卤酸脱卤酶DehE的重组大肠杆菌E.coli BL21(Pet22b+DehE), 委托生工生物工程股份有限公司进行全基因合成、 载体构建并成功表达, 由本实验室保藏; 正常大肠杆菌E.coli BL21, 由本实验室保藏。

2-萘酚-6, 8-二磺酸二钾(2-Naphthol-6, 8-disulfonate dipotassium, NDSDP)、 8-羟基芘-1, 3, 6-三磺酸三钠盐(8-Hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulfonate sodium, HPTS), 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethane sulfonic acid, HEPES)、 氢氧化钠、 2-氯丙酸(2-Chloropropionic acid, 2-CP)、 乳酸(Lactic acid, HL)、 磷酸二氢钾、 氯化钠均为分析纯试剂, 甲醇、 磷酸为色谱级试剂, 酵母提取物, 胰蛋白胨, 均购于上海泰坦科技股份有限公司; 实验用水为自制去离子水。

实验室pH计FE20, 梅特勒-托利多仪器有限公司; 恒温孵育摇床ES-60, 杭州米欧仪器有限公司; 电子天平ISO 9001, 北京赛多利斯仪器系统有限公司; 高速离心机TG16-WS, 上海卢湘仪离心机仪器有限公司; 恒温混匀仪VS-100C, 无锡沃信仪器制造有限公司; 立式高压蒸汽灭菌器LDZF-50L-Ⅱ , 上海申安医疗器械厂; 超微量紫外分光光度计NanoDrop one, 赛默飞世尔科技有限公司; 荧光分光光度计FL6500, 珀金埃尔默股份有限公司; 高效液相色谱仪Agilent 1260 Infinity Ⅱ , 安捷伦科技有限公司。

1.2.1 溶液配制

HEPES缓冲液: 称取HEPES固体2.3831 g溶于5 mL去离子水中, 配制终浓度为2 mol· L^-1的HEPES储备液, 再取适量加入去离子水稀释, 并用4 mol· L^-1的氢氧化钠溶液调节pH, 配制成不同pH(6.00~10.50)、 浓度为所需浓度的系列HEPES缓冲液。

2-CP溶液: 量取2-CP液体适量, 用HEPES缓冲液8 mL稀释, 并用4 mol· L^-1的NaOH溶液调pH, 配制成pH与稀释用HEPES缓冲液的pH相同、 浓度为所需浓度的2-CP溶液。

LB培养基: 称取酵母提取物0.5 g, 氯化钠1.0 g, 胰蛋白胨1.0 g, 溶解于100 mL去离子水中, 用4 mol· L^-1的氢氧化钠溶液调pH至中性, 在立式高压蒸汽灭菌器里以121 ℃高压蒸汽灭菌30 min后, 冷却备用。

1.2.2 全细胞菌体的培养及制备

从冻存管中取DehE重组大肠杆菌的甘油菌液100 μ L接种于含氨苄西林50 mg· L^-1的5 mL LB培养基中, 置于恒温孵育摇床中在37 ℃、 200 r· min^-1条件下培养过夜。 取该培养液以体积分数2%(v/v)接种于含氨苄西林50 mg· L^-1的100 mL LB培养基, 在37 ℃、 200 r· min^-1条件下培养至OD₆₀₀(optical density at 600 nm)为0.6~1.0(大致培养2.5 h。 OD₆₀₀为细菌混悬液在600 nm处的光密度, 由超微量紫外分光光度计测定, 一般表示细菌混悬液的细胞浓度)。 向培养基中加入诱导剂异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷0.011 9 g(终浓度为0.5 mmol· L^-1), 在27 ℃、 200 r· min^-1条件下诱导过夜, 在高速离心机中5 000 g离心5 min, 收集菌体, 用生理盐水重悬洗涤, 5 000 g离心5 min, 洗涤两次, 收集菌体, 于-20 ℃储存, 备用。

正常大肠杆菌E.coli BL21于LB培养基中培养, 除不加诱导剂外, 其余同法操作。

1.2.3 荧光-pH指示剂的pH敏感性测定

称取0.019 0 g的NDSDP固体(λ _ex=365 nm, λ _em=460 nm)和0.026 2 g的HPTS固体(λ _ex=375 nm, λ _em=512 nm)分别溶于10 mL去离子水中, 配制成终浓度均为5 mmol· L^-1的储备液。 再分别取适量NDSDP、 HPTS储备液用不同pH的HEPES浓度为20 mmol· L^-1的系列HEPES缓冲液稀释成终浓度分别为10和1 μmol· L^-1的pH梯度溶液。 取各自的pH梯度溶液60 μ L, 用光路长为1 mm的石英比色皿在荧光分光光度计中进行荧光光谱扫描。

1.2.4 方法的可行性分析

根据DehE能催化2-氯丙酸脱卤生成相应的乳酸并改变反应体系pH(图1)这一催化原理, 进行荧光检测。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 DehE催化2-氯丙酸转化为乳酸Fig.1 DehE catalyzes the conversion of 2-chloropropionic acid to lactic acid

分别取足量的DehE重组大肠杆菌和BL21正常大肠杆菌湿菌体, 用pH 8.25^[9]、 20 mmol· L^-1的HEPES缓冲液稀释至菌液OD₆₀₀=2.0。 按表1添加试剂构建反应体系, 进行催化反应活性检测(菌体反应液OD₆₀₀为1.0, NDSDP和2-CP的终浓度分别为10 μmol· L^-1和30 mmol· L^-1), 在恒温混匀仪中进行, 在30 ℃^[4]、 800 r· min^-1条件下反应, 按时取样60 μ L, 用光路长为1 mm的石英比色皿进行荧光光谱扫描(λ _ex=365 nm, λ _em=460 nm)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 反应体系中的试剂用量 Table 1 The amount of reagent used in the reaction system 试剂用量/μ L HEPES (20 mmol· L-1, pH 8.25) DehE 菌液 BL21 菌液 NDSDP溶液 (5 mmol· L-1) 2-CP溶液 (60 mmol· L-1, pH 8.25) Buffer+substrate 750 0 0 3 750 DehE+buffer 0 750 0 3 0 DehE+buffer+substrate 0 750 0 3 750 BL21+buffer+substrate 0 0 750 3 750

表1 反应体系中的试剂用量 Table 1 The amount of reagent used in the reaction system

1.2.5 荧光检测方法的条件优化

采用正交实验法, 根据可能影响荧光强度变化的条件, 选取反应体系中的HEPES浓度(A)、 pH(B)、 温度(C)、 2-CP浓度(D)为考察因素, 每因素4水平(表2)。 菌体反应液OD₆₀₀恒定为1.0, 以15 min时DehE组与BL21组的荧光变化率ω 之差Δ ω 为考察指标, 以15 min时的BL21菌反应液的荧光变化率ω 为假阳性控制指标。 计算公式如式(1)和式(2)

ω=(I0-It)/I0×100%(1)

Δω=ωBL21-ωDehE(2)

式(1)和式(2)中, I₀为0 min时荧光强度, I_t为15 min时的荧光强度。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 正交试验因素水平设计 Table 2 Factor level design of orthogonal experiment 编号 A/(mmol· L-1) B C/℃ D/(mmol· L-1) 1 10 8.00 25 15 2 20 8.25 30 30 3 30 8.50 35 45 4 40 8.75 40 60

表2 正交试验因素水平设计 Table 2 Factor level design of orthogonal experiment

1.2.6 方法的专属性验证

根据反应前后底物2-CP以及产物HL量的变化, 采用HPLC对所建卤酸脱卤酶活性全细胞荧光检测方法的专属性进行验证。

色谱条件^[11]: 色谱柱喆分Acutfex PW-C18(250× 4.6 mm, 5 μm); 流动相0.04 mol· L^-1 KH₂PO₄-H₃PO₄缓冲液(pH 2.4)∶ 甲醇=95∶ 5; 流速0.8 mL· min^-1; 柱温30 ℃; 检测波长214 nm。

对照品溶液的制备与检测: 吸取10 μ L的 HEPES储备液、 4.13 μ L的2-CP、 3.35 μ L的HL分别溶于1 mL的0.04 mol· L^-1 KH₂PO₄-H₃PO₄缓冲液(pH 2.40), 制成各自的对照品溶液。 再取10 μ L的 HEPES储备液、 4.13 μ L的2-CP、 3.35 μ L的HL溶于1 mL的0.04 mol· L^-1 KH₂PO₄-H₃PO₄缓冲一(pH 2.40), 制备混合对照品溶液。 均取适量溶液过0.22 μm的尼龙滤膜后进行HPLC检测。

菌体反应液的检测: 在反应体系中菌体OD₆₀₀为1.0、 HEPES浓度20 mmol· L^-1、 pH 8.50、 45 ℃、 2-CP浓度45 mmol· L^-1条件下, 不加NDSDP反应1 h后以5 000 r· min^-1离心5 min, 取上清液500 μ L, 加入甲醇500 μ L, 混合均匀后以5 010 r· min^-1离心5 min, 取适量上清液过0.22 μm的尼龙滤膜后进行HPLC检测。

某些荧光物质分子、 离子间的平衡状态随溶液pH值发生改变, 进而导致其荧光强度亦发生变化, 可用作pH指示剂。 Nevolova等^[9]筛选出了具有较强pH敏感性的荧光-pH指示剂HPTS。 本研究根据HPTS的化学结构, 选择了一种结构相似的荧光物质NDSDP。 二者的pH梯度荧光光谱如图2(a, b)所示, pH敏感性测定结果如图3所示。 NDSDP在卤酸脱卤酶活性良好的弱碱性范围(pH 8.0~9.5)内具有更强的pH敏感性, 并且容易获取, 成本低, 故选择NDSDP作为荧光-pH指示剂进行后续实验。

图2

Fig.2

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	图2 (a) NDSDP的pH梯度荧光光谱(n=3); (b): HPTS的pH梯度荧光光谱(n=3)Fig.2 (a) pH gradient fluorescence spectra of NDSDP (n=3); (b) pH gradient fluorescence spectra of HPTS (n=3)

图3

Fig.3

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	图3 NDSDP、 HPTS的pH敏感性对比(n=3)Fig.3 Comparison of pH sensitivity between NDSDP and HPTS (n=3)

选择2-卤代羧酸脱卤酶中研究较为广泛的DehE脱卤酶作为实验对象, 以通用底物2-CP为实验底物, 以无细胞毒性的HEPES溶液为缓冲体系进行实验。 由于2-CP为羧酸类化合物, 显酸性, 直接投入反应液中会影响反应, 所以在反应前先将2-CP经HEPES缓冲液稀释并调节pH。 将等pH值的HEPES缓冲液和2-CP溶液等量混合后pH值无变化, 故采取等量混合的方式进行实验。

荧光检测结果如图4所示, 当反应体系仅有底物2-CP、 HEPES缓冲液以及NDSDP存在时, NDSDP的荧光值无明显变化, 表明底物自发反应引起的指示剂荧光强度减小可忽略不计, 反应体系保持稳定; 当反应体系仅有菌体、 HEPES缓冲液以及NDSDP存在时, NDSDP的荧光值无明显变化, 表明只有菌体存在时反应体系保持稳定; 当BL21菌体、 底物2-CP、 HEPES缓冲液以及NDSDP都存在时(BL21组), NDSDP的荧光值无明显变化, 表明没有DehE时, 该方法在此反应条件下不易出现假阳性结果对实验产生干扰; 当DehE菌体、 底物2-CP、 HEPES缓冲液以及NDSDP都存在时(DehE组), NDSDP的荧光值出现显著下降, 表明反应体系的pH降低, 发生了由卤酸脱卤酶DehE催化的2-CP脱卤反应。 因此, 建立的卤酸脱卤酶酶活性全细胞荧光检测方法是可行的。

图4

Fig.4

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	图4 荧光光谱法检测DehE活性(n=3)Fig.4 DehE activity was determined by fluorescent assay (n=3)

由图4可知, 反应进行15 min时的DehE组的荧光强度降低了20%, 发生了明显变化, 因此以15 min时的DehE组和BL21组的荧光变化率ω 之差Δ ω 为考察指标; 同时为防止假阳性结果的出现, 设置15 min时的BL21组的荧光变化率ω 为假阳性控制指标。

正交试验的直观分析结果见表3。 Δ ω 的直观分析表明, 各因素作用的主次顺序为A> C> B> D, 即HEPES浓度为主要影响因素。 根据16组实验中ω _BL21的计算结果, 并考虑到测量误差, 规定ω _BL21高于5%± 1%, 即高于6%时, 为假阳性结果。 又因为16组实验中ω _BL21> 6%的频率为25%, 所以规定某一水平下ω _BL21> 6%的频率超过25%时, 认定为易出现假阳性结果, 须舍弃该水平。 在HEPES浓度因素里, k1> k2> k3> k4, 表明HEPES浓度越高, 缓冲能力越强, pH变化也就越困难, 但在A1水平下ω _BL21> 6%的频率为75%, 即在A1水平下, 反应体系弱缓冲能力过弱, 易出现假阳性结果, 而在A2水平下ω _BL21> 6%的频率为25%, 故舍弃A1, 最优水平为A2。 同理, pH最优水平为B3, 温度最优水平为C4, 2-CP浓度最优水平为D3。 综上所述, 所建方法最优条件为反应体系中HEPES浓度20 mmol· L^-1、 pH 8.50、 2-CP浓度45 mmol· L^-1, 温度有待进一步优化。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 条件优化的正交试验设计及结果(n=3) Table 3 Orthogonal experimental design and results of conditions optimization (n=3) 编号 A B C D Δ ω ω BL21 1 1 1 1 1 20% 3% 2 1 2 2 2 36% 7% 3 1 3 3 3 58% 8% 4 1 4 4 4 67% 12% 5 2 1 2 3 18% 4% 6 2 2 1 4 18% 0% 7 2 3 4 1 50% 6% 8 2 4 3 2 46% 7% 9 3 1 3 4 20% 0% 10 3 2 4 3 39% 1% 11 3 3 1 2 16% 2% 12 3 4 2 1 20% 6% 13 4 1 4 2 11% 4% 14 4 2 3 1 8% 3% 15 4 3 2 4 5% 4% 16 4 4 1 3 7% 3% k1 45% 17% 15% 25% k2 33% 26% 20% 27% k3 24% 32% 33% 30% k4 8% 35% 42% 28% R 38% 17% 27% 6%

表3 条件优化的正交试验设计及结果(n=3) Table 3 Orthogonal experimental design and results of conditions optimization (n=3)

在反应体系中菌体OD₆₀₀=1.0、 20 mmol· L^-1 HEPES、 pH 8.50、 45 mmol· L^-1 2-CP条件下反应, 对温度因素设置40、 45和50 ℃三个水平分别进行荧光检测。 结果见表4, 表明温度越高, Δ ω 值越大, 但在50 ℃条件下ω _BL21> 6%, 即易出现假阳性结果, 而45 ℃条件下ω _BL21=6%, 故最优温度为45 ℃。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 温度因素优化结果(n=3) Table 4 Temperature optimization results (n=3) 编号 温度/℃ Δ ω ω BL21 1 40 37% 6% 2 45 47% 6% 3 50 52% 7%

表4 温度因素优化结果(n=3) Table 4 Temperature optimization results (n=3)

按照筛选出的最优条件, 在稀释菌液OD₆₀₀=2.0(反应体系中菌体OD₆₀₀=1.0)的条件下进行反应后检测, 结果如图5。 可以看出15 min时DehE组的荧光强度就下降了50%, 且BL21组的荧光强度无明显变化。

图5

Fig.5

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	图5 最优条件下进行DehE活性荧光检测(n=3)Fig.5 DehE activity was detected by fluorescent assay under the optimal conditions (n=3)

按照优化后的条件反应, 取样进行HPLC检测, 结果如图6所示。 可以看出: BL21组中, 由于底物自发的脱卤反应, 有极少量HL生成; DehE组中, 经DehE的催化, 有大量的HL生成, 同时对比BL21组, 也可以看出2-CP的减少。 因此, 经过HPLC的验证, 采用荧光光谱法的卤酸脱卤酶活性全细胞检测方法是可行的。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 HPLC验证色谱图 A: 混合对照品色谱图; B: BL21组色谱图; C: DehE组色谱图; a为HEPES色谱峰; b为HL色谱峰; c为2-CP色谱峰Fig.6 HPLC chromatogram of method validation A: mixed control chromatogram; B: Chromatogram of BL21 group; C: Chromatogram of DehE group; Peak a is HEPES; peak b is HL; peak c is 2-CP

在优化后的条件下进行荧光检测, 设置稀释菌液OD₆₀₀值为2.0、 1.0、 0.5、 0.4、 0.3分别进行反应, 以15 min时的荧光变化率ω 为考察指标, 结果见表5。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 检测限的测定结果(n=3) Table 5 The determination for limit of detection (n=3) 编号 OD600 ω DehE ω BL21 1 2.0 54% 3% 2 1.0 38% 4% 3 0.5 25% 3% 4 0.4 14% 3% 5 0.3 11% 3%

表5 检测限的测定结果(n=3) Table 5 The determination for limit of detection (n=3)

将ω _DehE作为检测信号, ω _BL21作为噪音, 按照信噪比为3∶ 1计算检测限。 虽然OD₆₀₀=0.3时信噪比为3.7, 仍大于3, 但考虑到检测误差, 将检测限设定偏高, 即该方法对DehE菌体检测限为菌液OD₆₀₀=0.3。 由此可以推出结论: 当微生物含有的卤酸脱卤酶活性与DehE相当时, 所建立的方法对该微生物的检测限为菌液OD₆₀₀=0.3。