实验所需主要仪器参见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实验主要仪器 Table 1 Experimental instruments 仪器名称 型号/规格 生产厂家/供货商 集热式恒温加热磁力搅拌器 DF-101S 巩义市予华仪器有限责任公司 pH计 PB-10 赛多利斯(德国) 激光拉曼光谱仪 DXR 赛默飞世尔(美国) 紫外可见光分光光度计 UV-3500 上海美谱达仪器有限公司

表1 实验主要仪器 Table 1 Experimental instruments

氯金酸、 硝酸银、 柠檬酸三钠、 单巯基β -环糊精、 乙醇、 16种多环芳烃标液等均为分析纯。 所有试剂和缓冲溶液均使用去离子水配置, 实验中所用实际水样来源于奉贤区相关河道, 具体见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 实验试剂 Table 2 Experimental reagents 试剂名称 纯度 生产厂家/供货商 氯金酸、 柠檬酸三钠、 硝酸银、 乙醇等 分析纯 上海化学试剂有限公司(中国上海) 萘、 芴、 菲、 蒽、 苊、 苊烯(二氢苊)、 荧蒽、 芘、 艹屈、 苯并(a)蒽、 苯并(b)荧蒽、 苯并(k)荧蒽、 苯并(a)芘、 茚苯(1, 2, 3-cd)芘、 二苯并(a, h)蒽、 苯并(ghi)苝(二萘嵌苯) 分析纯 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich) 单巯基β -环糊精 分析纯 山东智源科技有限公司 去离子水 泰坦科技

表2 实验试剂 Table 2 Experimental reagents

在使用拉曼光谱仪前, 要先用硅片对其背景采集。 设置激发光源的波长为532 nm, 强度为20 mW, 物镜的使用倍数为20倍, 设置积分时间为2 s, 次数6次, 工作距离设置为20 mm, 设置拉曼光谱扫描的范围为500~3 000 cm^-1, 分辨率设置为0.2 nm。

选用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备纳米金。 烧杯中加入98 mL去离子水和1 mL四氯金酸(质量分数1%)加热搅拌至微沸再加入1 mL入柠檬酸钠(质量分数1%), 溶液颜色变为紫红色后继续加热10 min, 停止加热并冷却至室温。 β -环糊精修饰AuNPs的过程参考文献[20], 将制备好的AuNPs和β -环糊精(1 μ mol· L^-1)以体积比1∶ 1混合搅拌12 h后保存。

选用经典制备手段制备纳米银。 在烧杯中加入0.001 mol· L^-1的硝酸银溶液100 mL, 搅拌加热至烧杯中溶液微微沸腾后一次性快速的加入2 mL质量分数为1%的柠檬酸钠溶液并继续加热, 此时, 纳米银溶液的颜色会从无色透明逐渐转化为不透明的黄绿色, 加热搅拌1 h后停止, 常温下冷却至室温。 将制备好的纳米银与1× 10^-5 mol· L^-1的巯基β -环糊精等体积混合恒温震荡过夜后避光保存备用。

如图1所示, 将巯基取代的β -环糊精通过环糊精-硫键修饰到纳米金和纳米银颗粒表面, 分别制备了β -环糊精修饰的银纳米颗粒(AgNPs@β -CD)和β -环糊精修饰的金纳米颗粒(AuNPs@β -CD)。 将二者按1∶ 10的比例混合得到AgNPs@β -CD+AuNPs@β -CD的分散状态, 溶液颜色以纳米金颜色为主, 呈现红色。 因为β -环糊精的二级空间结构呈现碗状, 在其内部有一个较大的碗状空腔。 当溶液中存在多环芳烃芘的时候, 芘可以嵌入到疏水空腔中, 形成稳定的复合结构。 当体系中存在氧化态的TMB时, 会改变β -环糊精碗状腔体的表面电荷, 检测体系的溶液颜色由红色变为蓝紫色。

图1

Fig.1

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	图1 AgNPs-芘-AuNPs核-卫星结构的制备及其对多环芳烃芘双模检测示意图Fig.1 Schematic illustration of AgNPs-pyrene-AuNPs core-satellite structures and its dual-modal detection of pyrene

混合溶液颜色的变化预示着AuNPs@β -CD发生了聚集。 如图1所示, 将实验结果归因于Ox-TMB的加入可以改变β -环糊精碗状空腔表面的电荷, 使β -环糊精的空腔和芘分子形成了主体-客体-主体结构, 又由于β -环糊精修饰在AuNPs和AgNPs的表面, 即形成了纳米粒子-芘-纳米粒子的结构。 这个结构的形成主要是由于在Ox-TMB的作用下, 降低了β -环糊精空腔间的相互作用, 而芘在这个过程中充当了一个“ 分子桥” , 连接了体系中的纳米粒子。 由于纳米银颗粒的粒径大于纳米金颗粒, 纳米银颗粒和纳米金颗粒间的作用力要小于同种颗粒间的作用力, 所以更容易以纳米银颗粒为核形成AgNPs-pyrene-AuNPs的核-卫星结构。 核-卫星结构的形成, 使得AuNPs@β -CD聚集在了AgNPs@β -CD附近, 溶液颜色发生变化。 而核-卫星结构的多少取决于分子芘的含量, 所以可以通过比色法建立溶液颜色与芘浓度之间的关系。

核-卫星结构同样形成了“ 热点” 效应从而增强了SERS信号。 如图1所示, 以核-卫星结构作基底的SERS信号强度远大于普通的分散纳米颗粒基底, 可通过SERS方法实现分子芘的高灵敏高特异检测。

通过透射电镜对AgNPs@β -CD+AuNPs@β -CD的分散状态溶液和形成AgNPs-pyrene-AuNPs的核-卫星结构溶液进行扫描, 扫描结果如图2所示。

图2

Fig.2

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	图2 不同处理下的透射电镜扫描图, 吸收曲线和拉曼光谱图 (a): AgNPs@β -CD+AuNPs@β -CD的分散状态; (b): AgNPs-pyrene-AuNPs的核-卫星结构Fig.2 Transmission electron microscope images, absorption curve and Raman spectrum of different solutions (a): AgNPs@β -CD+AuNPs@β -CD; (b): AgNPs-pyrene-AuNPs core-satellite structures

通过图2(a)系列可知, 当溶液中不含有芘时, β -环糊精修饰的AuNPs和AgNPs依然是规则的球形, AgNPs@β -CD的粒径大于AuNPs@β -CD, 且个数较少。 两种纳米颗粒均匀分布在溶液中, 氧化态的TMB的存在并没有影响溶液中纳米颗粒的形态, 吸收曲线与纳米金溶液的吸收曲线相似, 由于修饰后纳米颗粒粒径的增大和纳米银颗粒的加入, 溶液最大吸收峰出现红移。 而AgNPs@β -CD+AuNPs@β -CD混合溶液并没有明显的拉曼吸收。

当体系中有芘加入时, 芘分子会嵌入到β -环糊精的碗状空腔中, 在Ox-TMB的作用下形成主体-客体-主体结构, 促使溶液中纳米颗粒逐步形成AgNPs-pyrene-AuNPs的核-卫星结构。 如图2(b)系列所示, 核-卫星结构的形成, 使得AuNPs@β -CD聚集在了AgNPs@β -CD附近, 在透射电镜下产生不同程度的“ 菌落” 态聚集。 聚集使溶液颜色发生变化, 从而导致吸收曲线在最大吸收峰处的吸光度值明显降低, 而在680 nm波长附近的吸光度值有了明显增大。 而核-卫星结构的形成产生了“ 热点” 效应, 从而显著增强了SERS信号。

在16种常见的多环芳烃中, 萘、 芴、 菲、 蒽、 苊、 苊烯(二氢苊)、 荧蒽、 芘、 艹屈、 苯并(a)蒽、 苯并(b)荧蒽、 苯并(k)荧蒽、 苯并(a)芘、 茚苯(1, 2, 3-cd)芘、 二苯并(a, h)蒽、 苯并(ghi)苝(二萘嵌苯)的结构包含有三、 四或五个苯环, 结构性质相似又略有不同。 为了考量AgNPs-AuNPs的核-卫星检测体系对16种多环芳烃的特异性, 各取80 μ mol· L^-1的16种多环芳烃标准溶液添加进AgNPs@β -CD+AuNPs@β -CD的检测体系中, 分别在入射光波长680 nm处测定溶液的吸光度值, 每个样品测定三次, 结果如图3所示。

图3

Fig.3

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	图3 16种多环芳烃的吸光度值(其中多环芳烃浓度为80 μ mol· L-1)Fig.3 Absorbance values of 16 PAHs(with concentration of 80 μ mol· L-1)

含有三个和四个苯环的多环芳烃, 其结构上有着极大的相似性, 可以很好地镶嵌在β -环糊精的碗状空腔中, 促使体系形成AgNPs-PAHs-AuNPs的核卫星结构。 五个环及以上的多环芳烃由于体积原因, 不容易嵌入到β -环糊精的空腔中; 而两个环的萘也由于分子较小的原因容易从β -环糊精的空腔中脱落, 所以无法形成稳定的AgNPs-PAHs-AuNPs核卫星结构, 吸光度值不到0.3, 无法通过肉眼观察出颜色的变化。

单独基于AgNPs-PAHs-AuNPs核-卫星结构的比色法无法区分多种三环、 四环多环芳烃混合溶液中多环芳烃的种类, 但是可以通过标准曲线法检测三、 四环多环芳烃的总量。

由于AgNPs-pyrene-AuNPs的核-卫星结构的比色法对含有三个、 四个苯环的多环芳烃都具有识别作用, 因此在检测芘的基础上选择了具有代表性的含有三个环的多环芳烃蒽作对比。 配置一系列已知浓度的芘标准溶液, 所得的吸光度在低浓度和高浓度范围内变化趋势不太一致, 所以分别绘制低浓度和高浓度芘标准曲线, 结果见图4(a, b)。 芘处于低浓度(a)与高浓度(b)时, 均与吸光度呈良好的线性关系。 该检测方法的检测限为3.4 μ mol· L^-1。 浓度在10 μ mol· L^-1到30 μ mol· L^-1之间, 吸光值与浓度呈线性关系, 回归直线方程y=3.9× 10^-3x+0.22, 相关系数R=0.984。 芘的浓度在30~100 μ mol· L^-1之间, 吸光值与浓度也呈线性关系, 回归直线方程y=8.2× 10^-4x+0.31, 相关系数R=0.985。 根据3σ /slope方法的检测下限(LOD)为3.4 μ mol· L^-1, 低于国家标准中水体中芘的限值。

图4

Fig.4

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	图4 检测方法的灵敏度(芘)Fig.4 Sensitivity of the biosensor for pyrene detection

如图5(a)所示, 蒽的浓度在10~40 μ mol· L^-1之间, 吸光值与浓度呈线性关系, 回归直线方程y=2.78× 10^-3x+0.23, 相关系数R²=0.995。 如图5(b)所示, 蒽的浓度在40~100 μ mol· L^-1之间, 吸光值与浓度呈线性关系, 回归直线方程y=7.5× 10^-4x+0.32, 相关系数R²=0.992。 根据3σ /slope可得, 传感器的检测下限(LOD)为3.7 μ mol· L^-1, 低于国家标准中水体中蒽的限值。

图5

Fig.5

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	图5 检测方法的灵敏度(蒽)Fig.5 Sensitivity of the biosensor for anthracene detection

根据芘和蒽的相关系数和检测下限对比, 芘的检测下限(LOD)略低于蒽的检测下限, 结合图3, 图4, 图5初步推断四环的多环芳烃镶嵌到β -环糊精的空腔结构中后, 更容易形成AgNPs-PAHs-AuNPs的核-卫星结构。 因此, 相对于蒽和芘两种多环芳烃, 可以通过AgNPs-PAHs-AuNPs的核-卫星检测体系检测出更低浓度的芘。

在针对环境中16种常见的多环芳烃的快速检测中, 比色法在多环芳烃的定性上具有一定局限性。 例如蒽和芘分别为含有三个和四个苯环, 由于它们在结构上有着极大的相似性, 通过比色法进行定性鉴别就遇到了比较大的困难。 由于拉曼光谱属于指纹性光谱, 不同的分子具有不同的振动峰, 因此该方法可以应用于蒽和芘, 甚至多种多环芳烃混合物的定性鉴别。

根据图2(b)的SERS谱图可知, 芘位于1 605 cm^-1处的拉曼峰比较明显, 而蒽在此处并无明显的拉曼峰。

为了更好地检测体系中芘的拉曼强度, 对整个检测体系中巯基β -环糊精浓度, 反应温度和反应时长对检测结果的影响进行了考量并选择了最优的体系检测条件。

如图6(a)所示, 巯基β -环糊精浓度在1× 10^-9~1× 10^-5 mol· L^-1时, 1 605 cm^-1的拉曼强度会随浓度增加而上升; 当巯基β -环糊精的浓度超过1× 10^-5 mol· L^-1时, 1 605 cm^-1的拉曼峰值会随巯基β -环糊精浓度的增加而降低。 分析认为溶液中巯基β -环糊精浓度增加时, 会有多余的巯基β -环糊精无法与纳米粒子相结合, 使得一部分芘进入游离的巯基β -环糊精疏水内腔导致拉曼强度降低。 因此选择1× 10^-5 mol· L^-1的浓度为该体系的最优巯基β -环糊精浓度。

图6

Fig.6

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	图6 SERS检测体系的优化Fig.6 Optimization of SERS detection system

由图6(b)可知, 反应时间低于25 min时, 1 605 cm^-1处的拉曼峰值会随时间延长而增大; 当反应时间超过于25 min时, 1 605 cm^-1处的拉曼峰值几乎不随时间的延长而移动。 分析认为在时间不足25 min时, 溶液中的芘一直在持续地进入β -环糊精疏水内腔, 因此1 605 cm^-1处的拉曼峰值会随时间延长而增强; 当时间超过25 min后, 溶液中大部分的芘已经与巯基β -环糊精结合完成, 因此1 605 cm^-1处的拉曼峰值几乎不再随时间的延长而变化。 选择25 min为该体系的最佳反应时间。

如图6(c)所示, 反应温度低于20 ℃时, 1 605 cm^-1处的拉曼强度会随温度升高而增强; 当反应温度超过20 ℃时, 1 605 cm^-1处的拉曼强度会随着反应温度增加而降低。 这主要取决于纳米粒子本身的性质, 因此选择室温20 ℃为该体系的最佳反应温度。

配置一系列已知浓度的芘标准溶液, 加入AgNPs@β -CD+AuNPs@β -CD的检测体系中, 其中芘的浓度分别为20、 40、 60、 80和100 μ mol· L^-1。 图7(a)所示的为拉曼光谱图, 其中每条曲线的数据进行三次平行实验然后记录其在1 605 cm^-1处的特征峰数值, 使用特征峰值的平均值并标注标准偏差, 然后将特征峰的拉曼强度拟合成标准曲线。 图7(b)为拟合后的标准曲线, 由图7(a, b)可知, 随着溶液中芘浓度的增加, 特征峰处的拉曼信号成正比例增强, 在20~100 μ mol· L^-1呈良好的线性关系。 拟合方程y=15.24x+3 138, 线性相关系数R²=0.994 8。 根据3σ /slope可得, 传感器的检测下限(LOD)为0.42 μ mol· L^-1, 低于国家标准中水体中芘的限值。

图7

Fig.7

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	图7 不同浓度芘的拉曼谱图和标准曲线Fig.7 Raman spectra and standard curves of pyrene at different concentrations

由表3可知, 双模式传感检测法的加标回收率为94%~106%, 相对标准偏差都小于10%。 同时用GC/MS平行测定相同样品3次, 测得的加标回收率介于94%~110%。 经过对比可说明双模式传感法用于快速检测水中芘是可行的。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 双模式传感检测法和GC/MS检测水中的芘 Table 3 Determination of pyrene in the water and comparison with GC/MS 样品 芘/ (μ mol· L-1) 双模式传感法 GC/MS 比色法 表面增强拉曼 测定结果 /(μ mol· L-1) 回收率 /% RSD /% 测定结果 /(μ mol· L-1) 回收率 /% RSD /% 测定结果 /(μ mol· L-1) 回收率 /% RSD /% 自来水 10 9.57 95.7 1.5 9.80 98.0 7.8 11.1 110 2.3 20 20.6 103 4.7 19.6 98.0 8.6 21.0 105 3.1 50 50.0 100 8.7 53.1 106 9.2 49.3 98.6 1.7 100 102 102 7.8 95.7 95.7 5.9 102 102 2.8 河水 10 10.1 101 9.1 9.83 98.3 2.5 9.47 94.7 5.0 20 19.9 99.3 9.1 20.6 103 5.3 21.2 106 4.0 50 47.2 94.3 6.1 48.2 96.3 5.0 49.0 98.0 2.6 100 101 101 4.5 104 104 7.1 107 107 1.5

表3 双模式传感检测法和GC/MS检测水中的芘 Table 3 Determination of pyrene in the water and comparison with GC/MS