供试水稻土采集于江西省农业科学院宜春市高安试验基地(115° 7'49″E, 28° 15'21″N), 如图1所示。 在未进行过试验的田块上, 采用五点法在田块内采集表层(0~20 cm)土。 采集的土壤样品及时带回实验室, 去除根系等杂质, 新鲜土样过2 mm筛, 装入自封袋贴上标签置入4 ℃冰箱中待用。 试验开始前土壤基础理化性质见表1。 供试紫云英品种为余江大叶, 在盛花季取样, 带回实验室切碎至2 cm。 紫云英鲜草含水量为89.2%, 含碳量为396.2 g· kg^-1, 含氮量为28.4 g· kg^-1, C/N为13.9。

图1

Fig.1

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	图1 研究区域和采样点位置Fig.1 Study area and sampling point plot

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 供试土壤基础理化性质 Table 1 Initial soil physiochemical properties before experiment pH 有机质/(g· kg-1) 全氮/(g· kg-1) 碱解氮/(mg· kg-1) 有效磷/(mg· kg-1) 速效钾/(mg· kg-1) 供试土壤 6.53 11.78 1.18 111.39 5.04 78.57

表1 供试土壤基础理化性质 Table 1 Initial soil physiochemical properties before experiment

为探究水稻土添加紫云英后不同复水时间对土壤DOM结构特性和CH₄排放的影响, 本试验共设置1个不添加绿肥对照组和3个添加绿肥不同复水时间的实验组, 共计4个处理, 实验设计如图2所示。 称取200 g过筛后的新鲜土样加入500 mL培养瓶中, 试验组每个烧杯添加4 g(大田实际还田量两倍)紫云英鲜样, 充分摇匀混合。 分别在第0天、 第5天、 第10天添加200 mL纯净水模拟大田淹水环境, 用透气封口膜封口, 每隔两天称重法补充水分, 25 ℃恒温培养。 在第11天取样, 测定土壤DOM浓度(表2), 将6个处理的土壤DOM均调整为40 g· kg^-1浓度, 容积为200 mL。

图2

Fig.2

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	图2 实验设计Fig.2 Schematic diagram of experimental design

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 DOM荧光光谱参数计算公式 Table 2 Calculation formula for DOM fluorescence spectroscopy parameters 光谱参数 表达公式 荧光指数(FI) FI370=FI450 nm/FI500 nm, λ Ex=370 nm 腐殖化指数(HIX) HIX=∑FI435~480nm/(∑FI300~345nm+∑FI435~480nm), λEx=255nm 自生源指数(BIX) BIX=FI380 nm/FImax420~435 nm, λ Ex=310 nm

表2 DOM荧光光谱参数计算公式 Table 2 Calculation formula for DOM fluorescence spectroscopy parameters

称取相当于100 g风干土样的鲜土样品加入到500 mL的培养瓶中, 调节样品土壤含水量为饱和含水量的40%, 在25 ℃培养箱中进行7天的恒温预培养, 使土壤环境趋于稳定状态。 在预培养结束后, 将调整后的土壤DOM溶液添加到培养瓶中, 并将瓶盖拧紧, 使其完全密封。 每个处理设置3个重复, 再添加土壤DOM溶液后的第1、 3、 5、 7、 9、 11、 18、 25、 32、 40天用注射器抽取气样, 每次取样前24 h打开瓶盖通气1 h, 然后将瓶盖拧紧, 取完样品立即用气相色谱仪进行测定。

1.3.1 DOM浸提与测定

将培养瓶中的水土比调节到1:1(鲜土重量g:液体体积mL), 25 ℃时200 r· min^-1振荡16 h; 4 ℃时10 000 r· min^-1离心15 min, 上清液过0.45 μ m滤膜, 得到DOM溶液置于4 ℃冰箱避光保存待用。

DOM浓度采用德国耶拿公司MulitN/C 3100分析仪测定, 各个处理DOM的质量均为扣除纯水空白对照所得到的数值。

1.3.2 DOM三维荧光测定

DOM三维荧光测定: 采用日本Hitachi F-7000荧光光谱仪, 激发波长Ex扫描为200~450 nm, 采样间隔为5 nm, 发射波长Em扫描为250~600 nm, 采样间隔为2 nm, 扫描速度为2 400 nm· min^-1, 用Milli-Q超纯水作空白样测定。

表2为DOM荧光光谱参数计算公式, 激发波长为370 nm时在450、 500 nm两处荧光发射强度的比值为荧光指数(fluorescence index, FI)。 激发波长为255 nm时, 发射波长435~480 nm处荧光强度与300~345 nm波长范围和435~480 nm内荧光强度之和的比值为腐殖化指数(humification index, HIX)。 激发波长为310 nm时在380、 430 nm两处荧光发射强度的比值为自生源指数(biological index, BIX)。 用平行因子分析(PARAFAC)方法将三维荧光光谱结果分解为独立组分, 半分法和残差分析用于检验PARAFAC模型的准确性, 进而确定荧光组分的峰位置和强度。

1.3.3 温室气体排放速率

气相色谱仪(GC, Agilent 7890B, 美国)配备有火焰电离检测器(FID)和电子捕获监测器(ECD), 用于测定CH₄、 N₂O浓度。 CH₄排放通量计算公式为

F=MV0×Vm×dcdt×T0T×PP0(4)

式(4)中, F为气体通量(CH₄为μ g· kg^-1· h); M为气体摩尔质量(g· mol^-1); V₀为标准条件下理想气体的摩尔体积(22.41 L· m^-3); V和m分别为气体有效容积(m³)和土壤质量(kg); d_c/d_t为单位时间培养瓶内气体质量浓度变化率(ppm· min^-1); T₀为标准状态下的气体绝对温度(T₀=273 K), P₀为标准状态下的气体密度(P₀=1 013 mb); T是培养箱内的空气实际温度(K); P是实际的局部大气压强(mb)。

CH₄累计排放量计算公式为

F累计=∑i=1n(Fi×Di)Fi×Di(5)

式(5)中, F_累计表示温室气体累计排放量(μ g· kg^-1), F_i为间隔两次取样的气体平均排放速率; D_i为采样间隔天数(d), n为采样次数。

使用Origin Pro2018、 R Studio(version 4.2.1)和MATLAB R2022b软件进行统计分析。 采用方差分析确定显著差异, 使用“ stats” 包中的(TukeyHSD)函数进行Tukey HSD检验。 使用MATLAB R2022b软件和DOMFluor软件包进行PARAFAC分析, 各荧光组分特征峰Origin Pro2018软件上采用峰值分析功能鉴别。 采用vegan包中的capscale()函数进行主坐标轴分析(partial canonical analysis of principal coordinates, CAP), 以探究水分管理对土壤DOM结构的影响。 使用corrplot包中的(cor)函数进行pearson相关性分析。

由表3可知, 不同水分管理下稻田土壤DOM含量介于48.32~164.35 mg· kg^-1之间。 与不添加绿肥0天复水(DW-0)相比, 添加绿肥后当天复水土壤DOM含量显著增加(p<0.05), 增幅为240.13%。 紫云英作为优质碳源, 翻压到土壤后可产生大量可溶性有机物, 导致土壤DOM含量增加, 使微生物活性增强, 从而对土壤DOM含量形成正反馈效应。 添加绿肥后不同水分管理下土壤DOM含量表现为G+DW-0(164.35 mg· kg^-1)>G+DW-10(77.78 mg· kg^-1)>G+DW-5(64.86 mg· kg^-1)。 可能归因于较长时间的好氧环境会抑制稻田土壤微生物的活性^[11], 使紫云英腐解变慢, 导致DOM含量较G+DW-5小幅度降低。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同水分管理稻田土壤DOM浓度 Table 3 Soil DOM concentration in paddy fields under different water management 处理 DOM/ (mg· kg-1) 需要DOM 溶液量/mL 加入纯净水 量/mL DW-0 48.32± 1.63e 161.0 39.0 G+DW-0 164.35± 5.25a 47.2 152.8 G+DW-5 64.86± 0.51c 122.4 77.6 G+DW-10 77.78± 0.32b 103.3 96.7 注: DW-0: 无绿肥0天复水; G+DW-0: 绿肥0天复水; G+DW-5: 绿肥5天复水; G+DW-10: 绿肥10天复水(下同) Note: DW-0: No green manure immediately flooding; G+DW-0: green manure immediately flooding; G+DW-5: green manure flooding after 5 days; G+DW-10: green manure flooding after 10 days(The same below)

表3 不同水分管理稻田土壤DOM浓度 Table 3 Soil DOM concentration in paddy fields under different water management

由图3(a), CH₄排放主要集中在培养的前7天, 7天之后CH₄排放通量均低于0.5 μ g· kg^-2· h^-1, 此后一直维持在较低水平, 各处理CH₄排放通量的动态变化趋势大体一致。

图3

Fig.3

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	图3 CH4排放通量变化过程(a)及累计排放量(b)Fig.3 CH4 emission process (a) and cumulative emission (b)

与无绿肥添加处理(DW-0)相比, 添加绿肥后CH₄累计排放量有显著差异(p<0.05), G+DW-0、 G+DW-5、 G+DW-10处理分别升高了49.29%、 25.72%、 47.42%[图3(b)]。 添加绿肥后不同水分管理下以G+DW-0处理CH₄累计排放量最高, 达19.95 μ g· kg^-2, 而G+DW-10处另次之, 为18.75 μ g· kg^-2, G+DW-5处理CH₄累计排放量最低, 为15.62 μ g· kg^-2。 与G+DW-0处理相比, G+DW-5处理的CH₄累计排放量显著降低(p<0.05), 降幅为21.70%, 而G+DW-10处理降幅仅为6.02%。 可见, 在紫云英还田的条件下, CH₄累计排放量并不随着干耕时间的延长而降低, 相反, 干耕时间过长会增加CH₄排放量。 分析认为, 紫云英还田后为产甲烷古菌等提供了大量C源底物, 促进了CH₄排放^[12]。 而短期干耕晒田可以使微生物提前分解利用大部分易降解的有机质^[13], 有效降低了CH₄等温室气体前期排放峰值。

2.3.1 荧光组分解析

对试验中土壤DOM溶液的3DEEM进行PARAFAC分析, 解析出3个荧光组分, 通过拆半检验分析、 残差分析, 验证了PARAFAC模型的有效性, 荧光光谱图和载荷图如图4(左A和右B)和表4所示。

图4

Fig.4

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图4 PARAFAC解析土壤DOM荧光组分(A)及激发发射波长(B)位置 左(A): PARAFAC解析土壤DOM荧光组分; 右(B): 组分对应的载荷验证结果, 左峰: 激发波长载荷谱, 右峰: 发射波长载荷谱Fig.4 Fluorescent components in DOM (A) and their excitation and emission wavelength (B) positions resolved by PARAFAC Left(A): Fluorescent components in DOM resolved by PARAFAC; Right(B): The split-half verification results corresponding to the component , excitation (left) and emission (right)

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 DOM荧光组分的特征的特征及来源分析 Table 4 Characteristics and sources analysis of fluorescence components of soil DOM 组分 激发/发射波长/nm 性质描述 主要来源 同类研究比较 C1 230/408 类腐殖质(富里酸) 自生源类, 生物降解 220, 320/400[14]; 240, 310/410[18] C2 255, 365/450 类腐殖质(腐殖酸) 陆生植物和土壤有机质 245, 350/475[14]; 270, 335/455[15] C3 225, 275/326 类蛋白质(色氨酸) 自生源类, 生物代谢 225, 275/300[18]; 215, 275/365[17]

表4 DOM荧光组分的特征的特征及来源分析 Table 4 Characteristics and sources analysis of fluorescence components of soil DOM

将得到的组分数据于openFluor数据库中进行比对, 其中组分1(C1)荧光峰位于激发波长(λ _Ex)/发射波长(λ _Em)=230 nm/408 nm, 归属为陆地类腐殖质成分, 主要以富里酸类物质为主^{[12, 15]}。 主要来源是陆生性有机物的输入, 在河流、 淡水湖泊以及沿海水域多有发现, 一般定义为M峰。 组分2(C2)存在两个相同激发波长的荧光峰, 主峰在λ _Ex/λ _Em=255 nm/450 nm, 次级峰λ _Ex/λ _Em=365 nm/450 nm, 归属为陆地类腐殖质成分, 主要以腐殖酸类物质为主^[12]。 其光谱学特性类似于传统A/C峰组分的类腐殖质, 芳香化程度较高, 普遍存在于沿海地区的低盐分海水中, 主要来来源于微生物性和陆生性有机物。 组分3(C3)存在两个相同激发波长的荧光峰, 主峰在λ _Ex/λ _Em=225 nm/326 nm, 次级峰λ _Ex/λ _Em=275 nm/326nm, 主要以色氨酸类物质为主^[15], 为游离或结合在蛋白质中的内源性氨基酸, 主要来源是原位微生物和浮游植物的生命代谢活动, 也有一部分外源输入的微生物, 一般被定义为T峰。

2.3.2 荧光组分的相对含量

通过计算土壤DOM溶液3种荧光组分的占比, 可以得到不同组分的荧光强度贡献率(图5)。 常规水分管理(DW-0)的类富里酸(C1)、 类色氨酸(C3)组分是土壤DOM的主要贡献者, 相对丰度分别为53%、 30%, 而类腐殖酸(C2)组分的相对丰度仅有18%。 与DW-0相比, 添加绿肥后C2组分相对丰度明显增加, G+DW-0、 G+DW-5、 G+DW-10处理分别升高了19%、 17%、 16%。 添加绿肥后, 土壤DOM的类腐殖质组分(C1+C2)的相对丰度达76.74%, 在干耕5天时达最大, 为79.88%。 由此可见, 紫云英还田后土壤DOM以类腐殖质组分为主。 基于Bray-Curtis距离的限制性主成分分析表明(图6), 不同处理下土壤DOM组成明显不同。 不同水分管理下土壤DOM组分分异明显, 主要在第二主轴上分离。

图5

Fig.5

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	图5 土壤DOM荧光区域积分相对丰度Fig.5 Relative proportion of fluorescence regional integration of soil DOM

图6

Fig.6

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	图6 荧光性质主坐标轴分析Fig.6 Principal coordinate axis analysis of fluorescent property

以荧光指数(FI)、 腐殖化指数(HIX)、 自生源指数(BIX)作为指示土壤DOM来源和特征的重要参数指标, 能够比较全面地反映DOM组分的物质来源和腐殖化程度。 当FI<1.4时, DOM被认为主要源于陆生有机物质的输入, 当FI>1.90时, DOM有明显的自生源特性, 主要是内源微生物分解产生。 由图3可知, 本研究的FI值在1.90~1.94之间, 表明各处理下DOM主要来源于微生物代谢, 分子芳香化程度较弱。 HIX可用于表征DOM的腐殖化程度, 其值越高表明DOM腐殖化程度越高。 G+DW-5处理的HIX最高(5.11), 表明G+DW-5处理下土壤DOM腐殖化程度较高。 分析认为绿肥在腐解初期产生的小分子DOM化合物可被微生物迅速吸收利用, 造成难降解DOM化合物积累。 短期干耕可加速紫云英腐解, 有利于土壤腐殖化进程。 而G+DW-10处理的HIX为3.68, 呈现弱腐殖化特征, 新近自生源较多, 可归因于土壤长期干耕, 微生物活性降低所致。 BIX可用于表征DOM的自生源贡献率^[15], 同时也可代表生物可利用的高低。 当BIX<0.80时, 自生源特征不显著; 0.80<BIX<1.00时, 具有较强的自生源特征。 DW-0处理中土壤DOM自生源指标为0.96(图7), 表明未添加绿肥的土壤DOM自生源特征较强。 G+DW-0、 G+DW-5、 G+DW-10三个处理土壤DOM自生源指标均低于0.80, 三个处理间无显著差异, 自生源特征不显著, 表明土壤DOM主要来自于外源植物的输入。

图7

Fig.7

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	图7 土壤DOM荧光光谱参数Fig.7 Fluorescence parameters of soil DOM

相关性分析表明(图8), C1组分与CH₄排放量呈显著负相关(p<0.05), 相比于类腐殖质, 类富里酸属于土壤DOM中更加稳定的物质, 因此DW-0、 G+DW-5处理中C1组分所占比例较大, 与之相对应的CH₄排放量更小。 C2组分与CH₄排放量呈显著正相关(p<0.05), 表明随着稻田土壤DOM中类腐殖质组分的增加, CH₄排放通量显著增加。 经过5天短期干耕, 土壤DOM中的C2组分相对丰度降低, CH₄排放量也随之降低。 与之前一项关于浅水湖泊温室气体释放的研究结果一致^[15], 即陆源类腐殖质是影响CH₄排放的重要因素。 HIX指数与CH₄排放量也呈显著负相关(p<0.001)。 研究表明, G+DW-5处理HIX数值最高, 表明DOM腐殖化程度最高, 在环境中存在的时间最久^[16]。 这也表明通过短期干耕可增加土壤DOM腐殖化程度, 从而提升土壤DOM稳定性, 导致CH₄排放量降低。 与之相反, BIX指数与CH₄排放呈显著正相关(p<0.05)。

图8

Fig.8

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	图8 土壤DOM荧光性质与CH4累计量的相关性Fig.8 Correlations between fluorescent property of soil DOM and CH4 cumulative emission