烟叶、 烟梗原料与烟草制品1^#— 7^#由云南省昆明市某烟草公司提供, 烟草浸提液参考国家标准YC/T31— 1996处理得到。

所使用的所有化学品, 包括乙酸、 盐酸、 间苯三酚等均为分析级, 可由商业途径获得。 标准糖样品D-葡萄糖(99%)与D-木糖 (99%) 为生化试剂, 购自上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2.1 标准糖溶液的配制

分别配制10.00 mmol· L^-1的葡萄糖与木糖储备母液, 稀释得到浓度范围为0.01~2 mmol· L^-1的标准溶液。 总糖溶液由上述两种糖液随机等体积混合得到。

1.2.2 水解反应

移取1 mL标准糖或样品溶液于25 mL具塞比色管中, 加入4 mL浓盐酸与1 mL冰醋酸, 摇匀后置入沸水浴中反应40 min, 反应完成后立即取出试管, 放入冷水中冷却5 min, 以1 mL去离子水进行相同的水解反应为空白样。

1.2.3 显色剂制备及显色反应

制备间苯三酚/乙醇显色剂: 准确称取0.4 g 间苯三酚溶于20 mL无水乙醇中, 混合均匀后静置, 待溶解完全后备用, 每次实验现配现用。

显色反应: 移取1 mL显色剂溶液加入到冷却好的水解液中, 迅速摇匀后置于Agilent-8453型紫外-可见分光光度计中进行全波长扫描, 以空白样进行上述相同的反应过程作为参比。

1.2.4 高效液相色谱(HPLC)法对比

方法对比采用高效液相色谱法, 仪器工作条件为采用紫外检测器和岛津C18分析柱(Shimadzu, 4.6 mm× 250 mm, 5 μ m), 测量在Dionex UltiMate 3000系统(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)上进行; 柱温45 ℃; 流动相为纯乙腈与0.05 mol· L^-1磷酸缓冲溶液(pH 6.8); 进样量1 μ L; 紫外检测波长为245 nm。

在常温条件下, 间苯三酚可以与甲醛在酸性介质中反应生成黄色化合物^{[10, 11]}。 证实了与间苯三酚发生显色反应的官能团主要为醛基, 因此葡萄糖与木糖脱水形成的糠醛和5-羟甲基糠醛都应能够与间苯三酚发生显色反应, 特征峰强度差异主要归因于二者结构上的不同。 通过借鉴间苯三酚与甲醛的显色机理, 在此提出了常温酸性条件下间苯三酚对于5-羟甲基糠醛、 糠醛的显色机理猜想, 如图1所示。 在酸性条件下, H⁺首先活化5-羟甲基糠醛或糠醛的羰基, 从而使得一分子醛基和一分子间苯三酚进行亲电取代, 生成间苯三酚的糠醛衍生物(化合物3)。 在过量H⁺作用下, 化合物3中羟基上的氧作为亲核试剂继续进攻缺电子的氢离子, 使羟基变成一个易离去基团, 以水的形式脱离并得到中间产物4。 中间产物4可能是由于五个双键和碳正离子的缺电子p— π 共轭而对瞬态黄色做出反应的物种^[12]。 最终产物5没有很强的共轭性, 因此颜色会逐渐褪去^[10]。

图1

Fig.1

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	图1 间苯三酚法显色机理Fig.1 Speculation on the color development mechanism of phloroglucinol

本工作旨在解决间苯三酚检测体系中对葡萄糖显色效果不佳的技术问题。 传统的间苯三酚显色法中, 木糖在高温酸性条件下转化为糠醛, 并与间苯三酚发生缩合反应, 生成红色的2, 3’ , 4, 5’ , 6-五羟基联苯产物^[13]。 然而, 由于糖组分和间苯三酚长时间暴露在浓酸溶液当中, 显色产物较稳定但检测灵敏度会有所降低^[14]。 此外, 传统间苯三酚法加入了大量冰醋酸和强脱水性的浓硫酸, 起到催化作用以减少反应时间。 结合前人的研究, 葡萄糖在水中主要为稳定的吡喃式结构, 难以形成糠醛衍生物, 相比木糖需要更长的反应时间^[15]。 因此, 基于2.1的显色机理, 本工作采用反应条件更加温和的浓盐酸和减少水解步骤中冰醋酸用量以延长反应时间, 使葡萄糖充分转化。 将显色反应置于水解完成之后并在常温下进行, 以提高检测灵敏度。 这些步骤理论上可以增加间苯三酚检测体系下葡萄糖与木糖的显色结果差异, 从而使间苯三酚法应用于葡萄糖的检测。

将0.1 mmol· L^-1木糖与葡萄糖溶液经1.2.2与1.2.3步骤后, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标分别绘制在可见光区的吸收光谱图, 结果如图2所示。 木糖和葡萄糖与间苯三酚显色剂反应后, 分别在波长478和470 nm处有最大吸收, 符合2.1对于显色机理的猜想。 木糖、 葡萄糖与间苯三酚发生显色反应的官能团为脱水反应生成的醛基, 二者由于结构差异导致特征吸收峰产生偏移。 而相同浓度的木糖与葡萄糖溶液水解后, 木糖表现的特征吸收比葡萄糖要高得多, 因此选择478 nm作为测定木糖的波长, 470 nm作为测定葡萄糖的波长。 为了使吸收峰强度适宜, 在后续优化实验中选择0.1 mmol· L^-1木糖溶液、 1.0 mmol· L^-1葡萄糖溶液进行。

图2

Fig.2

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	图2 木糖和葡萄糖溶液的紫外可见原始光谱Fig.2 UV-Vis original spectrum of xylose and glucose solution

为对脱水过程参数进行优化, 对浓酸用量、 水解时间、 水解温度三个参数进行最优条件探讨, 实验结果如图3所示。 为探索最适合的浓盐酸用量, 分别测定葡萄糖与木糖溶液加入1~5 mL的浓盐酸进行水解后的吸光度, 结果如图3(a)所示。 在浓盐酸用量在3.5~4 mL之内葡萄糖和木糖溶液均有较高的吸光度, 为了保证充分反应, 选择4 mL作为浓盐酸的最佳添加量。

图3

Fig.3

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	图3 (a)不同浓盐酸用量; (b)不同水解时间; (c) 不同水解温度下葡萄糖/木糖溶液的吸光度变化情况Fig.3 The absorbance of glucose/xylose solutions at (a) different amounts of concentrated hydrochloric acid; (b) different hydrolysis time; (c) different hydrolysis temperatures

不同水解时间对显色结果的影响如图3(b)所示。 可以看出, 当水解时间从10 min增加到30 min时, 吸光度呈现快速的上升趋势并在40 min时达到顶点, 这是由于浓盐酸所提供的温和反应环境导致反应时间延长所致。 当水解时间超过40 min后, 吸光度呈下降趋势; 这是由于糠醛与5-羟甲基糠醛在高温条件下稳定性较差, 容易发生交叉聚合与自聚合反应^[16]。 此方法对应的最佳水解时间为40 min。

温度是影响糖组分脱水反应高效、 稳定进行的另一重要条件。 不同水解温度下, 葡萄糖/木糖的紫外吸收结果如图3(c)所示。 随着温度从60 ℃升到100 ℃, 糖组分样品溶液的吸光度也在不断升高。 当水解温度达到110 ℃时(反应在高压蒸汽锅中进行), 水解液的吸光度却显著下降, 并且发现水解液变浑浊。 可以猜测在高压高温条件下部分糖组分可能发生了碳化。 因此, 本实验确定了100 ℃沸水浴为最优的水解温度。

配制不同浓度的间苯三酚/乙醇溶液, 研究显色剂浓度对测定结果的影响, 结果如图4(a)所示。 间苯三酚浓度为2%时, 样品溶液可以达到最大显色效果。 实验过程中还观测到当过度添加间苯三酚时(> 5.0%), 样品吸光度会有较大幅度的降低, 结合图1的猜测, 过量的间苯三酚会促进最终产物(化合物5)的生成, 导致显色效果降低。

图4

Fig.4

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	图4 (a)不同显色剂浓度; (b)不同显色时间下葡萄糖/木糖溶液的紫外吸光度变化情况Fig.4 The absorbance of glucose/xylose solutions at (a) different chromogenic concentrations; (b) different chromogenic time

检测过程中, 还观测到在加入显色剂的瞬间, 水解液颜色迅速从无色变为黄色, 然后又在0.5 h内逐渐变为无色, 这一现象与Li^[10]的实验现象一致。 为探究该显色反应的稳定性, 分别测定葡萄糖和木糖在不同显色时间的吸光度, 结果如图4(b)所示。 显色反应在0~2 min之内保持稳定, 但在2 min之后显色效果迅速下降, 在10 min时显色效果下降了接近60%。 可见, 显色物质作为一种反应中间体并不稳定, 在添加显色剂之后必须快速进行检测; 1~2 min之内为最佳的检测时间。

由2.1可知, 含有醛基的有机物质可能与显色反应试剂中的间苯三酚显色, 对戊糖和己糖的测定产生干扰。 主要探讨了提取液中可能含量较高的木素对测定结果的影响。 将硫酸盐木素采用酸析法^[17]分离纯化后添加到混糖溶液中, 按1.2的步骤进行检测, 由图5的光谱结果可以明显发现, 木素并未与间苯三酚发生反应, 而影响显色反应。 因此可得出结论, 木素对本方法分析结果没有干扰。

图5

Fig.5

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	图5 木素干扰性分析Fig.5 Lignin interference analysis

分别配制浓度为0.1~2.0和0.01~1.0 mmol· L^-1的葡萄糖与木糖的标准溶液(图6)。 由图6(a)可知, 在葡萄糖浓度范围在0.1~0.80 mmol· L^-1时标准曲线的线性关系良好, 其方程为Y=1.413 8x-0.019 6, 相关系数R²=0.996 1。 由图6(b)可知, 在木糖浓度范围在0.15~0.40 mmol· L^-1时标准曲线的线性关系良好, 其方程为Y=4.423 9x+0.010 1, 相关系数R²=0.996 2。 由于该方法的灵敏度较高, 当糖溶液的浓度较高时吸光度会偏离朗伯-比尔定律, 可以进行适当的稀释后再进行检测。

图6

Fig.6

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	图6 标准关系曲线 (a): 葡萄糖; (b): 木糖Fig.6 Standard relationship curve (a): Glucose; (b): Xylose

本方法可显著提高葡萄糖的检测灵敏度。 然而, 木糖也会在该条件下显色, 且显色后的特征吸收峰位置十分接近, 如图7(a)所示。 显然, 测定上述两种糖组分时, 会相互影响彼此的测量准确性。 图7(b)为不同浓度的葡萄糖和木糖显色后的可见光谱, 可以看出相同摩尔浓度的葡萄糖和木糖经显色反应后没有一个固定的等摩尔吸收波长, 因此难以采用常用的双波长技术建立准确的量化关系。 为了实现同时分析两种糖组分与显色结果的交互作用, 需要采用多维数据分析方法进行校正。

图7

Fig.7

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	图7 (a)单糖与混糖的紫外可见原始光谱; (b) 0.1~1.0 mmol· L-1葡萄糖(间隔0.1)与0.05~0.5 mmol· L-1木糖(间隔0.05)的紫外可见原始光谱Fig.7 (a) UV-Vis original spectra of monosaccharides and mixed sugars; (b) UV-Vis original spectra of 0.1~1.0 mmol· L-1 glucose (spaced 0.1) and 0.05~0.5 mmol· L-1 xylose (spaced 0.05)

使用偏最小二乘法回归(PLSR)对烟草样品中混合糖对应的紫外吸收光谱数据进行了分析, 分析过程在SIMCA-P 14.1 软件上实现。 设20组不同混糖溶液中木糖与葡萄糖的浓度构成的数据矩阵X为自变量, 样品对应的紫外光谱吸光度信号值构成的数据矩阵Y为因变量。 则自变量数据集X={x₁, x₂}_{20× 2}和因变量数据集Y={y₁, y₂, …, y₂₀}_{20× 1}可表示为如式(1)所示的线性模型

Y=XZ+E(1)

式(1)中, Z为回归系数矩阵, E为残差矩阵, 则其最小二乘解为式(2)

Z=(XTX)-1XTY(2)

将浓度数据矩阵X和吸光度信号值矩阵Y分别采用NIPALS算法^[18]做双线性分解, 分解成的特征向量表达式为

X=TPT+F(3)

Y=UQT+E(4)

式(3)和式(4)中, T和U分别为矩阵X和Y的得分矢量, P和Q则分别为它们的特征矢量, F为残差矩阵。 其中, T和U需满足尽可能多的携带浓度数据矩阵、 吸光度信号值矩阵中的变异信息, 且其相关程度均达到最大的要求^[19]。

为了评价上述模型的精确度, 通过相同实验条件下得到的预测数据和实际数据的内外部验证分析, 如图8(a)所示。 可知经所建立模型预测的数据与实际实验结果高度一致(R²为0.994 7)。 说明在本文选取的实验参数范围内, 该模型可以有效地预测混糖中木糖与葡萄糖的含量。 为了进一步分析预测模型的稳健性, 研究了预测值和测量值之间的相对偏差(RD), 如图8(b)所示。 可以看出, 实际的实验数据模型预测的数值之间的相对偏差大多在10%以内, 且在零线附近随机分布。 该检验结果说明了所建立的模型具有良好的稳健性, 可以精准应用于改进后的间苯三酚法定量测量混糖溶液中木糖与葡萄糖的含量。

图8

Fig.8

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	图8 (a) PLSR模型预测数据与实测数据的相关性分析; (b) 吸光度预测值与实测值之间的偏差值Fig.8 (a) Correlation analysis between the predicted and measured data of the PLSR model; (b) Deviation values between the predicted and measured values of absorbance

对本分析方法的灵敏度、 精密度和回收率进行了逐一验证。

方法的灵敏度测定方法: 取最低浓度标准工作液, 重复测定10次的标准偏差(SD), 葡萄糖溶液为0.000 6 mmol· L^-1, 木糖溶液为0.002 4 mmol· L^-1, 按照3倍SD、 10倍SD计算得出本方法对葡萄糖溶液的检出限和定量限分别为0.001 7和0.005 7 mmol· L^-1, 对木糖溶液的检出限和定量限分别为0.007 2和0.024 mmol· L^-1, 表明该方法的灵敏度令人满意。

精密度的测定将葡萄糖和木糖的A— C三个样品分别连续检测3次, 结果见表1。 可知, 批内变异系数的范围为0.69%~3.03%, 说明该方法的精密度高。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 方法的精密度 Table 1 Precision 样品编号 含量/(mmol· L-1) 平均值/ (mmol· L-1) 批内变异 系数/% 0.145 4/0.144 4/0.142 5 0.144 1 1.04 葡萄糖 0.197 2/0.191 1/0.187 3 0.190 4 1.45 0.245 4/0.240 9/0.235 2 0.240 5 2.13 0.128 6/0.126 7/0.124 0 0.126 4 1.81 木糖 0.198 8/0.197 5/0.196 1 0.197 5 0.69 0.236 8/0.248 9/0.250 3 0.245 4 3.03 0.316 7/0.325 4/0.325 8 0.322 6 1.59 混糖 0.567 0/0.571 2/0.571 0 0.569 7 0.42 0.911 6/0.901 9/0.888 9 0.900 8 1.26

表1 方法的精密度 Table 1 Precision

回收率的检验通过在已知含量的样品溶液进行相同实验, 比较实测值和理论值得到。 实验结果如表2所示, 表明采用本方法所测总糖、 木糖和葡萄糖的回收率范围均在95%~105%内, 说明该检测方法结果准确、 可靠。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 加标回收率 Table 2 Standard recovery rate 样品 编号 总糖 葡萄糖 木糖 理论值/ (mmol· L-1) 测定值/ (mmol· L-1) 回收 率/% 理论值/ (mmol· L-1) 测定值/ (mmol· L-1) 回收 率/% 理论值/ (mmol· L-1) 测定值/ (mmol· L-1) 回收 率/% 1 0.438 0.427 102.85 0.144 0.143 99.31 0.120 0.120 99.67 2 0.484 0.482 100.41 0.194 0.190 97.94 0.170 0.172 101.17 3 0.837 0.864 96.72 0.244 0.236 100.01 0.220 0.224 101.82

表2 加标回收率 Table 2 Standard recovery rate

为了验证本方法与其他方法的测量结果一致性, 采用了常规的PMP衍生化高效液相色谱(HPLC)法^[20]对1— 7组不同烟草制品中的糖含量进行了测定和对比, 实验结果为三次实验的平均值(表3)。 烟草薄片与卷烟烟丝等烟草制品在经过加工工艺后, 基本不含有木糖, 只需检测葡萄糖含量。 这一点通过图7(a)的出峰位置即可初步判断, 使用图6(a)的标准曲线即可准确测量葡萄糖含量。 烟草原料和再造烟叶中的木糖含量较高, 需要使用本方法建立的PLS模型预测葡萄糖与木糖含量。 本方法与HPLC法测定的9个样品中葡萄糖与木糖含量相对偏差均在10%以内, 表明本方法可用于烟草行业中测定烟草制品与原料中的葡萄糖和木糖含量。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 两方法比较实验结果 Table 3 Comparison of experimental results between the two methods 样品 编号 本方法测糖/ (mmol· L-1) HPLC法测糖/ (mmol· L-1) 相对偏差 样品 编号 本方法测糖/ (mmol· L-1) HPLC法测糖/ (mmol· L-1) 相对偏差 葡萄糖 木糖 葡萄糖 木糖 RD1/% RD2/% 葡萄糖 木糖 葡萄糖 木糖 RD1/% RD2/% 1 0.29 ND 0.28 ND 3.69 - 6 0.75 0.10 0.67 0.08 9.96 4.13 2 0.53 ND 0.54 ND -2.09 - 7 0.46 0.05 0.44 0.05 4.33 2.41 3 0.49 ND 0.47 ND 3.11 - 8 0.48 0.09 0.45 0.07 5.69 8.85 4 0.51 ND 0.46 ND 4.79 - 9 0.21 0.18 0.15 0.16 6.44 5.17 5 0.43 ND 0.41 ND 5.41 注: ND表示未检测到; 样品编号所代表样品具体信息为: 1— 4国内不同品牌的烟草薄片样品; 5国内某品牌卷烟烟丝样品; 6国内某烟梗原料; 7国内某品牌造纸法再造烟叶; 8— 9自制混糖溶液

表3 两方法比较实验结果 Table 3 Comparison of experimental results between the two methods