DHG-9055AD电热恒温干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司); 1100高效液相色谱(安捷伦); KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); SolidSpec 3700DUV近红外光谱仪(岛津, 日本); Matlab R2021b用于数据处理、 作图和建模。

90%乙醇 (分析纯, 天津致远化学试剂有限公司); 齿孔酸对照品 (NLT: ≥ 98.0%购自四川精萃天成药物科技有限公司); 乙腈(色谱纯, Merck公司, 批号: K54731230); 阿里红饮片90份(新疆恩萨尔维吾尔医药饮片制药有限公司), 该饮片由刘戈宇副研究员鉴定为阿里红药材。 实验前, 样品需粉碎过40目筛并置于电热恒温干燥箱中60 ℃干燥4 h以除去水分。

2.1.1 色谱条件

色谱柱: Hedera ODS-2 C18柱(4.6 mm× 250 mm, 5 μ m), 如图1所示;

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 高效液相色谱 (a): 供试品溶液; (b): 齿孔酸对照品溶液; (c): 空白样品溶液; 1: 齿孔酸Fig.1 HPLC chromatograms (a): Sample solution; (b): Standard solution; (c): Blanksolution; 1: Eburicoic acid

流动相: A相为0.1%磷酸(A), B相为乙腈; 检测波长: 210 nm; 流速1.0 mL· min^-1; 进样量10 μ L;

梯度洗脱时间程序: 0~20 min保持A-B(40∶ 60), 20~28 min, 线性变化至A-B(10∶ 90), 28~48 min, 保持A-B(10∶ 90), 48~51 min, 线性变化至A-B(40∶ 60), 51~53 min, 保持A-B(40∶ 60);

柱温: 30 ℃。

2.1.2 溶液制备

齿孔酸对照品溶液制备: 精密称取齿孔酸对照品24.75 mg, 加入90%乙醇溶解并定容于25 mL量瓶中, 摇匀, 即得浓度为0.97 mg· mL^-1的对照品溶液, 备用。

供试品溶液制备: 称取干燥阿里红药材粗粉(过40目筛)约0.5 g, 置于15 mL具塞试管中, 并用15 mL 90%乙醇处理; 样品混合物在60 ℃下超声处理30 min(功率200 W), 过滤并收集滤液, 再加90%乙醇15 mL洗涤残渣继续超声提取2次, 合并滤液浓缩并定容至50 mL摇匀, 然后通过0.45 μ m有机滤膜, 取续滤液作为供试品溶液。

空白样品溶液: 90%乙醇用0.45 mm滤膜过滤, 续滤液作为空白样品溶液。

2.1.3 线性关系考察

精密量取对照品溶液1.00, 3.00, 5.00, 8.00 mL分别置于10 mL量瓶中, 加90%乙醇定容, 摇匀。 分别吸取上述各浓度对照品线性溶液和对照品溶液各10 μ L依次注入液相色谱仪, 按“ 2.1.1” 项色曲线, 如图2所示得回归方程为Y=3 435.6x+440.82, r=0.999 8, 结果表明在97~970 μ g· mL^-1内, 浓度和峰面积的线性关系良好。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 齿孔酸标准曲线Fig.2 Standard curve of Eburicoic acid

2.1.4 仪器精密度试验

制备同一份供试品溶液连续进样6次, 每次精确进样10 μ L, 记录6次峰面积并计算出RSD为0.041%, 表明仪器精密度良好, 测定结果可信, 结果见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 精密度试验结果 Table 2 Results of Precision test Sample 峰面积 平均值 RSD/% 1 1 438.52 1 439.32 0.041 2 1 439.42 3 1 440.18 4 1 439.74 5 1 439.11 6 1 438.95

表2 精密度试验结果 Table 2 Results of Precision test

2.1.5 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液分别于0, 4, 8, 12, 18, 24 h每次精确进样10 μ L, 并记录每次峰面积并计算出RSD为0.057%, 表明本品在室温条件下24 h内稳定性良好测定结果可信, 结果见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 稳定性试验结果 Table 3 Results of solution stability test Hours 峰面积 平均值 RSD/% 0 1 438.52 1 438.82 0.057 4 1 438.76 8 1 439.82 12 1 439.55 18 1 438.75 24 1 437.49

表3 稳定性试验结果 Table 3 Results of solution stability test

2.1.6 重复性试验

取同一份阿里红药材6个平行样, 按供试品溶液制备方法制成样品溶液, 按“ 2.1.1” 项下色谱条件测定, 记录6次峰面积并计算出含量和RSD分别为2.41%和1.73%, 表明该方法重复性良好, 测定结果可信, 结果见表4。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 重复性试验结果 Table 4 Results of repetitive test Sample 含量/% 平均值/% RSD/% 1 2.43 2.41 1.73 2 2.42 3 2.47 4 2.40 5 2.38 6 2.35

表4 重复性试验结果 Table 4 Results of repetitive test

2.1.7 回收率试验

取同一份阿里红药材6个平行样约0.5 g, 精密称定, 并加入一定量的对照品, 按供试溶液制备方法制成样品溶液, 精密吸取10 μ L, 按“ 2.1.1” 项色谱条件测定, 计算回收率。 平均回收率为100.81%, RSD为1.81% (n=6), 表明回收率良好, 结果见表5。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 齿孔酸加样回收率试验结果(n=6) Table 5 Result of sample recovery of Eburicoic acid 称样量 /mg 理论含量 /mg 加入量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均值 /% RSD /% 524.5 7.87 6.22 14.23 102.25 100.81 1.81 546.7 8.20 7.01 15.16 99.29 586.4 8.80 6.53 15.20 98.01 502.3 7.53 6.86 14.54 102.19 515.9 7.74 6.32 14.21 102.37 554.8 8.32 6.56 14.83 100.77

表5 齿孔酸加样回收率试验结果(n=6) Table 5 Result of sample recovery of Eburicoic acid

2.1.8 阿里红中齿孔酸含量计算并划分样本

取90批阿里红药材, 每一批样品平行制备3份, 按“ 2.1.1” 项下色谱条件测定, 计算90份样品中齿孔酸的含量, 齿孔酸含量范围为1.27%~4.35%, 采用K-S样本划分法, 将样品以3∶ 1比例进行校正集和预测集划分, 最终校正集为68个样品, 预测集为22个样品, 如表6所示。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 阿里红样本划分 Table 6 Samples division 样本集 样本数 齿孔酸含量/% 最小值 最大值 平均值 校正集 68 1.27 4.36 2.44 预测集 22 1.31 3.90 2.65

表6 阿里红样本划分 Table 6 Samples division

2.2.1 光谱采集

使用近红外光谱仪(SolidSpec 3700DUV, Shimadzu, Japan)采集近红外光谱。 仪器配备了水平积分球漫反射采样元件、 近红外区的InGaAs和PbS探测器。 NIRS仪器系统在测量前用白板进行校准, 收集了800~2 500 nm范围内的光谱, 分辨率为0.1 nm。 每个样品重新加载并记录3次, 计算平均光谱并用于数据处理。

2.2.2 光谱预处理

原始光谱是药材最直接的表现形式, 光谱变换可以不同程度地削弱或消除背景噪声, 对优化特征谱带和提高谱带灵敏度至关重要。 本研究选择了五种常用的光谱变换方法进行光谱数据预处理, 包括一阶导数(FD)、 二阶导数(SD)、 Savitzky-Golay平滑算法(SG)、 多元散射校正(MSC)和标准正态变化(SNV), 结果如图3所示。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 90批次阿里红饮片的近红外光谱Fig.3 NIR spectra of 90 pieces of Fomes officinalis Ames Decoction

2.2.3 近红外光谱解析

90个样品的近红外光谱特征如图3(a)所示。 在1 198、 1 467、 1 733、 1 949、 2 117和2 301 nm附近有6个主峰。 1 198 nm的吸收来源于C— H伸缩和第二泛音。 1 467、 1 733和1 949 nm处的峰值分别来自O— H和O— H组合带的第一泛音。 2 117和2 301 nm处的峰是由于脂的CH₂基团中C— H和C— O伸缩振动的组合带。 图3(b)为多元散射校正(MSC)处理后的90个样品的近红外光谱, 图3(c)为标准正态变化(SNV)处理后的90个样品的近红外光谱, 图3(d)为Savitzky-Golay平滑算法(7个点)处理后的90个样品的近红外光谱图, 图3(e)为一阶导数(FD)处理后的90个样品的近红外光谱图, 图3(f)为二阶导数(SD)处理后的90个样品的近红外光谱图。 视觉观察, 90个样品的NIR光谱显示出非常微小的差异, 并且所有峰的趋势和吸收强度都非常相似。 这些细微的差异可用来通过化学计量学进行量化。

2.2.4 波长点选择方法

近红外光谱吸收峰重叠现象严重, 信号吸收较弱, 且背景干扰严重, 波长选择的目的就是剔除干扰和无用的变量, 并减少数据冗余和多重共线性, 提高模型的预测精度和预测效率。 波长点选择方法的特点是将每个波长点视为一个单元, 因此点选择的变量是离散的。 本研究采用竞争自适应加权采样法(CARS)进行点变量选择^[12]。 竞争性自适应重加权算法(CARS)是每次通过自适应加权采样, 保留PLS模型中回归系数绝对值权重较大的点作为新的子集, 去掉权值较小的点, 再新的子集建立PLS模型, 经过多次计算, 选择PLS模型交互验证均方根误差最小子集中的波长作为特征波长。

如图4所示, CARS的波长选择基于50次迭代和十折交叉验证。 以CARS选择过程的图形表示, 图4(a)表示蒙特卡洛采样运行次数和选择率, 由于衰减指数函数的作用, 随着采样次数的增加, 在采样前期变量数快速减少, 随着采样次数的增加, 变量减少的速度减慢, 表明算法“ 粗选” 和“ 精选” 的过程。 图4(b)表示蒙特卡洛采样运行次数和交叉验证均方根误差, 采样次数为22次时RMSECV最小为0.123 7%。 图4(c)表示蒙特卡洛采样运行过程中各个波长的回归系数趋势。 每个波长由彩色线表示, 星号垂线表示在22次采样运行后确定的交叉验证均方误差根最小时对应的波长子集共94个波长纳入PLS模型, 占原始光谱信息的5.53%。

图4

Fig.4

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图4 竞争自适应重加权抽样(CARS)变量选择 (a): 蒙特卡洛(MC)样本的数量和选择率; (b): 基于选择过程的进展的交叉验证误差; (c): 在采样运行过程中各个波长的回归系数的趋势, 每个波长由彩色线表示, 星号线指示在22次采样运行后识别的具有最低交叉验证均方根误差(RMSE)的子集Fig.4 Competitive adaptive reweighted sampling (CARS) variable selection with top panel (a): The number of Monte Carlo (MC) samples and rate of selection; (b): Cross-validated error based on progression of the selection process; (c): Trends in regression coefficients of individual wavelengths over the course of the sampling runs with each wavelength represented by a coloured line and the asterisk line indicating the subset with the lowest root mean square error (RMSE) of cross-validation identified after 22 sampling runs

2.2.5 模型评价

使用一种普遍接受的十折交叉验证方法, 通过式(1)获得的最小预测残差平方和(PRESS)点确定模型的潜在变量数量。 PLS模型评价一般由确定系数R²和均方根误差(RMSE^* )确定。 R²由式(2)获得, R²越接近于1, 表示因变量的变化是由大部分回归线描述的。 如果直线的平方误差很大, R²越接近于0, 表示因变量的变化很少由回归线描述。 RMSE^* 从式(3)获得, RMSE^* 表示回归线未描述的总变化的百分比, 如果直线的平方误差很小, 意味着直线非常适合。 评价原则一般认为R²越接近1, RMSE^* 越接近0, 模型效果越好。 性能偏差比(ratio of performance to deviation, RPD)由式(4)计算得到, 表示模型预测性能。 一般RPD越大, 模型的预测能力越强^[13]。 RPD的阈值选择取决于多种因素, 如背景、 目的和行业。 学者们更倾向于将RPD< 1.4视为轻微或根本不具有代表性, 将1.4~3.0之间的值视为合理预测, 当RPD> 3时, 表示模型预测精度高。 各项评价参数不能孤立参考, 需要综合起来评价。

$\operatorname{PRESS}=\sum_{i=1}^{n}\left(\hat{y}_{i}-y_{i}\right)^{2}$(1)

$R^{2}=1-\frac{\sum_{i=1}^{n}\left(\hat{y}_{i}-y_{i}\right)^{2}}{\sum_{i=1}^{n}\left(y_{i}-\bar{y}_{i}\right)^{2}}$(2)

$\operatorname{RMSE}^{* }=\sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{n}\left(\hat{y}_{i}-y_{i}\right)^{2}}{n-1}}$(3)

RPD=1/1-Rp2(4)

其中, y_i为第i个样本的测量值, $ \hat{y}_{i}$为第i样本的预测值, y̅i为所有样本测量值的平均值, n为样本个数。

由表7所示, 建立不同前处理光谱数据和不同策略选择波长的PLS模型, 并对其建模效果进行评价。 显然在引入CARS变量选择之前, 近红外光谱吸收峰重叠现象严重, 背景干扰严重, 模型效果很差。 CARS波长选择的引入剔除了干扰和无用的变量, 大大提高模型的预测精度和预测效率, 与其他模型相比, SNV+CARS模型性能最佳, 其潜变量为45个, Rp2为0.982 3, RMSEP为0.103 7%, RPD为5.34。 图5为该模型真实含量和预测含量对比。 t检验表明, SNV+CARS+PLS建模方法和传统HPLC方法在预测阿里红中齿孔酸含量上没有显著差异。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 不同前处理和CARS选择波长组合下PLS模型 Table 7 PLS models by different preprocessing combined with CARS wavelength selection algorithms Methods LVs RMSECV/% RMSEC/% RMSEP/% Rc2 Rp2 RPD Original+Full 2 0.706 8 0.671 2 0.757 0 0.157 9 0.011 1.00 S-G+Full 2 0.713 9 0.671 2 0.757 0 0.155 7 0.012 1.00 FD+Full 1 0.744 6 0.675 1 0.571 1 0.145 4 0.401 4 1.09 SD+Full 1 0.757 0 0.348 1 0.891 6 0.748 2 0.010 3 1.00 MSC+Full 1 0.019 9 0.701 0 0.577 0 0.123 8 0.115 8 1.01 SNV+Full 5 0.732 5 0.586 3 0.532 2 0.386 1 0.282 1 1.04 Original+CARS 31 0.266 1 0.041 4 0.105 1 0.996 9 0.976 1 4.60 S-G+CARS 38 0.365 8 0.011 3 0.185 3 0.999 8 0.910 7 2.42 FD+CARS 17 0.570 9 0.010 4 0.161 7 0.999 8 0.924 6 2.63 SD+CARS 24 0.295 6 0.007 3 0.235 7 0.999 9 0.922 4 2.59 MSC+CARS 45 0.185 7 0.006 9 0.152 7 0.999 8 0.928 1 2.69 SNV+CARS 45 0.256 0 0.002 7 0.103 7 0.999 9 0.982 3 5.34

表7 不同前处理和CARS选择波长组合下PLS模型 Table 7 PLS models by different preprocessing combined with CARS wavelength selection algorithms

图5

Fig.5

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	图5 真实含量VS预测含量Fig.5 Actual content VS calculated content

2.2.6 决定系数的解释

回归分析主要用于探索因变量和自变量之间的关系。 在线性回归分析中, 决定系数法(也称为R平方)用于预测和解释模型的结果。 与一元回归模型不同, 除了内部验证性能外, 多元回归还包括外部验证性能, 会导致模型选择中出现一个以上的R²。 有些模型的 Rc2大于 Rp2, 这称为过拟合。 相反有些模型的 Rp2大于 Rc2, 称为欠拟合。 理想情况下, Rp2的变化方向与 Rc2相同, 但实际上过拟合和欠拟合是常见现象。 本文最优回归模型选择的是 Rp2最大的模型。