LS55荧光分光光度计(美国Perkin Elmer 公司)。

多杀菌素(C₄₂H₇₁NO₉, 美国陶氏益农公司); 高效氟氯氰菊酯(C₂₃H₁₉ClF₃NO₃, 山东中新科农生物科技有限公司); 宁南霉素(C₁₆H₂₅O₈N₇, 德强生物股份有限公司); 纯净水。

首先制备初始溶液, 多杀菌素取0.1 mL充分溶解在纯净水中, 得到0.029 99 mg· mL^-1的多杀菌素溶液; 高效氟氯氰菊酯取0.1 mL充分溶解在纯净水中, 得到0.149 7 mg· mL^-1的高效氟氯氰菊酯溶液; 宁南霉素取0.2 mL充分溶解在纯净水中, 得到浓度为0.634 9 mg· mL^-1的宁南霉素溶液。 然后将多杀菌素与高效氟氯氰菊酯溶液按照不同比例进行混合, 得到不同浓度的多杀菌素-高效氟氯氰菊酯混合样本共15组; 将多杀菌素与宁南霉素溶液按照不同比例进行混合, 得到不同浓度的多杀菌素-宁南霉素混合样本共18组。 具体配制浓度如表1、 表2所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 多杀菌素-高效氟氯氰菊酯混合样本浓度(mg· mL-1) Table 1 Concentration of mixed samples of spinosad and lambda-cyhalothrin (mg· mL-1) 样本 高效氟氯氰 菊酯 多杀菌素 样本 高效氟氯氰 菊酯 多杀菌素 1 0.138 6 0.002 956 9 0.136 1 0.003 627 2 0.124 8 0.006 651 10 0.144 0 0.001 524 3 0.113 5 0.009 676 11 0.133 7 0.004 275 4 0.141 2 0.001 534 12 0.120 8 0.007 724 5 0.131 3 0.004 900 13 0.129 0 0.005 504 6 0.117 0 0.008 731 14 0.118 9 0.008 235 7 0.126 9 0.006 087 15 0.122 7 0.007 187 8 0.115 2 0.009 210

表1 多杀菌素-高效氟氯氰菊酯混合样本浓度(mg· mL-1) Table 1 Concentration of mixed samples of spinosad and lambda-cyhalothrin (mg· mL-1)

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 多杀菌素-宁南霉素混合样本浓度(mg· mL-1) Table 2 Concentration of mixed samples of spinosad and ningnanmycin (mg· mL-1) 样本 多杀菌素 宁南霉素 样本 多杀菌素 宁南霉素 1 0.017 86 0.274 9 10 0.010 85 0.362 0 2 0.003 010 0.481 9 11 0.015 32 0.306 5 3 0.006 279 0.418 8 12 0.007 955 0.398 0 4 0.013 27 0.332 0 13 0.014 33 0.318 7 5 0.009 472 0.379 1 14 0.003 506 0.467 8 6 0.002 483 0.496 9 15 0.003 975 0.454 5 7 0.001 281 0.512 8 16 0.017 07 0.284 7 8 0.016 230 0.295 2 17 0.018 59 0.265 8 9 0.012 11 0.346 3 18 0.004 417 0.442 0

表2 多杀菌素-宁南霉素混合样本浓度(mg· mL-1) Table 2 Concentration of mixed samples of spinosad and ningnanmycin (mg· mL-1)

将被测溶液样品放入比色皿至3/4处, 设置LS55荧光光度计发射波长范围200~600 nm, 每0.5 nm采集一个数据点, 狭缝宽度8 nm, 扫描速度1 500 nm· min^-1。 其中多杀菌素-高效氟氯氰菊酯混合样本对应的起始激发波长为250 nm, 每间隔8 nm扫描一次, 共扫描10次; 多杀菌素-宁南霉素混合样本对应的起始激发波长为260 nm, 每间隔10 nm扫描一次, 共扫描12次, 实验在常温下进行。 保存实验数据, 经过光谱预处理后再建立平行因子分析模型。

平行因子分析法是化学计量学发展进程提出的三线性成分模型, 也是二阶校正算法中最为经典的一种^[18]。 二阶校正方法本质上是将三维数据矩阵简化为二维矩阵, 可以有效地分离复杂混合物系统中的组分类别。 常见的二阶校正方法主要包括平行因子分析、 交替三线性分解、 交替惩罚三线性分解、 自加权交替三线性分解、 交替残差三线性等^[19]。 目前, 平行因子分析法方法在环境科学、 分析化学、 生命科学以及食品科学等领域应用非常广泛。 利用平行因子分析法对样品监测和检测过程中获取的或组合而成的立方阵响应数据进行信息解析, 可以对样品中物质组分以及组分类型进行有效识别。 平行因子算法(parallel factor, PARAFAC)基于交替最小二乘原理, 将三维荧光矩阵X分解为3个载荷矩阵A、 B、 C, 且三个载荷矩阵具有清晰的物理意义。

PARAFAC法基本原理及公式如式(1)^[20]

xijk=∑n=1Nainbjnckn+eijki=1, 2, …, I; j=1, 2, …, J; k=1, 2, …, K(1)

式(1)中, x_ijk为成分数或因子数为N的三相三线性数据矩阵即立方阵X(I× J× K)的组成元素, 其中K为样本个数, I、 J分别为发射波长和激发波长数目; a_in, b_jn, c_kn分别为大小为I× N, J× N, K× N具有清晰物理意义的成分矩阵A, B, C的元素。 在本三维荧光光谱的平行因子分析中, 矩阵A为相对激发光谱矩阵, 表示激发波长与相对荧光强度之间的信息; 矩阵B为相对发射光谱矩阵, 表示发射波长与相对荧光强度之间的信息; 矩阵C为相对浓度矩阵, 表示样本与荧光峰的相对荧光强度(与浓度有关)的信息。

a_in为相对激发矩阵A(I× N)中的元素, 表示第n个因子数在第i个激发波长处的荧光强度; b_jn是相对发射矩阵B(J× N)中的元素, 表示第n个因子数在第j个发射波长处的荧光强度; c_kn是相对浓度矩阵C(K× N)中的元素, 表示第k个样本中第n个因子数相对浓度值; e_ijk为残差立方阵E(I× J× K)的组成元素。 N为正确拟合三线性模型所需要的因子数, 在成分分解研究中代表成分数。

平行因子方法基于Matlab软件平台实现, 并使用了工具箱DOMFlour和drEEM的部分功能, 其中drEEM用于数据前期的整理和预处理, DOMFlour用于后续的平行因子建模分析和数据导出。 在进行平行因子建模之前, 首先将导入的原始数据整理成符合三线性模型的立方矩阵形式, 并进行数据的预处理。 在平行因子建模分析中, 数据的预处理尤为重要, 尤其是瑞丽散射峰和拉曼散射峰的干扰, 因为平行因子分析其中重要的一步是组分数N的确定, 而这些散射峰的存在, 会使模型将其误认为混合体系中的组分, 从而得到错误的组分数量, 对后续进一步的建模分析产生很大的干扰。

完成数据预处理工作, 进入建模分析的环节后, 第一步便是确定组分数N。 平行因子的组分数N只与数据样本的内在信息有关, 与样本的数量、 荧光特征点数据量的大小无关。 组分数N的估计既不能太大也不能太小, 太小会导致分解出的组分信息没有实际的意义, 太大会导致模型过拟合或者分解的结果出现错误。 因此, 需要预先设置不同的组分数进行平行因子计算, 再通过对计算结果的分析对比从而得到正确的组分数N。 确定组分数N后, 进行后续的建模分析, 分解得到各个组分的光谱特征信息和相对荧光强度, 最终导出模型结果, 并与实际样本进行对比, 验证模型的可行性和准确性。 整体分析流程如图1所示。

图1

Fig.1

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	图1 平行因子方法建模分析流程Fig.1 Modeling and analysis process of PARAFAC

采用LS55荧光光度计扫描所有混合样本的三维荧光光谱, 将获得的两种混合体系的三维荧光光谱进行预处理后对应的结果分别如图2、 图3所示, 可以看出多杀菌素与高效氟氯氰菊酯的光谱堆叠现象较为严重, 如果不采用二阶校正法对光谱进行分解, 很难通过其他方法做出较为精确的定性和定量分析。 多杀菌素与宁南霉素的荧光特征峰同样存在着一定程度的堆叠, 为了对其组分进行较为准确的定性定量分析, 采用平行因子方法实现对混合光谱的解谱分析及各组分的含量预测建模。

图2

Fig.2

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	图2 多杀菌素-高效氟氯氰菊酯混合体系三维荧光光谱Fig.2 Three-dimensional fluorescence of spinosad and lambda-cyhalothrin mixture

图3

Fig.3

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	图3 多杀菌素-宁南霉素混合体系三维荧光光谱Fig.3 Three-dimensional fluorescence of spinosad and ningnanmycin mixture

将15个多杀菌素-高效氟氯氰菊酯混合样本的三维荧光光谱数据构建成数据矩阵X(15× 501× 10), 以及18个多杀菌素-宁南霉素混合样本的三维荧光光谱数据构建成数据矩阵X(18× 501× 10), 分别用平行因子法对其进行组分分解。 首先假设组分数N为2、 3、 4, 分别运行平行因子模型, 图4所示为两种混合物组分数N=2、 3、 4时的杠杆率, 杠杆率反映样本的离群程度; 当杠杆率大于0.3时, 表明该样本离群程度较高, 需要考虑去除; 如果出现某些样本的杠杆率与其他样本差异很大, 可视为极端样本, 同样考虑去除。 图中当组分数N=2时, 所有样本杠杆率均小于0.3, 离群程度较低; 当组分数N=3和4时, 出现多个样本杠杆率大于0.3, 离群程度较为严重。 因此确定组分数N均为2, 与实际情况相符合。

图4

Fig.4

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	图4 混合样本在不同组分数下的杠杆率(从上至下组分数N分别为2, 3, 4) (a): 多杀菌素-高效氟氯氰菊酯; (b): 多杀菌素-宁南霉素Fig.4 Leverage under different components of mixture sample (component N from top to bottom is 2, 3, 4, respectively) (a): Spinosad and lambda-cyhalothrin mixture; (b): Spinosad and ningnanmycin mixture

将组分数N设置为2, 进行后续的平行因子建模分析, 可成功对混合荧光数据完成分解, 导出混合物分解后的激发和发射光谱数据, 将光谱数据绘制成图像并与预先测量得到的单一组分真实光谱进行对比。 多杀菌素-高效氟氯氰菊酯对比的结果如图5(a, b)所示, 由图可知多杀菌素真实样本荧光峰所对应的激发波长为282 nm, 发射波长为350 nm; 高效氟氯氰菊酯真实样本荧光峰所对应的激发波长为274 nm, 发射波长为307 nm。 预测结果中荧光峰处的光谱波形与真实光谱近似吻合, 说明平行因子法结合三维荧光光谱可以有效地对多杀菌素-高效氟氯氰菊酯混合体系进行定性分析。 图中预测结果距离荧光特征峰较远处的光谱波形与真实光谱相差较大, 分析认为这些波段恰好位于瑞丽散射带附近, 该混合体系的瑞丽散射峰强度高, 且散射带范围很宽, 尽管通过Delaunay插值法去除了散射, 但仍然对光谱预测产生了一定影响。 总体这些波段并不影响预测结果中荧光特征峰所对应的位置。

图5

Fig.5

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	图5 多杀菌素-高效氟氯氰菊酯平行因子预测结果与真实样本光谱对比 (a): 激发光谱; (b): 发射光谱Fig.5 Comparison between the predicted results of PARAFAC and the real spectra of spinosad and lambda-cyhalothrin (a): Excitation spectra; (b): Emission spectra

多杀菌素-宁南霉素对比的结果如图6(a, b)所示, 多杀菌素真实样本荧光峰所对应的激发波长为282 nm, 发射波长为350 nm; 宁南霉素真实样本荧光峰所对应的激发波长为340 nm, 发射波长为435 nm。 由图中结果, 除了多杀菌素预测结果的激发光谱较真实样本的光谱有一定的红移, 其余预测结果与其真实光谱重合度较高。 因此总体上, 多杀菌素-宁南霉素混合体系的定性分析结果也比较理想。

图6

Fig.6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 多杀菌素-宁南霉素平行因子预测结果与真实样本光谱对比 (a): 激发光谱; (b): 发射光谱Fig.6 Comparison between the predicted results of PARAFAC and the real spectra of spinosad and ningnanmycin (a): Excitation spectra; (b): Emission spectra

2.4.1 多杀菌素-高效氟氯氰菊酯定量分析

分析混合样本中多杀菌素与高效氟氯氰菊酯的浓度, 首先由平行因子法得出15个混合样本中的各组分得分值, 如图7所示。 图7中每个样本中高效氟氯氰菊酯与多杀菌素的得分值, 其与样品的相对荧光强度为正相关, 根据溶液浓度与荧光强度的关系规律, 建立样品平行因子得分值与样品浓度的拟合模型, 便可实现混合体系中各样本的定量分析。

图7

Fig.7

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	图7 混合样本各组分得分值 1: 多杀菌素; 2: 高效氟氯氰菊酯Fig.7 Scores of each component of mixed sample 1: Spinosad; 2: Lambda-cyhalothrin

为分析多杀菌素、 高效氟氯氰菊酯浓度与平行因子得分值之间的关系, 选取其中10个样本进行线性回归分析, 具体结果如图8(a, b)所示, 结果表明多杀菌素、 高效氟氯氰菊酯的浓度与平行因子得分值之间存在着良好的线性关系。 其中, 多杀菌素对应模型的决定系数为0.998 16, 其函数关系为式(2)

y=443456.77234x+2053.01439(2)

图8

Fig.8

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	图8 样本浓度与得分值对应关系 (a): 多杀菌素; (b): 高效氟氯氰菊酯Fig.8 Relationship between the score value and sample concentration (a): Spinosad; (b): Lambda-cyhalothrin

高效氟氯氰菊酯对应模型的决定系数为0.997 93, 其函数关系为式(3)

y=28301.50264x-856.97133(3)

为了验证多杀菌素、 高效氟氯氰菊酯浓度预测模型的准确性, 将其余5个样本的平行因子得分值分别代入到函数关系式(2)和式(3)中, 即可获得两种农药组分对应的预测浓度值, 相关计算结果如表3所示(表中回收率参数为预测浓度与实际浓度的比值)。 其中多杀菌素的回收率范围为97.91%~102.75%, 平均回收率为100.50%, 均方误差为1.985 6× 10^-8, 决定系数为0.997 3; 高效氟氯氰菊酯的回收率范围为99.12%~100.50%, 平均回收率为99.87%, 均方误差为4.480 0× 10^-7, 决定系数为0.998 6。 结果表明, 该模型可以有效预测混合体系中多杀菌素和高效氟氯氰菊酯的浓度。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 多杀菌素、 高效氟氯氰菊酯浓度预测结果及回收率 Table 3 Recovery rate and concentration prediction results of spinosad and lambda-cyhalothrin 样本 实际浓度/ (mg· mL-1) 预测浓度/ (mg· mL-1) 回收率 /% 平均回 收率/% 多杀菌素 0.002 956 0.003 037 102.74 100.50 0.004 900 0.004 850 98.98 0.006 651 0.006 512 97.91 0.008 235 0.008 247 100.15 0.009 676 0.009 942 102.75 高效氟氯 氰菊酯 0.113 5 0.112 5 99.12 99.87 0.118 9 0.118 2 99.41 0.124 8 0.125 3 100.40 0.131 3 0.131 2 99.92 0.138 6 0.139 3 100.50

表3 多杀菌素、 高效氟氯氰菊酯浓度预测结果及回收率 Table 3 Recovery rate and concentration prediction results of spinosad and lambda-cyhalothrin

2.4.2 多杀菌素-宁南霉素定量分析

为分析混合样本中多杀菌素与宁南霉素的浓度, 同样由平行因子法得出18个混合样本中的各组分得分值, 如图9所示。

图9

Fig.9

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	图9 混合样本各组分得分值 1: 宁南霉素; 2: 多杀菌素Fig.9 Scores of each component of mixed sample 1: Ningnanmycin; 2: Spinosad

在18个多杀菌素-宁南霉素混合样本中随机选取12个进行线性回归分析, 如图10(a, b)所示, 结果表明多杀菌素、 宁南霉素的浓度与平行因子得分值之间同样存在着较好的线性关系。 其中, 多杀菌素对应模型的决定系数为0.989 48, 其函数关系为式(4)

y=297385.57143x+980.25476(4)

图10

Fig.10

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	图10 样本浓度与得分值对应关系 (a): 多杀菌素; (b): 宁南霉素Fig.10 Relationship between the score value and sample concentration (a): Spinosad; (b): Ningnanmycin

宁南霉素对应模型的决定系数为0.985 14, 其函数关系为式(5)

y=7025.99105x+3404.90295(5)

为了验证多杀菌素、 宁南霉素浓度预测模型的准确性, 将其余6个样本的平行因子得分值分别代入到函数关系式(4)和式(5)中, 即可获得两种农药组分对应的预测浓度值, 计算结果如表4所示, 其中多杀菌素的回收率范围为85.78%~107.52%, 平均回收率为98.75%, 均方误差为2.155 2× 10^-7, 决定系数为0.993 7; 宁南霉素的回收率范围为95.24%~102.92%, 平均回收率为99.88%, 均方误差为5.572 2× 10^-5, 决定系数为0.991 3。 多杀菌素、 宁南霉素定量分析的结果同样较为精确。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 多杀菌素、 宁南霉素浓度预测结果及回收率 Table 4 Recovery rate and concentration prediction results of spinosad and ningnanmycin 样本 实际浓度/ (mg· mL-1) 预测浓度/ (mg· mL-1) 回收率 /% 平均回 收率/% 多杀菌素 0.003 010 0.002 582 85.78 98.75 0.003 506 0.003 648 104.05 0.006 279 0.006 751 107.52 0.012 11 0.011 41 94.22 0.015 32 0.015 01 97.98 0.017 86 0.018 39 102.97 宁南霉素 0.481 9 0.478 0 99.19 99.88 0.467 8 0.465 1 99.42 0.418 8 0.423 7 101.17 0.346 3 0.356 4 102.92 0.306 5 0.310 6 101.34 0.274 9 0.261 9 95.27

表4 多杀菌素、 宁南霉素浓度预测结果及回收率 Table 4 Recovery rate and concentration prediction results of spinosad and ningnanmycin