三种氨基酸经DFT进行优化, 结构如图2所示, 结构优化后的理论键长和键角与实验值^{[50, 51, 52, 53]}在表1— 表4中给出。 计算了均方根偏差(RMSD), 键长值为0.012 8~0.035 4 Å , 最大键角为5.231 6° , 结果表明理论结构与实验值吻合。 三种氨基酸都是极性α -氨基酸。 谷氨酸被用作必要氨基酸的重要来源, 含有两个羧基(— COOH)一个氨基(— NH₂), 在三种氨基酸中拥有最多碳原子, 两个亚甲基(— CH₂)和一个次甲基(— CH); 半胱氨酸有助于减少黑色素的生成, 除了— COOH和— NH₂外还有一个巯基(— SH), 此外比谷氨酸少一个— CH₂; 甘氨酸在中枢神经系统中起着递质的作用, 分子链最短, 除— COOH和— NH₂外只有一个— CH₂; 谷胱甘肽可作抗氧化剂, 在组成谷胱甘肽时, 半胱氨酸的— NH₂和谷氨酸未与α 碳原子相连的— COOH脱去一分子H₂O形成酰胺键(肽键), — COOH与甘氨酸的— NH₂以同样的方式脱水缩合, 肽键将三种氨基酸连接起来。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸和谷胱甘肽采用DFT优化的结构图 青色为碳, 红色为氧, 蓝色为氮, 白色为氢Fig.2 Optimized structures of glutamate, cysteine, glycine, and glutathione using DFT

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 谷氨酸的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 1 NIR spectral bands and main group vibration modes of glutamic acid Band number Wavenumber/cm-1 Band assignment Calc Exp 1 7 035 6 500~7 100 吸收带 2ν OH 2 6 734 2ν asNH2 3 6 588 [ν sNH2, ν asNH2]+2ν sNH2 4 5 874 5 943 2ν asCH2 5 5 800 5 905 [ν sCH2, ν asCH2]+2ν CH 6 5 640 5 795 2ν sCH2 7 5 410 5 000~5 500 吸收带 ν C=O+ν OH 8 5 343 2ν CH 9 5 024 δ scissoringNH2+ν asNH2 10 4 841 [δ twistNH2, δ CHO, δ waggCH]+ν OH 11 4 712 4 735吸收带 [δ twistCH2, δ waggOH, δ waggCH]+ν OH 12 4 633 [δ twistCH2, δ waggOH, δ waggCH]+ν sNH2 注: ν 为伸缩振动, ν a为对称伸缩振动, ν as为反对称伸缩振动, δ 为弯曲振动, δ scissoring为剪切变形振动, δ twist为卷曲变形振动, δ wagg为非平面摇摆变形振动 Note: ν is the stretching vibration, ν a is the symmetric stretching vibration, ν as is the antisymmetric stretching vibration, δ is the bending vibration, δ scissoring is the shear deformation vibration, δ twist is the coiling deformation vibration, δ wagg is the non-plane rocking deformation vibration

表1 谷氨酸的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 1 NIR spectral bands and main group vibration modes of glutamic acid

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 半胱氨酸的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 2 NIR spectral bands and major group vibration modes of cysteine Band number Wavenumber/cm-1 Band assignment Calc Exp 1 7 015 6 500~7 300 吸收带 2ν OH 2 6 702 2ν asNH2 3 6 578 [ν sNH2, ν asNH2]+2ν sNH2 4 5 859 5 966 2ν asCH2 5 5 782 5 832 [ν sCH2, ν CH, ν asCH2]+2ν asCH2+2ν CH 6 5 630 5 546 2ν sCH2 7 5 393 5 383 ν C=O+ν OH 8 4 996 5 004 [δ scissoringNH2, ν asNH2]+2ν SH 9 4 832 4 769 [δ CHO, δ waggCH2]+[δ NHO, ν asNH2]+ν OH 10 4 687 吸收带 δ NHO+ν sNH2+δ twistCH2+ν OH 11 4 633 4 533 [δ twistCH2, δ waggOH, δ waggCH ]+ν sNH2

表2 半胱氨酸的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 2 NIR spectral bands and major group vibration modes of cysteine

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 甘氨酸的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 3 NIR spectral bands and main group vibration modes of glycine Band number Wavenumber/cm-1 Band assignment Calc Exp 1 7 008 6 500~7 100 吸收带 2ν OH 2 6 747 2ν asNH2 3 6 651 ν sNH2, ν asNH2 4 6 578 2ν asNH2 5 5 653 5 906 ν sCH2+ν asCH2 6 5 494 5 792 2ν asCH2+2ν sCH2 7 5 011 5 000~5 500 吸收带 δ scissoringNH2+ν asNH2 8 4 935 δ scissoringNH2+ν sNH2 9 4 829 4 731 吸收带 [δ twistNH2, δ CHO]+ν OH 10 4 696 [δ waggCH2, δ rockNH2, δ waggCH2]+ν OH 11 4 613 [δ waggCH2, δ rockNH2]+ν asNH2

表3 甘氨酸的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 3 NIR spectral bands and main group vibration modes of glycine

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 谷胱甘肽的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 4 NIR spectral bands and major group vibration modes of glutathione Band number Wavenumber/cm-1 Band assignment Calc Exp 1 6 939 6 500~7 100 吸收带 2ν OH 2 6 901 2ν OH 3 6 797 2ν NH+2ν asNH2 4 6 634 2ν NH+2ν sNH2+[ν sNH2, ν asNH2] 5 5 888 5 500~6 000 吸收带 2ν asCH2+[ν asCH2, ν sCH2] 6 5 792 2ν sCH2+ν CH 7 5 731 2ν asCH2 8 5 625 2ν CH 9 5 371 5 415 吸收带 2ν CH 10 5 333 ν C=O+ν OH 11 5 304 $\left[\nu \mathrm{C}=\mathrm{O}, \delta_{\text {scissoring }} \mathrm{NH}_{2}\right]+\nu \mathrm{OH}$ 12 4 982 4 913 吸收带 δ scissoringNH2+ν asNH2 13 4 854 ν CN+ν NH 14 4 667 4 605 吸收带 δ twistCH2+ν NH 15 4 589 δ twistNH2+ν NH

表4 谷胱甘肽的近红外光谱谱带及主要基团振动模式 Table 4 NIR spectral bands and major group vibration modes of glutathione

由图3所示可将三种氨基酸和谷胱甘肽的实验与理论计算近红外光谱图按照振动形式大致划分为三个光谱区: (1) 7 300~6 500 cm^-1范围, 为O— H伸缩振动一级倍频及NH、 NH₂基团的伸缩振动一级倍频与合频; 在该区域内可以看出, 实验结果为一很宽的振动谱带(6 500~7 100 cm^-1区间), 理论计算是在理想条件下进行的且每个振动模式通常被认为是独立的。 理论计算结果呈现出多个振动峰, 而实验中由于仪器检测器分辨率问题和不同振动模式的相互作用及耦合导致一个很宽振动谱带。 (2) 6 000~5 300 cm^-1范围, 主要是CH、 CH₂振动的合频吸收带, 振动模式相对简单, 没有产生宽吸收带; (3) 5 200~4 600 cm^-1范围, 主要是NH₂不同振动模式的合频、 NH₂、 OH、 CH等振动模式的合频导致振动图谱图谱复杂, 振动峰重叠严重, 也形成了一个宽的吸收带(4 700 cm^-1附近); 实验结果不能体现出每个振动情况。 四种物质的NIR实验中可以看出在5 280 cm^-1附近有一个很强的吸收峰, 该位置的振动是由分子间的相互作用引起的, 理论计算模型中是没有考虑分子间的相互作用的。 半胱氨酸在此范围还有SH伸缩振动的一级倍频吸收峰。 下面以这三个光谱区分析氨基酸和肽的NIR光谱, 讨论氨基酸及合成肽后结构的差异对NIR光谱的影响。

图3

Fig.3

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	图3 谷氨酸(a)、 半胱氨酸(b)、 甘氨酸(c)和谷胱甘肽(d)的近红外光谱图Fig.3 NIR spectra of (a) glutamic acid (b) cysteine (c) glycine and (d) glutathione

由谷氨酸的近红外光谱[图3(a), 表1], 可以发现光谱区1中, 两个O— H伸缩振动的叠加使得7 085~6 984 cm^-1范围出现了一个强度最高的O— H伸缩振动的一级倍频吸收峰, 最高峰位置在7 035 cm^-1; 6 760~6 540 cm^-1是NH₂的振动吸收带, NH₂非对称伸缩振动的一级倍频和NH₂伸缩振动的合频为该区域内的主要贡献模式。 光谱区2中6 000~5 300 cm^-1由于CH₂和CH伸缩振动模式的出现, 谱峰明显变宽, CH₂伸缩振动合频吸收峰与CH一级倍频吸收峰在5 800 cm^-1; 在5 410 cm^-1处有较弱的C=O与O— H基团伸缩振动的合频吸收峰, 与CH伸缩振动的一级倍频峰(5 343 cm^-1)展宽后重叠。 光谱区3中, 5 024 cm^-1处的尖峰是NH₂剪式振动与非对称伸缩振动的二元合频吸收峰, 峰形窄, 峰位置相对独立; 4 874~4 600 cm^-1范围的图谱是OH伸缩振动和CH₂、 NH₂伸缩与变形(剪式、 扭曲、 摇摆)的合频, 因此靠近中红外范围, 是最复杂的一段区域。

半胱氨酸近红外光谱[图3(b), 表2]在第一、 第二个光谱区的各峰位置与强度(OH振动的一级倍频峰除外)与谷氨酸相似, OH振动的一级倍频峰为7 015 cm^-1处的中等强度峰; 但由于CH₂基团的减少, 在5 500~5 300 cm^-1范围只有C=O与OH伸缩振动的单独弱峰。 在低波数范围的第三光谱区, 4 996 cm^-1左右有NH₂伸缩振动与剪式振动的合频吸收峰, 同时还有SH伸缩振动一级倍频峰的贡献, 但是贡献极小, 后面不讨论— SH基团对近红外光谱的影响; 在此范围的合频振动吸收峰也受到CH₂基团减少的影响而分离得更好。

甘氨酸近红外光谱[图3(c), 表3]在光谱区1中的O— H伸缩振动一级倍频峰与半胱氨酸在强度及频率上相似度高; 6 578和6 747 cm^-1处由于NH₂对称伸缩和反对称伸缩振动的一级倍频吸收峰与NH₂合频吸收峰相互独立, 因此出现了三个互相独立的特征吸收峰。 甘氨酸分子中只含有一个— CH₂基团, 光谱区2中特征吸收峰主要来源于CH₂伸缩振动的合频。 光谱区3中在5 100~4 900 cm^-1范围的NH₂伸缩振动与剪式振动合频峰依旧存在; 4 900~4 600 cm^-1出现了大量主要由NH₂与CH₂以及OH引起的合频振动, 振动模式复杂, 实验所得光谱呈现一个很宽的吸收带。

谷胱甘肽的近红外光谱[图3(d), 表4]吸收峰普遍比氨基酸强度更高。 光谱区1中, 两个O— H伸缩振动一级倍频的频率相差38 cm^-1, 因此在6 920 cm^-1左右出现双峰; 谷胱甘肽的NH与NH₂合频吸收峰模式与谷氨酸、 半胱氨酸相似, 但在6 797 cm^-1处NH与NH₂的一级倍频峰相差波数较小, 此处出现的是一个峰形较宽的肩峰。 光谱区2与氨基酸差别较大, 氨基酸在此范围几乎被合频模式占据, 而谷胱甘肽在5 731、 5 625和5 371 cm^-1处存在CH₂与CH的一级倍频吸收峰。 光谱区3中, 三种氨基酸脱水缩合组成的谷胱甘肽拥有最多的— CH₂基团, 导致CH₂与NH₂的合频数量大幅度增加, 实验中可以看到一个较宽吸收带。

2.2.1 7 300~6 500 cm^-1区域内非谐振动光谱

在近红外光谱(图4)中, 7 000 cm^-1左右出现的O— H伸缩振动一级倍频吸收峰强度最高, 且与其他吸收峰分离较好。 半胱氨酸和甘氨酸的O— H伸缩振动一级倍频吸收峰强度相差不大, 而谷氨酸在此处的O— H伸缩振动特征峰强度大于其他两个氨基酸, 且约为另外两种氨基酸O— H吸收峰强度的二倍, 振动强度出现较大差异的主要原因是由于谷氨酸的组成基团中相较于另外两种氨基酸多一个羧基, 谷氨酸上两个羧基的O— H振动叠加导致振动增强; 三种氨基酸的O— H伸缩一级倍频峰频率很相近, 所以此处的峰可以作为鉴定分子中是否含有羧基或羟基的结构标记, 其吸收峰强度与分子中含有O— H键的基团数量可能存在(正相关)关系。

图4

Fig.4

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	图4 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽7 300~6 500 cm-1范围计算近红外光谱图Fig.4 Calculated NIR spectra of glutamate, cysteine, glycine, and glutathione in the range of 7 300~6 500 cm-1

不同分子的键长(表5)、 键级(表6)、 原子电荷差异会影响同一振动模式在NIR光谱上的振动频率, 各种因素对振动模式的影响程度不同。 谷胱甘肽的O— H伸缩振动的一级倍频峰与三种氨基酸相比存在明显红移现象。 通过分析发现, 键长是影响O— H特征吸收峰的频率的主要因素。 键长与吸收峰波数存在明显线性关系。 我们通过比较计算数据中的三种氨基酸和肽的O— H键长验证了这一关系, 结果如表5所示, 键长由小到大排列为: 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽, 这与图3中O— H伸缩振动特征吸收峰的位置由高波数到低波数很好地对应。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽的O— H键长 Table 5 O— H bond length of glutamic acid, cysteine, glycine, and glutathione Molecule Bond length glutamic acid cysteine glycine glutathione OH 0.965 85 0.965 77 0.966 15 0.966 27 0.970 37 0.970 30

表5 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽的O— H键长 Table 5 O— H bond length of glutamic acid, cysteine, glycine, and glutathione

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽的O— H键级 Table 6 O— H bond order of glutamic acid, cysteine, glycine, glutathione Molecule Bond orders glutamic acid cysteine glycine glutathione OH 0.878 230 25 0.879 088 10 0.876 726 74 0.877 939 38 0.857 632 68 0.859 612 34

表6 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽的O— H键级 Table 6 O— H bond order of glutamic acid, cysteine, glycine, glutathione

6 800~6 500 cm^-1范围内的吸收峰主要是三种氨基酸关于NH₂对称伸缩振动的一级倍频、 非对称伸缩振动的一级倍频、 对称伸缩振动和非对称伸缩振动二者组成的合频。 三种氨基酸在该范围内的吸收峰位置相似, 但结构的不同使得其峰形及振动频率存在一定差异, 甘氨酸在此范围内的吸收峰与另外两个氨基酸相比差异极为明显。 三种氨基酸在6 730 cm^-1处的NH₂非对称伸缩的一级倍频峰频率与强度相差不大; 在6 600 cm^-1处谷氨酸与半胱氨酸的NH₂的合频峰都与NH₂对称伸缩的一级倍频峰重合, 甘氨酸的合频峰与NH₂对称伸缩的一级倍频峰展宽后并未重叠, 而是相互分离形成了两个吸收峰。 甘氨酸的合频峰产生了蓝移现象, 主要的原因可能为甘氨酸结构中的氨基产生了共轭效应, 导致振动峰位发生了移动。 通过计算三种氨基酸的分子前线轨道并观察验证了这一点。 观察三种氨基酸的HOMO轨道图(图5), 发现甘氨酸的NH₂上形成了π 型共轭轨道使其发生了共轭效应。 而谷胱甘肽由于氨基酸的— COOH与— NH₂脱水缩合形成了酰胺键影响了氨基的振动模式, 在其NIR光谱中出现了N— H伸缩振动的一级倍频峰。

图5

Fig.5

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	图5 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸的HOMO轨道图Fig.5 HOMO orbital diagrams of glutamate, cysteine, and glycine

2.2.2 6 000~5 300 cm^-1区域内非谐振动光谱

在此范围主要是C— H键的近红外吸收, 含有丰富的结构信息, 展宽后重叠程度明显更高。 甘氨酸在此范围依旧与谷氨酸和半胱氨酸有较大差异, 其吸收峰不仅数量较少且强度差异也较为明显, 推测与C— H键的数目有关。 甘氨酸分子中只有一个CH₂, 单个CH₂基团各种模式的振动峰展宽后重显著重叠, 因此振动峰最少。 这种差异同样体现在了谷氨酸与半胱氨酸中。 这两个氨基酸中都含有CH₂与CH, 各峰振动模式、 频率及强度都有很高的相似度, 但谷氨酸的CH₂数量比半胱氨酸多, 所以在5 343 cm^-1处多一个振动吸收峰。 谷胱甘肽的NIR光谱在该范围内的吸收峰可能是受到肽键影响, CH₂与CH振动合频峰与氨基酸的同类吸收峰相比强度更高, 且5 750~5 350 cm^-1范围都是CH₂或CH振动的一级倍频单峰, 谷胱甘肽与氨基酸相比在这一范围内的各吸收峰分离程度更高, 更容易进行分辨。

图6

Fig.6

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	图6 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽6 000~5300 cm-1范围计算近红外光谱图Fig.6 Calculated NIR spectra of glutamate, cysteine, glycine, and glutathione in the range of 6 000~5 300 cm-1

三种氨基酸在5 400 cm^-1左右都存在C=O与O— H伸缩振动的合频峰, 此峰可以很好地被用来识别分子的组成基团中是否存在羧基, 在探究饱和与不饱和短链^[31]、 中链^[41]、 长链脂肪酸^[54]的近红外光谱中都有此峰出现。 近红外光谱主要反映含氢基团的振动信息, C=O振动峰的特殊性让人们对其表现出极大的研究兴趣。 谷氨酸由于有两个羧基, 此处合频峰强度也高于另外两个氨基酸, 这一现象同样也证明了某一吸收峰的强度与分子中含有相应基团的数量存在(正相关)关系。 谷胱甘肽的C=O与OH伸缩振动的合频峰位置在5 333 cm^-1处, 与氨基酸的同类振动峰相比有红移现象, 且强度更高, 这或许表明分子的C=O与O— H伸缩振动合频峰对氨基酸和肽的结构差异敏感。

2.2.3 5 200~4 600 cm^-1区域内非谐振动光谱

三种氨基酸和肽在此区域由于有较多的C— H和N— H二元合频峰导致了强烈的吸收峰展宽后重叠(图7)。 采用RDG方法分析并可视化研究对象分子内的弱相互作用。 5 000 cm^-1左右的峰由NH₂振动产生, 根据绘制出的氨基酸与肽的弱相互作用图(图8), 图中原子间等值面的不同颜色代表了不同弱相互作用, 蓝色代表氢键强卤键等; 绿色代表范德华力; 红色代表较强位阻效应, 颜色越深弱相互作用越强。 明显观察到羧基的双键氧会与相邻原子间产生弱相互作用而改变吸收峰的位置; 不仅此处NH₂振动峰受到影响, 在4 840 cm^-1左右NH₂与CHO基团振动的合频为该范围吸收峰的主要贡献模式, 其强度与频率也因此产生了一定差异。 甘氨酸与另外的三种分子相比, 在此范围总体振动峰的数目更多, 大多是CH₂和NH₂的合频吸收峰, 这与上述的由于CH₂数目少而吸收峰少的结论正好相反, 推测是由于— NH₂与— CH₂连接在同一个C原子上, 基团空间位置更加靠近导致的。

图7

Fig.7

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	图7 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽5 200~4 600 cm-1范围计算近红外光谱图Fig.7 Calculated NIR spectra of glutamate, cysteine, glycine, and glutathione in the range of 5 200~4 600 cm-1

图8

Fig.8

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	图8 谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸、 谷胱甘肽的弱相互作用图Fig.8 Weak interaction diagrams of glutamate, cysteine, glycine, and glutathione