果 Table 3 The prediction results of total flavonoids by CNN-LSTM model

图9

Fig.9

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	图9 CNN-LSTM模型预测结果Fig.9 The prediction results of CNN-LSTM model

比较传统机器学习模型(PLS和SVM)和CNN-LSTM深度学习模型对铁皮石斛总黄酮含量预测性能结果, CNN-LSTM深度学习模型预测准确性有了提高。 与PLS模型相比, CNN-LSTM模型的R_c、 R_p分别增加了0.001、 0.016, 而且PLS需要采用CARS算法对拉曼光谱数据波长进行筛选才能达到最优效果, 面对不同的数据, 主因子数也需要不断地调整; 而与SVM模型相比, CNN-LSTM模型的R_p增加了0.021, R_c反而降低0.014, 这主要是因为SVM模型训练校正集数据时由于通过网格搜索法调参, 存在搜索到局部最优解的情况, 可能产生过拟合, 因此在面对不同的数据的情况下, 寻优算法存在着一定缺陷; 而对于CNN-LSTM模型, 采用Dropout方法便可以减少自身训练时的过拟合情况, 且CNN-LSTM深度学习模型融合了CNN(自动提取光谱数据局部特征属性)和LSTM(负责推导光谱特征数据携带的化学物质含量属性)的优点, 对铁皮石斛总黄酮含量预测具有一定的优势, 而且随着数据量的增加, CNN-LSTM模型能自动学习新特征进行性能的提升。 另外SVM和CNN-LSTM模型均为全波段光谱数据建模结果最优, 主要因为CARS是一种基于PLS模型回归系数的波长选择方法, 在使用以上两个模型进行训练时, 存在着非线性光谱信息丢失的可能。