Nicolet is10傅里叶变换红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司), Thermo Evolution 300紫外-可见分光光度计(美国赛默飞世尔科技有限公司), XPR56DR/AC电子天平(瑞士梅特勒托利多科技有限公司, 天平感量值为0.01 mg), DKZ恒温水浴锅(上海一恒技术有限公司)。

福林酚、 没食子酸、 乙醇、 碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)。

收集黑龙江省七台河、 伊春、 双鸭山、 佳木斯等4市; 吉林省白山、 蛟河、 通化、 延边朝鲜族自治州等4市、 州; 辽宁省鞍山、 大连、 丹东、 锦州等4市; 河北省秦皇岛市、 河南省安阳市以及俄罗斯等15个地区的黑果腺肋花楸果实, 每个地区样品50份, 共750份。

黑果腺肋花楸果实冷冻干燥、 粉碎、 过200目筛, 于75 ℃恒温干燥箱内干燥。 分别精密称取1.8 mg样品, 加入190 mg溴化钾, 研磨均匀, 压片, 红外光谱仪扫描样品400~4 000 cm^-1间红外光谱, 设定分辨率4 cm^-1, 扫描次数16次, 重复3次取平均光谱。 光谱采集过程中, 保持室内温度24~25 ℃, 相对湿度33%~36%。

分别移取1 000 μ g· mL^-1没食子酸储备液0、 1、 2、 3、 4和5 mL, 水定容至50 mL。 取200 μ L不同浓度的没食子酸标准溶液, 加1.5 mL Folin-Ciocalteu试剂混合, 并在20 ℃下静置3 min, 加10%碳酸钠溶液4 mL, 加水定容至10 mL, 混匀, 30 ℃反应60 min, 分光光度计于760 nm处测量吸光度, 绘制标准曲线。 将冷冻干燥、 粉碎过筛后的黑果腺肋花楸样品称重, 加60%乙醇溶液超声30 min, 过滤, 加60%乙醇定容至50 mL, 待用。 取200 μ L待测液, 加1.25 mL Folin-Ciocalteu试剂混合, 同上操作, 按式(1)计算总多酚含量。

样品中总多酚含量计算公式

X=m1×V1×100m×V2×1000(1)

式(1)中, X为试样中总多酚含量(%); V₁为总体积(mL); V₂为样液体积(mL); m为样品质量(g); m₁为样液中总多酚(以没食子酸计)质量。

K-S(Kennard-stone)样本集划分法, 是一种寻找样本间分布规律, 选择具有样本全体代表性的校正集数据划分方法^[8]。 K-S法按4∶ 1的校正集和验证集样品数量比例, 划分750份样品, 得校正集600个(不同地区黑果腺肋花楸样品各40份), 验证集150个(不同地区黑果腺肋花楸样品各10份)。 校正集与验证集样品多酚含量的分布情况如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 校正集与验证集样品多酚含量的分布情况 Table 1 Distribution of flavone and polysaccharide contents in samples of calibration set and validation set 集合 样品 个数 多酚含量/(g· 100 g-1) 最小值 最大值 平均值 标准差 (SD) 变异系数 (CV) 总样品集 750 5.44 7.69 6.49 0.63 9.75 校正集 600 5.44 7.69 6.49 0.63 9.7 验证集 150 5.46 7.69 6.5 0.65 9.98

表1 校正集与验证集样品多酚含量的分布情况 Table 1 Distribution of flavone and polysaccharide contents in samples of calibration set and validation set

由于样品本身、 光散射与基线漂移等因素, 采集的光谱信息会出现随机偏差。 因此, 原始光谱需经过光谱预处理方法进行修正^[9]。 在与原始光谱对比的基础上, 使用The Unscrambler X 10.4软件对所采集的原始光谱进行多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)、 标准正态变量变换(standard normal variable transformation, SNV)、 平滑(Savitzky-Golay, S-G)、 一阶导数(first derivative, FD)、 二阶导数(second derivative, SD)等处理。

采用连续投影算法(successive projections algorithm, SPA)和竞争性自适应重加权算法(competitive adaptive reweighed sampling, CARS)对最优预处理光谱数据进行特征波长点筛选。 SPA是一种采用矢量空间共线性最小化原则的光谱特征波长点筛选算法, 可以从冗长的光谱数据中提取出既具有代表性又冗余信息含量最少的特征波长^[10]。 CARS参照达尔文的“ 适者生存” 理论, 结合偏最小二乘法(partial least squares, PLS)与蒙特卡洛采样的光谱特征信息提取方法, 通过减去权重小的波长点, 保留绝对值大的波长点, 找出交互验证均方根误差(root mean square error of cross validation, RMSECV)最低的子集, 从而选出最优变量组合^[11]。

随机森林回归(random forest regression, RFR)是决策树结合bagging集成学习的数据回归预测算法。 其通过设置多棵互相独立的决策树组成决策森林, 对样本集进行随机有放回地抽样构建多个不同的校正集, 再由这些不同校正集分别构成决策树, 每一棵决策树都能建立自己的决策模型, 最后通过多个决策模型达到获得最优决策与避免模型过拟合的结果。 在RFR中, 回归树棵数与最大深度、 节点划分所需最小样本数、 叶子节点最少样本数等均对模型性能有着影响。 采用粒子群优化算法(particle swarm optimization, PSO)优秀的参数寻优能力对RFR模型进行最优参数寻找与设置, 从而保证RFR具有对数据集的适应能力强, 训练速度快, 实现简单, 精度高的特点。

以校正集决定系数(coefficient of determination of calibration set, R_c)、 验证集决定系数(coefficient of determination of prediction set, R_p)、 校正均方根误差(root mean square error of calibration, RMSEC)、 预测均方根误差(root mean squared error of prediction, RMSEP)和相对分析误差(residual predictive deviation, RPD)评价模型的预测能力, 其中R_c、 R_p越接近于1, RMSEC、 RMSEP越小和RPD> 2时, 表明模型预测效果越好。 当RPD< 1.5时, 模型无法对样本进行预测, 1.5< RPD< 2时, 模型能够对样本进行粗略的评估; RPD> 2时, 模型能够对样本进行极好的预测。

图1为黑果腺肋花楸样品的原始光谱图。 由图1(a, b)分析样品红外光谱图可知, 不同产地的样品在3 340 cm^-1附近均存在羟基— OH键伸缩振动^[12], 2 922 cm^-1附近为亚甲基— CH₃伸缩振动、 1 730 cm^-1附近为脂类和酸类分子的C=O伸缩振动、 1 629 cm^-1附近为共轭C=O伸缩振动, 1 614和1 515 cm^-1为芳环骨架振动吸收峰, 这些特征峰与其含有的黄酮类物质花青素的结构吻合。 在1 415 cm^-1处为C— O— H弯曲振动, 1 359 cm^-1处为C— H弯曲振动, 1 230 cm^-1附近为C— O伸缩振动^[13], 1 050 cm^-1附近为C— C伸缩振动, 890 cm^-1附近为β -构型多糖特征吸收峰^[14]。 样品的光谱曲线重叠严重, 但各地区样品吸收响应略有差异, 结合红外光谱丰富的化学成分信息^[15], 给后续建模处理提供了条件。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 黑果腺肋花楸原始光谱图 (a): 所有样品光谱; (b): 样品平均光谱Fig.1 Original spectrogram of A. melanocarpa (a): Spectra of all samples; (b): Sample average spectrum

采用随机森林回归算法(RFR)对不同预处理方法下的红外数据进行模型对比, 得不同预处理下多酚含量RFR模型的建模结果(表2)。 原始光谱数据建立模型如表2, 校正集R_c为0.807 8, RMSEC为0.276 1, 验证集R_p为0.821 8, RMSEP为0.272 7, RPD为2.369 1。 经不同方法进行预处理后, 除平滑预处理外, 其他预处理方法均对原始数据具有一定优化的效果。 其中MSC光谱预处理效果最好, 所建立的含量预测模型校正集R_c为0.933 9, RMSEC为0.161 8, 验证集R_p为0.912 5, RMSEP为0.191 1, RPD为3.381 3。 故将MSC预处另后的光谱作为样品最优预处理光谱, 后续分析均以MSC光谱为基础。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同预处理下多酚含量RFR建模结果 Table 2 RFR modeling results of polyphenols content under different pretreatment 光谱 类型 校正集 验证集 RPD Rc RMSEC Rp RMSEP 原始 0.807 8 0.276 1 0.821 8 0.272 7 2.369 1 S-G 0.746 3 0.317 1 0.763 4 0.314 3 2.055 9 一阶导 0.916 1 0.182 4 0.886 2 0.218 0 2.964 1 二阶导 0.927 6 1.169 4 0.837 9 0.260 1 2.484 0 SNV 0.881 7 0.216 4 0.880 8 0.223 0 2.896 6 MSC 0.933 9 0.161 8 0.912 5 0.191 1 3.381 3

表2 不同预处理下多酚含量RFR建模结果 Table 2 RFR modeling results of polyphenols content under different pretreatment

2.3.1 CARS法提取特征波长

选用CARS算法对多酚含量对应红外光谱数据进行特征波长筛选, 设置蒙特卡罗采样次数为100, 单次采样比例为总数的70%, 波长筛选结果如图2。 图2(a)为挑选变量的过程, 当运行次数在1~41次之间, 特征波长数量迅速下降, 在41~100次之间下降缓慢。 图2(b)为RMSECV的变化趋势, 可知在第41次时筛选时RMSECV值为最低。 图2(c)中各波长变量回归系数的趋势, 红线所对应位置为RMSECV值最小即第41次采样。 遵循RMSECV值最小原则, 选择第41次采样获得的269个波长变量子集为最优波长变量数。

图2

Fig.2

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	图2 CARS算法筛选特征波长过程 (a): 挑选变量的过程; (b): RMSECV的变化趋势; (c): 各波长变量回归系数的趋势Fig.2 Process of selecting characteristic wavelengths by CARS algorithm (a): Process of variable selection; (b): Change trend of RMSECV; (c): Trend of regression coefficient of variable at each wavelength

CARS选择的最优光谱波长区域为1 720~1 730、 1 478~1 489、 1 500~1 520、 1 400和1 022 cm^-1。 其中1 720~1 730 cm^-1表征C=O伸缩振动, 1 500~1 520 cm^-1附近表征黄酮类物质花青素的特征区域, 1 400 cm^-1表征C— O— H弯曲振动, 1 020 cm^-1表征C— O伸缩振动。

2.3.2 SPA法提取特征波长

选用SPA算法对多酚含量相关的红外光谱数据进行特征波长筛选, 设定波长数为1~30, 计算不同特征波长数下的均方根误差, 如图3。 由图3(a)可知经过迭代后, 均方根误差最小值为0.441 7, 最终选取7个波长数作为最优波长数。 光谱选取波长变量如图3(b)所示。 这7个波长点所对应的特征波长分别为1 150、 1 320、 2 647、 2 729、 2 869、 4 622和5 240 cm^-1, 其中1 320 cm^-1表征C— H弯曲振动, 2 869 cm^-1表征亚甲基— CH₃伸缩振动等。

图3

Fig.3

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	图3 SPA算法筛选特征波长过程 (a): 均方根误差变化趋势; (b): 波长选取结果Fig.3 Process of selecting characteristic wavelength by SPA algorithm (a): Change trend of root mean square error; (b): Wavelength selection results

为找出最优性能的模型, 将经CARS, SPA分析处理后的红外光谱数据作为输入变量, 分别建立随机森林回归(RFR)、 偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLSR)、 极限学习机(extreme learning machine, ELM)、 支持向量回归(support vector regression, SVR)的黑果腺肋花楸多酚含量预测模型。 在预测模型中, 不同参数的选择对模型预测准确度有着极大的影响。 使用Sigmoid函数作为ELM的激活函数, 径向基函数(radial basis function, RBF)作为支持向量机的核函数, 采用PSO寻优算法帮助4种模型寻找其最优参数(RFR的最佳决策树棵树, PLSR的PCA数量最佳选择, 极限学习机隐藏层神经元个数和SVM的最佳c, g)。 不同模型对多酚含量预测结果如表3, 最优模型结果如图4(a, b)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同模型对多酚含量的预测结果 Table 3 Prediction of polyphenols content by different models 最佳参数 校正集 验证集 RPD Rc RMSEC Rp RMSEP CARS-RFR Tree=377 0.986 5 0.073 2 0.974 3 0.100 6 6.235 6 SPA-RFR Tree=469 0.986 6 0.073 0 0.931 8 0.168 8 3.828 1 CARS-ELM neuron=655 0.930 3 0.164 6 0.916 7 0.187 6 3.464 2 SPA-ELM neuron=783 0.921 5 0.176 2 0.924 0 0.178 7 3.626 3 CARS-PLSR pca=30 0.944 8 0.147 9 0.923 5 0.178 3 3.615 5 SPA-PLSR pca=4 0.551 3 0.421 7 0.554 2 0.431 4 1.497 7 CARS-SVR c=4.1 g=0.82 0.968 0 0.111 5 0.921 8 0.181 8 3.575 9 SPA-SVR c=2.83 g=1.12 0.890 6 0.207 9 0.899 3 0.205 6 3.151 8

表3 不同模型对多酚含量的预测结果 Table 3 Prediction of polyphenols content by different models

图4

Fig.4

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	图4 RFR模型的多酚含量预测结果 (a): 校正集; (b): 验证集Fig.4 Prediction results of polyphenol content of RFR model (a): Calibration set; (b): Verification set

从表3可看出, CARS数据所建模型的平均RPD值为4.222 8, 高于SPA数据所建模型的平均RPD值3.026。 CARS-RFR、 CARS-PLSR、 CARS-SVR模型校正集R_c值高于0.933 9, CARS-RFR、 CARS-ELM、 CARS-PLSR、 CARS-SVR验证集的R_p值高于0.912 5, 仅有CARS-ELM模型校正集R_c值为0.930 3略低于0.933 9。 说明CARS算法能够有效提取黑果腺肋花楸光谱具有代表性的特征数据, 从而提高模型的稳定性及准确性。 从8个模型的校正集与验证集预测性能对比, CARS-RFR模型性能最佳(图4)。 其校正集的R_c为0.986 5, RMSEC为0.073 2, 验证集R_p为0.974 3, RMSEP为0.100 6, RPD为6.235 6。 因此选择CARS-RFR模型作为最优的黑果腺肋花楸多酚含量预测模型。