FTIR结合ELM对黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量快速预测
杨承恩1,2, 李萌3, 卢秋宇2, 王金玲4, 李雨婷2,*, 苏玲1,*
1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心, 吉林 长春 130118
2.吉林农业大学生命科学学院, 吉林 长春 130118
3.长春职业技术学院现代农学系, 吉林 长春 130504
4.国药一心制药有限公司, 吉林 长春 130600
*通讯作者 e-mail: suling0648@163.com; liyuling2002@163.com

作者简介: 杨承恩, 1996年生, 吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心硕士研究生 e-mail: 928618077@qq.com

摘要

黑果腺肋花楸是继蓝莓后的又一小浆果, 因其黄酮含量高于蓝莓受到关注, 已获进入新资源食品名单, 并在饮料行业中使用。 黑果腺肋花楸黄酮、 多糖是其果汁及果渣中的主要生物活性成分, 也是影响其品质的重要因素。 以中红外光谱技术结合化学计量学方法对黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量进行预测, 为建立简便、 快捷的黑果腺肋花楸产品质量检测方法提供基础。 采集15个产区共750份黑果腺肋花楸红外光谱数据, 测量每份样品黄酮、 多糖含量, 采用K-S样本划分法按4∶1的比例将样本划分为校正集和验证集, 并对分组后的光谱信息进行多元散射校正(MSC)、 标准正态化(SNV)、 平滑(SG)、 一阶导数(FD)、 二阶导数(SD)等光谱预处理, 与原始光谱进行极限学习机(ELM)建模预测效果对比, 确定最佳光谱预处理方法。 采用竞争性自适应重加权算法(CARS)和连续投影算法(SPA)进行黑果腺肋花楸黄酮、 多糖特征光谱波段选取, 将2种方法选取的光谱数据结合偏最小二乘回归法(PLS)、 极限学习机(ELM)、 支持向量机(SVM)进行建模对比, 选出预测效果最佳的算法模型。 结果表明, 7种光谱预处理方法中, MSC对原始光谱的处理效果最佳, 在此处理下黄酮含量预测模型RPD值为6.201 7, 多糖含量预测模型RPD值为5.447 3, 预测模型的误差显著下降。 经CARS、 SPA提取特征光谱后, 进行3种算法的建模结果对比, 确定CARS-ELM为效果最佳的含量预测模型, 其中黄酮含量预测模型的 RC为0.997 2, RMSEC为0.017 5, RP为0.991 2, RMSEP为0.031 1, RPD为10.631 5; 而多糖含量预测模型中的 RC为0.996 5, RMSEC为0.017 3, RP为0.986 7, RMSEP为0.033 7, RPD为8.664 7。 中红外光谱结合化学计量学方法, 尤其是CARS-ELM模型能够更准确地对黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量进行预测, 此方法的开发为黑果腺肋花楸质量评价提供了快速、 简便的方法。

关键词: 黑果腺肋花楸; 中红外光谱; 黄酮; 多糖; 极限学习机
中图分类号:O433.4 文献标志码:A
Fast Prediction of Flavone and Polysaccharide Contents in Aronia Melanocarpa by FTIR and ELM
YANG Cheng-en1,2, LI Meng3, LU Qiu-yu2, WANG Jin-ling4, LI Yu-ting2,*, SU Ling1,*
1. Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi, Ministry of Education, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
2. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
3. Department of Modern Agriculture, Changchun Vocational Institute of Technology, Changchun 130504, China
4. Department of Quality Research, Sinopharm A-Think Pharmaceutical Co., Ltd., Changchun 130600, China
*Corresponding authors
Abstract

Aronia melanocarpa is one kind of berrie richer in flavone than blueberry and has thus been approved as a new food resource largely used in the beverage industry. Flavone and polysaccharides have been revealed to be the main bioactive components in its fruit juice and pomace, affecting its quality. Therefore, their contents were predicted by infrared spectroscopy combined with chemometrics, which provided a basis for establishing a simple and rapid method for the quality detection of A. melanocarpa. A total of 750 infrared spectral data of A. melanocarpa from 15 production areas were collected, and their contents in flavone and polysaccharides were measured. The samples were divided into calibration set and validation set by K-S sample division method in the proportion of 4∶1. The spectral information after grouping was pretreated by multiple scattering correction (MSC), standard normalization (SNV), smoothing (SG), first derivative (FD), second derivative (SD) and other spectral preprocessing, and the best spectrum preprocessing method was determined. The competitive adaptive reweighting algorithm (CARS) and continuous projection algorithm (SPA) were used to select the characteristic spectral bands of flavone and polysaccharides in A. melanocarpa. The spectral data selected by the two wave methods were combined with partial least square regression (PLS), limit learning machine (ELM) and support vector machine (SVM) for modeling and comparison, and the algorithm model with the best prediction effect was selected. The results showed that, MSC had the best effect on the original spectrum among the seven spectral pretreatment methods. Under this treatment, the RPD value of the flavone content prediction model was 6.201 7, and 5.447 3 for the polysaccharide content prediction mode, with the error of the prediction model significantly decreased. After extracting the characteristic spectra by CARS and SPA, the modeling results revealed that the RC, RP, and RPD of the flavone content prediction model were respectively 0.997 2, 0.991 2 and 10.631 5, while they were 0.996 5, 0.986 7 and 8.664 7 respectively for the polysaccharide content prediction model. Therefore, infrared spectroscopy combined with chemometrics methods, especially the CARS-ELM model, can accurately predict the contents of flavone and polysaccharides in A. melanocarpa, and the development of this method provides a fast and simple method for its quality evaluation.

Keyword: Aronia melanocarpa; Infrared spectroscopy; Flavone; Polysaccharide; Extreme learning machine
引言

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)又名不老莓、 野樱莓, 是一种兼具食用、 药用、 园林、 生态等多种价值的经济树种[1], 其原产地为北美地区, 后引入我国东北一带, 黑龙江、 吉林、 辽宁、 河北、 河南等省市已开展规模化种植, 其中东北地区有全国最大的黑果腺肋花楸种植基地[2]。 黑果腺肋花楸富含黄酮、 多糖、 多酚、 蛋白质、 碳水化合物等成分[3], 具有抗氧化、 防治心血管疾病、 降血糖、 抗血小板凝集等多种生物活性。 其中黄酮类化合物具有极强的抗氧化活性[4], 而多糖则具有显著的免疫调节活性[5]。 研究发现不同产地的黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量差异较大[6]。 目前, 黑果腺肋花楸已应用于饮料、 保健食品等行业, 黄酮及多糖含量不仅是决定原料品质的因素之一, 更影响着产品的一致性、 稳定性。 因此, 黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量检测方法的完善, 对规范黑果腺肋花楸原料及产品市场至关重要。

现行标准规定黄酮及多糖含量的检测方法以高效液相色谱、 分光光度比色等方法为主, 现行方法不仅复杂、 周期长、 成本高、 环境污染大, 而且需要逐个成分进行分析。 傅里叶变换红外光谱(Fourier translation infrared spectroscopy, FTIR)技术是一种对有机物快速分析的方法, 具有操作快速、 简便、 样本需求少、 价格低廉、 可同时分析多种成分的优点[7]。 研究证实, 红外光谱结合化学计量学方法可用于对粮食、 蔬果等食物中多种成分进行含量预测。 吴雪辉等采用红外光谱技术对86个油茶籽油脂肪酸含量进行快速检测[8]; 关婷予等将红外光谱与化学计量学方法结合, 建立大米蛋白粉多组分含量的模型, 实现对大米蛋白粉蛋白质、 脂肪和水分含量的同时检测[9]; Sylvio Barbon Junior等采用红外光谱技术结合机器学习方法, 实现了对小麦粉品质相关成分的多目标成分含量的预测[10]

本研究对15个产区共750份黑果腺肋花楸样品进行黄酮、 多糖含量检测, 采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术采集样品的红外光谱数据, 并采用化学计量学方法进行数据建模, 以建立一种可快速、 准确的进行黑果腺肋花楸黄酮、 多糖2种主要活性化合物含量检测的方法, 为黑果腺肋花楸产业的健康发展提供技术支持。

1 实验部分
1.1 材料与设备

收集黑龙江省七台河、 伊春、 双鸭山、 佳木斯等4市; 吉林省白山、 蛟河、 通化、 延边朝鲜族自治州等4市、 州; 辽宁省鞍山、 大连、 丹东、 锦州等4市; 河北省秦皇岛市、 河南省安阳市以及俄罗斯等15个地区的黑果腺肋花楸果实, 每个地区样品50份, 共750份。

Nicolet is10 傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo scientific), HY-12型压片机(天津天光光学仪器有限公司), DKZ恒温水浴锅(上海一恒技术有限公司), 8453紫外分光光度计(美国Agilent), CS-700型超帅高速多功能粉碎机(浙江武义海纳电器有限公司), 200目不锈钢筛等。

1.2 红外光谱数据采集

黑果腺肋花楸果实冷冻干燥、 粉碎、 过200目筛。 分别精密称取1.8 mg样品, 加入190 mg溴化钾于75 ℃恒温干燥箱内干燥6 h, 研磨均匀, 压片, 红外光谱仪扫描样品400~4 000 cm-1间红外光谱, 设定分辨率4 cm-1, 扫描次数16次, 重复3次取平均光谱。 光谱采集过程中, 保持室内温度25 ℃, 湿度35%RH。

1.3 黑果腺肋花楸黄酮含量测定

黑果腺肋花楸果实冷冻干燥, 粉碎后过筛, 加入体积分数60%乙醇溶液50 mL, 40 ℃超声提取50 min, 过滤分离, 残渣中加入体积分数60%的乙醇溶液40 mL, 40 ℃超声提取20 min, 过滤分离, 合并提取液, 100 mL容量瓶定容, 备用。

吸取2.0 mL提取液于25 mL具塞比色管中, 加入体积分数60%乙醇溶液至5.0 mL, 加50 g· L-1亚硝酸钠溶液1 mL, 放置6 min, 加入100 g· L-1硝酸铝溶液1.5 mL, 放置6 min, 加入200 g· L-1氢氧化钠溶液4 mL, 体积分数60%乙醇溶液定容, 摇匀, 放置15 min。 芦丁为标准品, 100 g· L-1不添加硝酸铝溶液的样品提取液为空白对照, λ 510 nm测定吸光度。 根据回归方程计算黑果腺肋花楸果实的黄酮含量。

1.4 黑果腺肋花楸多糖含量测定

称取0.25 g冻干、 粉碎、 过筛后的黑果腺肋花楸果实粉末置于250 mL锥形瓶中, 加100 mL蒸馏水, 热水提取3 h。 冷却后过滤, 滤渣经蒸馏水洗涤, 合并滤过液及洗涤液, 定容至250 mL提取液备用。

吸取1 mL提取液, 加入1 mL苯酚溶液, 混匀, 加入98%硫酸, 混匀, 室温放置30 min。 葡萄糖为标准品, 提取液为空白对照, λ 490 nm测定吸光度值。 根据回归方程计算黑果腺肋花楸果实的多糖含量。

1.5 光谱预处理与样品划分

由于样品本身、 光散射与基线漂移等因素, 采集的光谱信息会出现随机偏差。 因此, 原始光谱需经过光谱预处理方法进行修正。 在与原始光谱对比的基础上, 使用The Unscrambler X 10.4软件对采集的原始光谱进行多元散射校正(MSC)、 标准正态变量变换(SNV)、 平滑(SG)、 一阶导数(FD)、 二阶导数(SD)等处理。 采用K-S划分法(kennard-stone, K-S), 对符合样本分布规律并具有代表性的校正集光谱数据进行划分[11]

1.6 光谱特征信息提取

1.6.1 竞争性自适应重加权采样法

竞争性自适应重加权采样法(competitive adapative reweighted sampling, CARS)是参照达尔文的“ 适者生存” 理论, 结合PLS与蒙特卡洛采样的光谱特征信息提取方法[12], 通过减去权重小的波长点, 保留绝对值大的波长点, 找出交互验证均方根误差(root mean square error of cross validation, RMSECV)最低的子集, 从中选出最优变量组合。

1.6.2 连续投影算法

连续投影算法(successive projections algorithm, SPA)是一种采用矢量空间共线性最小化原则的光谱特征波段筛选算法, 可以从冗长的光谱数据中提取出既具有代表性又冗余信息含量最少的特征波长。

1.7 模型构建

1.7.1 偏最小二乘回归法

偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLS)是一种多元统计与主成分分析相结合的数据分析方法[13]。 该方法聚焦于在变量系统中提取最具有代表性与解释性的新变量, 从而进行建模找到最佳回归模型。

1.7.2 极限学习机

极限学习机(extreme learning machine, ELM)是一种基于经典神经网络改进后的快速学习算法[14]。 该方法在训练阶段采用随机的输入层权值和偏差, 能够以极快的速度进行较好泛化, 具有选择参数少、 学习效果好、 适用性强的特点。

1.7.3 支持向量机

支持向量机(support vector machine, SVM)是常见的光谱定量分析的方法之一[15]。 该方法通过把数据从低维度映射到高维度特征空间, 再通过线性与非线性映射关系构造一个N维超平面来解决数据分析问题。

1.7.4 模型评价标准

以校正集决定系数(coefficient of determination of calibration set, RC)、 验证集决定系数(coefficient of determination of prediction set, RP)、 校正均方根误差(root mean square error of calibration, RMSEC)、 预测均方根误差(root mean squared error of prediction, RMSEP)和相对分析误差(residual predictive deviation, RPD)评价模型的预测能力, 其中RCRP越接近于1, RMSE越小和RPD> 3时, 表明模型预测效果越好。

2 结果与讨论
2.1 红外光谱分析

图1为所有样品黑果腺肋花楸原始光谱图。 由图1分析样品红外光谱图, 不同产地的样品在3 340 cm-1附近均存在羟基— OH伸缩振动, 2 922 cm-1附近存在亚甲基— CH3的伸缩振动、 1 730 cm-1附近存在脂类和酸类分子的C=O的伸缩振动、 1 629 cm-1附近存在共轭C=O的伸缩振动, 1 614、 1 515 cm-1存在芳环骨架振动吸收峰, 这些特征峰与其含有的黄酮类物质花青素的结构吻合, 在1 415 cm-1附近存在C— O— H的弯曲振动、 1 359 cm-1处存在C— H的弯曲振动、 1 230 cm-1附近存在C— O的伸缩振动、 1 050 cm-1附近存在C— C的伸缩振动、 并且在890 cm-1附近存在β -构型多糖特征吸收峰。 样品的光谱曲线重叠严重, 但各地区样品吸收响应略有差异, 结合红外光谱丰富的化学成分信息, 为后续建模处理提供了条件。

图1 黑果腺肋花楸原始光谱图Fig.1 Original spectrogram of Sorbus mandshurica

2.2 不同产区黑果腺肋花楸黄酮和多糖含量统计

按照校正集和验证集样品数量比例4∶ 1, 用K-S法划分750份样品, 得校正集600个(不同地区黑果腺肋花楸样品各40份), 验证集150个(不同地区黑果腺肋花楸样品各10份)。 校正集与验证集样品黄酮与多糖含量的分布情况如表1所示。

表1 校正集与验证集样品黄酮与多糖含量的分布情况 Table 1 Distribution of flavone and polysaccharide contents in samples of calibration set and validation set
2.3 预处理方法对比

运用ELM对不同预处理方法下的红外数据进行模型对比, 得不同预处理下黄酮含量ELM模型的建模结果(表2)和不同预处理下多糖含量ELM模型的建模结果(表3)。 由表2表3可知, MSC预处理所建立的含量预测模型效果最佳, 其中黄酮含量预测模型的训练集RC为0.974, RMSEC为0.053 2, 测试集RP为0.974, RMSEP为0.053 4, RPD为6.201 7; 多糖含量预测模型的训练集RC为0.956 7, RMSEC为0.060 8, 测试集RP为0.966 3, RMSEP为0.053 6, RPD为5.447 3。 故将MSC预处理后的光谱作为样品最优预处理光谱。

表2 不同预处理下黄酮含量ELM建模结果 Table 2 ELM modeling results of flavonoids content under different pretreatment
表3 不同预处理下多糖含量ELM建模结果 Table 3 ELM modeling results of polysaccharide content under different pretreatment
2.4 光谱特征信息提取

2.4.1 CARS分析

选用CARS算法对MSC光谱数据进行特征波长筛选, 设置蒙特卡罗采样次数为100次, 黄酮、 多糖含量对应的光谱波长筛选结果如图2、 图3。

图2 黄酮含量对应的光谱波长筛选过程
(a): 波长数量变化个数; (b): RMSECV变化趋势; (c): 变量回归系数路径
Fig.2 Spectral wavelength screening process corresponding to flavonoid content
(a): Number of wavelength changes; (b): Change in root mean square error of cross-inflammation; (c): Trends in RMSECV

图3 多糖含量对应的光谱波长筛选过程
(a): 波长数量变化个数; (b): RMSECV变化趋势; (c): 变量回归系数路径
Fig.3 Spectral wavelength screening process corresponding to polysaccharide content
(a): Number of wavelength changes; (b): Change in root mean square error of cross-inflammation; (c): Trends in RMSECV

由图2可知, 当运行次数在1~42之间, 特征波长数量急速下降, 并在第42次时RMSECV值达到最低。 遵循RMSECV值最小原则, 选择第42次采样获得的248个波长变量子集作为黄酮含量对应的光谱最优波长变量数。 最优波长变量对应黑果腺肋花楸黄酮含量最佳光谱区域为(Ⅰ : 1 124~1 143 cm-1; Ⅱ : 1 478~1 489 cm-1、 Ⅲ : 1 637~1 647 cm-1、 Ⅳ : 2 913~2 917 cm-1), 其中1 124~1 143 cm-1附近存在C— O拉伸; — CH2伸缩振动, 1 478~1 489 cm-1附近存在— CH2、 1 637~1 647 cm-1附近存在C=C、C=O伸缩振动、 2 913~2 917 cm-1附近存在— CH2, 其中1 637~1 647和1 478~1 489 cm-1处的吸收属于黄酮类化合物的特征。

由图3(a, b, c)可知, 当运行次数在1~47之间, 特征波长数量急速下降, 并在第47次时RMSECV值达到最低。 遵循RMSECV值最小原则, 选择第47次采样获得的163个波长变量子集作为多糖含量对应的光谱最优波长变量数。 最优波长变量对应黑果腺肋花楸多糖含量最佳光谱区域为(Ⅰ : 885~886 cm-1; Ⅱ : 1 068~1 070 cm-1; Ⅲ : 1 334~1 345 cm-1; Ⅳ : 1 489 cm-1)。 885~886 cm-1附近(1, 3)-β 葡聚糖、 1 068~1 070 cm-1附近伯醇伸缩振动、 1 334~1 345 cm-1附近C— H的伸缩振动、 1 489 cm-1附近C— H的变形振动。

2.4.2 SPA分析

采用SPA对MSC光谱数据进行特征波长的筛选, 设定波长数为1~30, 黄酮、 多糖含量对应的光谱波长筛选结果如图4、 图5。

图4 黄酮含量对应的光谱波长筛选过程
(a): RMSE的变化趋势; (b): 波长筛选结果
Fig.4 Spectral wavelength screening process corresponding to flavonoid content
(a): Trends in RMSE changes; (b): Wavelength screening results

图5 多糖含量对应的光谱波长筛选过程
(a): RMSE的变化趋势; (b): 波长筛选结果
Fig.5 Spectral wavelength screening process corresponding to polysaccharide content
(a): Trends in RMSE changes; (b): Wavelength screening results

由图4可知经过迭代后, RMSE最小值为0.106 7, 最终选取11个波长数作为黄酮含量对应的光谱最优波长变量数。 光谱选取波长变量如图4(b)所示, 11个波长点所对应的特征波长分别为17、 591、 789、 992、 1 594、 2 239、 2 421、 2 828、 3 482、 3 912和4 598 cm-1

由图5可知经过迭代后, RMSE最小值为0.122 3, 最终选取12个波长数作为多糖含量对应的光谱最优波长变量数。 光谱选取波长变量如图5(b)所示, 12个波长点所对应的特征波长分别为48、 2 268、 2 437、 2 585、 2 680、 2 742、 2 825、 3 219、 3 693、 4 506、 6 645和7 259 cm-1

2.5 模型对比

将经CARS, SPA分析处理后的红外光谱数据作为输入变量, 建立PLS、 ELM、 SVM的黄酮和多糖含量预测模型。

2.5.1 黄酮含量预测模型

不同模型对黄酮含量的预测效果对比如表4所示, 最优黄酮含量预测结果如图6所示。 由表4可知, SPA-ELM、 CARS-ELM、 SPA-SVM、 CARS-SVM模型预测效果较好, 校正集和验证集的RCRP均高于0.976, 其中SPA-ELM、 CARS-ELM的RPD值相对较高。 SPA-ELM校正集的RMSEC为0.016 9低于CARS-ELM校正集的RMSEC值0.017 5, 相反SPA-ELM验证集的RMSEP值0.033 1高于CARS-ELM验证集的RMSEP值0.031 1。 但CARS-ELM的RC为0.997 2和RP为0.991 2均高于SPA-ELM的RC为0.996 3和RP为0.99, 同时CARS-ELM的RPD值为10.631 5略高于SPA-ELM的RPD值10.096。 综合模型预测稳定性和验证集效果选择CARS-ELM模型作为最优的黑果腺肋花楸黄酮含量预测模型。

表4 不同模型对黄酮含量的预测 Table 4 Prediction of flavone content by different models

图6 最优黄酮含量预测结果Fig.6 Prediction results of optimal flavone content

2.5.2 多糖含量预测模型

不同模型对多糖含量的预测结果如表5, 最优多糖含量预测结果如图7所示。 由表5可知, SPA-ELM、 CARS-ELM、 CARS-SVM模型预测效果较好, 校正集和验证集的RCRP均高于0.98。 其中CARS-ELM模型的预测效果最好, 校正集的RC为0.996 5, RMSEC为0.017 3, 验证集RP为0.986 7, RMSEP为0.033 7, RPD为8.664 7。 因此, 选择CARS-ELM模型作为最优的黑果腺肋花楸多糖含量预测模型。

表5 不同模型对多糖含量的预测 Table 5 Prediction of polysaccharide content by different models

图7 最优多糖含量预测结果Fig.7 Prediction results of optimal polysaccharide content

3 结论

运用红外光谱技术结合化学计量学方法建立了黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量快速预测方法。 具体结论如下:

(1) 将不同预处理方法后的红外光谱数据结合ELM建模对比, 发现MSC光谱预处理方法效果最优, 黄酮含量预测模型RPD值为6.201 7, 多糖含量预测模型RPD值为5.447 3, 能有效减少含量预测模型的误差。

(2)对比2种光谱特征提取方法及3种含量预测建模方法确定CARS-ELM模型为最佳的含量预测模型。 其中, 黄酮含量预测模型的RC为0.997 2, RMSEC为0.017 5, RP为0.991 2, RMSEP为0.031 1, RPD为10.631 5; 多糖含量预测模型RC为0.996 5, RMSEC为0.017 3, RP为0.986 7, RMSEP为0.033 7, RPD为8.664 7。 说明CARS可更有效地消除冗余信息, 提高光谱信息与黄酮、 多糖含量之间的相关性, 而ELM模型相比于其他模型建立方法, 对黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量预测准确度更高。

(3)红外光谱结合化学计量学方法, 特别是CARS-ELM模型能够更准确地对黑果腺肋花楸黄酮、 多糖含量进行预测, 此方法的开发也为后期开发便携式黑果腺肋花楸品质检测仪器提供了思路。

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