2D-COS是在获取外扰变量t作用下样品动态光谱的基础上, 计算扰动光谱与参考光谱的相关谱, 将一维光谱扩展到二维空间, 有利于分析扰动作用下不同光谱特征变化。 动态光谱是二维相关光谱方法的基础, 可以表示为扰动量与波数的函数y(ν , t), 其中t代表外扰变量, ν 是波数。 当t在T_min和T_max之间变化时, 测得光谱强度y, 则动态光谱可定义为y˜(ν , t), 如式(1)所示。

y˜(ν, t)=y(ν, t)-y¯(ν, t)Tmin≤t≤Tmax0otherwise(1)

式(1)中,y¯(ν , t)是测量系统的参考光谱。 在2D-COS中, 一般选取平均光谱作为参考光谱, 如式(2)所示

y¯(ν)=1Tmax-Tmin∫TminTmaxy(ν, t)dt(2)

采用2D-COS可以得到同步光谱及异步光谱。 其中同步光谱强度ϕ (ν ₁, ν ₂)等于不同波数ν ₁, ν ₂的动态光谱的强度之间的矢量积, 如式(3)所示

ϕ(ν1, ν2)=1m-1∑i=1my˜(ν1, ti)y˜(ν2, ti)(3)

异步光谱强度Ψ (ν ₁, ν ₂)等于不同波数ν ₁, ν ₂的动态光谱的强度的Hilbert-Noda矩阵的矢量积, 如式(4)所示

Ψ(ν1, ν2)=1m-1∑i=1my˜(ν1, ti)∑i=1mNiky˜(ν2, tk)(4)

式(4)中, N_ik为Hilbert-Noda矩阵, 其矩阵元如式(5)所示

Nik=0j=k1π(k-j)j≠k(5)

在光谱分析应用中, 二维相关光谱常表示为等高线图的形式便于理解与分析, 如图1所示。 其中, 同步相关谱[图1(a)]主要反映原始光谱中两个波数变量处光谱强度变化的相似性, 在形式上关于主对角线对称。 主对角线上的峰称自相关峰(Auto peak), 如图1(a)中的四个自相关峰A、 B、 C、 D所示, 总为正值, 代表对应波数处光谱强度的变化的相关性。 处于对角线以外的峰称为交叉峰(Cross peak), 如图1(a)中的A与C、 B与D为两组交叉峰, 交叉峰反映分子内或分子间相互作用, 当扰动作用下的分子内或者分子键相互作用导致两个波数处对应的光谱强度变化方向一致时, 对应的交叉峰值为正值; 当二者变化方向不一致时, 交叉峰值为负值。

图1

Fig.1

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	图1 二维相关光谱的等高线图 (a): 同步相关谱; (b): 异步相关谱Fig.1 Contour map of two-dimensional correlation spectrum (a): Synchronous spectrum; (b): Asynchronous spectrum

异步相关谱[图1(b)]反映原始光谱中两个波数变量处光谱强度变化速率的差异性。 从形式上关于主对角线反对称, 表现为交叉峰。 如图1(b)所示。 异步相关光谱的交叉峰代表对应两个波数变量处光谱强度变化速率差异, 可为正值或负值, 需要结合相同位置处的同步峰进行解释。 在原始光谱中的吸收峰相近或发生重叠的两个官能团, 对于扰动出现不同的动态响应, 在二维异步相关谱中可通过交叉峰提高谱图的分辨率。 对同步谱与异步谱的解释如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 对二维相关光谱结果的解释 Table 1 Interpretation of two-dimensional correlation spectra 同步峰特征 交叉峰特征 解释 ϕ (ν 1, ν 2)>0 Ψ (ν 1, ν 2)>0 高波数ν 1处的光谱强度变化先于ν 2处发生, 且变化方向相同 ϕ (ν 1, ν 2)<0 Ψ (ν 1, ν 2)<0 高波数ν 1处的光谱强度变化先于ν 2处发生, 且变化方向相反 ϕ (ν 1, ν 2)>0 Ψ (ν 1, ν 2)<0 高波数ν 1处的光谱强度变化后于ν 2处发生, 且变化方向相同 ϕ (ν 1, ν 2)<0 Ψ (ν 1, ν 2)>0 高波数ν 1处的光谱强度变化后于ν 2处发生, 且变化方向相反 ϕ (ν 1, ν 2)≠ 0 Ψ (ν 1, ν 2)=0 对应两波数处光谱强度变化速率相同 ϕ (ν 1, ν 2)=0 Ψ (ν 1, ν 2)≠ 0 对应两波数处光谱强度变化速率不同, 但二者关系未知

表1 对二维相关光谱结果的解释 Table 1 Interpretation of two-dimensional correlation spectra

2D-COS是一种从分析应用角度发展起来的光谱数据处理算法, 根据不同应用需要, 发展衍生出投影2D-COS^[18]、 串联2D-COS^[19]、 移动窗口2D-COS^[20]、 基于模型的2D-COS^{[21, 22]}、 异质谱D-COS^[23]等一系列方法算法, 并进一步与化学计量学结合, 提高了其定性定量分析能力。

投影2D-COS基于数据矩阵投影- 将原始光谱数据投影到两个正交空间, 并根据两个正交分量的线性组合实现斜投影, 以灵活和渐进的方式选择性地衰减或增强原始数据所包含信息的特定方面。 该方法适用于复杂样品分析, 如多组分混合物、 多相复合材料和各种复杂的生物分子分析。

串联2D-COS通过应用垂直拼接将两组光谱串联到一个新的数据矩阵, 再进行二维相关分析, 通过异步谱中交叉峰是否有意义判断原始数据集A和B光谱响应行为的异同, 适用于对不同扰动下产生变化的可逆性以及对样本相似程度进行研究。

移动窗口2D-COS是利用移动窗口将随外扰变化的庞大的光谱数据按矩阵分割成若干个便于操作的子矩阵, 分别对每个子矩阵进行二维相关分析并对各子矩阵的分析结果进行综合, 适用于分析数据量较大的情况(如连续采集随外扰变化所产生的大量数据)。

基于模型的2D-COS是将实验得到的光谱数据与一组根据正弦函数(β-V相关分析)或指数函数(K-V相关分析)变化的参考强度相关, 常用于解决广义二维相关光谱法解释困难的问题。

异质谱2D-COS是将在同一外扰下获得的样本, 用不同光谱技术的动态光谱进行二维相关分析的方法, 可采用机理相似的光谱方法联用(如IR-Raman-2D-COS^{[24, 25, 26]})或完全不同的光谱种类, 包括旋光拉曼光谱(Raman optical activity, ROA)、 电子圆二色谱(electronic circular dichroism, ECD)、 振动圆二色谱(vibrating circular dichromatography, VCD), 如Raman-ROA-2D-COS^[27], Raman-ECD-2D-COS^[28], IR-VCD-2D-COS^[29]等, 适用于两种光谱中属于相同二级结构元素波段之间相关性分析的需要。

二维相关光谱法与化学计量学等方法联用, 进一步拓展了其应用领域。 通过与化学计量学方法[如主成分分析(principal component analysis, PCA)、 偏最小二乘(partial least square, PLS)、 局部权重回归(local wighted linear regression, LWR)、 人工神经网络(artificial neural network, ANN)、 拓扑方法(topology, TP)、 支持向量机(support vector machines, SVM)]相结合, 可以提高模型定量分析精度, 在食品、 农业等领域应用广泛。 Sanchez-Magraner^[30]采用PCA及2D-COS分析的方法对哺乳动物乳汁中蛋白质与油酸在低pH条件下结合机制进行了研究, 并利用其细胞毒性应用于肿瘤细胞的治疗; Czarnik-Matusewicz^[31]等采用PCA和2D-COS研究不同条件下尿素浓度对蛋白质结构的影响, 指导农业中尿素应用的实际问题。 Xiao^[32]等应用2D-COS与Job法(等摩尔系列法)结合成功地解决了频带重叠物质形成的超分子聚集体团聚体物质之间化学计量比的计算问题。 Wu^[33]等应用2D-COS中的异步谱中特征峰值处的切片谱与偏最小二乘判别模型(partial least squares discrimination, PLS-DA)结合, 进行掺杂尿素牛奶的判别, 有效提高了判别精度。 Sun^[34]等采用IR和近红外光谱法(near-infrared spectroscopy, NIR), 采用NIR-IR-2D-COS分析对猪肉肌原纤维蛋白氧化对应的特征波段进行识别, 并根据特征波段简化氧化程度预测模型, 提高预测准确性。 近年Dong^[35]等提出将二维相关光谱的数字图像与深度学习相结合, 用于菌类的区分, 在测试集中得到99.76%的识别准确率, 为蛋白质分类提供了新思路。

在2D-COS应用研究中, 外部微扰方法是决定动态光谱测量结果的关键因素, 尤其是在生物蛋白分子研究中, 需要根据分析样品选择合适扰动方法。 常用的扰动条件通常分为两大类, 物理扰动与化学扰动。 在蛋白质样品分析中, 物理扰动主要包括温度、 压力、 机械作用、 电离辐射等; 化学扰动主要包括浓度、 氢-氘(H/D)交换、 pH值等。 不同方式对于分子内及分子间作用机制的影响不同, 形成的动态光谱特征及二维相关光谱的分析方法也不同。 特别是在蛋白质等结构复杂大分子分析中, 需要针对分析物质特征及所需信息选择扰动方式, 获取能够反映分子内或者分子键变化的动态光谱特征。 常用的扰动方式及作用机理如下:

1.3.1 物理扰动

温度是最常用的物理扰动条件, 其作用机理是通过温度调制氢键结合力, 引起蛋白质主链的结构变化, 常用于蛋白质的结构变化、 氢键相互作用、 聚合物在熔融结晶过程中的结构变化、 相变温度等研究。 最初温度扰动相关研究之一为对核糖核酸酶A(RNase A)和λCro-V55C阻遏蛋白在温度诱导去折叠过程二级结构随温度升高发生变化的时间顺序相关研究^{[36, 37]}。

压力也是常用物理扰动条件, 其作用机理同样是通过压力改变蛋白质分子的氢键、 离子键、 水合作用和疏水相互作用来影响蛋白质结构, 常用于蛋白质的结构变化、 H/D交换动力学过程等样本分析。 Smeller和Heremans^[38]首先应用2D-COS分析压力引起的蛋白质红外光谱变化。 对牛胰蛋白酶抑制剂溶液的H/D交换过程施加压力作为扰动。 结果表明, 2D-COS可以有效分离H/D交换产生的光谱特征和压力诱导的光谱特征, 光谱结果证明了在低压区发生了构象变化和交换效应, 而在0.5 GPa以上(高达0.9 GPa), H/D交换是完全的, 只存在构象变化。

蛋白质经过电离辐射的照射后可发生分子结构的破坏, 包括肽键断裂、 巯基氧化、 二硫键还原等, 从而导致红外光谱的变化。 Najbauer^[39]等以激光为扰动对丝氨酸进行了IR-2D-COS分析, 研究近红外激光诱导的丝氨酸构象变化, 发现在激光照射过程中存在构象消失和新构象生成两种情况, 通过将构象与波段进行关联, 新构象生成对应谱带的强度变化与构象消失对应谱带的强度变化呈反相关关系, 从而得到丝氨酸构象发生变化的动力学过程。

1.3.2 化学扰动

浓度是常用的化学扰动条件, 其作用机理是不同浓度的溶液中, 水介导的蛋白质分子间相互作用引起的蛋白质结构变化会引起特定的光谱变化, 常用于不同蛋白质之间相互作用的研究以及对某些物质中的蛋白质进行定量分析。 改变蛋白质浓度是2D-COS分析中常用的扰动方式, 如果所有的变化都完全遵循朗伯-比尔定律, 则异步谱中不能得到有效信息。 然而, Murayama^[40]等观察到的异步谱中交叉峰显示了卵清蛋白浓度从2%增加到8 %引起的特定光谱变化。 这些变化是水介导的蛋白质与蛋白质分子间相互作用引起的结构变化的光谱特征。

H/D交换过程也可作为化学扰动条件, 其作用机理是H/D交换的交换率受溶剂和氢键稳定性控制, 因而不同二级结构可以根据H/D交换速率之间的差异进行识别, 常用于对蛋白质不同二级结构以及酰胺带进行识别研究。 Meskers等^[41]使用这种方法来分解蛋白质内不易区分的酰胺Ⅰ带、 Ⅱ带和Ⅱ'带中的不同组分, 以确定链霉亲和素溶液的H/D交换过程是否在生物素的影响下发生了改变。 在1 700~1 400 cm^-1范围内对原始光谱进行了2D-COS分析, 结果表明, 链霉亲和素和生物素配体之间的强非共价相互作用抑制了某些酰胺质子的交换, 这些酰胺质子是该蛋白质β-折叠结构的一部分。

pH值的调节作为化学扰动条件, 其作用机理是在远离蛋白质等电点的极端pH值, 蛋白质分子内相同电荷间的静电斥力会导致蛋白质伸展, 使埋藏在蛋白质内部非电离残基发生电离, 这一结构变化会引起特定的光谱变化, 常用于在环境酸碱度变化过程中不同二级结构发生变化时响应顺序的研究。 Murayama^[42]等以pH值为扰动, 采用2D-COS分析了人血清白蛋白(human serum proteins, HSA)的中红外光谱变化。 结果表明, 当pH值从5.0降至3.0时, HSA在两种异构体之间转化。 通过计算同步和异步光谱, 在1 740、 1 715、 1 705和1 696 cm^-1处检测到四个子波段, 对应了由自由羧基基团和参与氢键强度增加的羧基基团的碳氧双键拉伸模式, 并将转化过程分为三个pH范围, 分别对应于N异构体形式(pH 5.0~4.4)、 N-F过渡(pH 4.6~3.8)和F异构体形式(pH 3.8~3.0)。

Yang^[43]等采用傅里叶自反卷积方法提高蛋白质的红外光谱分辨率, 实现蛋白质中每个二级构象比例的定量估计, 使分子光谱成为研究蛋白质二级结构的有力手段。 蛋白质二级结构的红外光谱研究大多仅基于酰胺Ⅰ带, 而拉曼光谱研究则集中在酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带。 NIR合频和倍频谱区包含丰富的蛋白质二级结构信息, 但高度重叠的光谱特征限制了其在蛋白质结构变化研究中的应用, 而2D-COS则弥补了这一缺陷。 2D-COS对蛋白质二级结构的变化非常敏感。 有研究通过以加热为扰动的IR-2D-COS对肌原纤维蛋白的结构变化进行研究, 发现热敏感的吸收峰集中于1 700~1 500 cm^-1段, 分别对应了酰胺Ⅰ带中二级结构α-螺旋的信息及酰胺Ⅱ带信息, 为蛋白质二级结构信息的分离与对其变化过程的观察提供新方法, 证明了2D-COS能够识别高度重叠光谱中发生变化的二级结构信息。 Schwenk^[44]等采用以温度为扰动的二维相关表面增强拉曼散射光谱对牛血清蛋白在高温下的聚集进行了研究, 结果表明2D-COS能够将酰胺Ⅰ带的二级结构α-螺旋及β-折叠信息识别出来, 并且能够观察到β-折叠随温度升高不断形成, 即聚集的发生。 Wu^[45]等以浓度为扰动的NIR-2D-COS对HSA的水合作用和二级结构进行研究, 识别出HSA不同峰值, 在4 200~4 900 cm^-1段得到蛋白质酰胺带以及二级结构的有效信息。Krepelka^[46]等则以浓度为扰动采用NIR-IR-2D-COS对细菌中以蛋白质为主的大分子物质的二级结构进行了研究, 根据结果选择了与重要的中红外峰(酰胺Ⅰ带)高度相关的近红外波长建立细菌分类模型, 该模型与基于近红外全波段的细菌分类模型相比, 分类准确性从85%提高到了94%, Tonolini^[47]等采用NIR-IR-2D-COS以添加二级结构数目为扰动, 对以乳清蛋白为主成分的混合溶液中蛋白质结构完成了分析, 归纳了两种光谱不同波段之间的相关性, 即中红外酰胺Ⅱ带区域与近红外4 300~4 800 cm^-1区域有很高的相关性, 相关性高说明两波段代表同种官能团信息, 为蛋白质近红外波段研究提供了参考。 Chae^[48]等用IR-2D-COS研究表面固化的聚L-谷氨酸(poly L-glutamic acid, PLGA)的pH依赖性构象变化, 发现随pH值增大, PLGA侧链发生去质子化, 诱导PLGA二级结构的构象转变, 形成无规则折叠结构, 增加了对该类聚合物随扰动发生可逆反应过程的了解, 有助于其在药物控制释放系统、 生物医学传感等方面的应用。

结合2D-COS中蛋白质结构信息, Li^[49]等进一步以时间为扰动的Raman-2D-COS对冷鲜牛肉中的肌红蛋白相对含量进行分析, 2D-COS将一维拉曼光谱中的重叠谱带展开, 选取不同特征波段的峰强参数与蛋白质浓度做线性回归, 通过回归分析的结果评价不同特征波段对肌红蛋白相对含量的预测能力, 证明2D-COS用于蛋白质定量分析的可行性。 Wang^[50]等则以掺杂蛋白浓度为扰动的2D-COS对鸡肉糜中蛋白进行分析并提取出特征波长, 基于特征波长建立蛋白质浓度偏最小二乘定量模型, 获得了较高的模型精度(R²=0.97), 说明2D-COS不仅可以直接实现蛋白质定量分析, 还可以通过筛选特征波长简化定量模型并提高定量模型的精度。

以H/D交换作为扰动条件有利于相近的酰胺带之间的区分。 Nabet^[51]等通过红外光谱测量肌红蛋白溶液中H/D交换过程, 辨别出了蛋白质中解析较差的酰胺Ⅰ带、 Ⅱ带和Ⅱ'带区域中的不同构象组成, 确定了肌红蛋白酰胺带与二级结构的分配关系, 并且通过2D-COS分析结构变化发生顺序进而获得二级结构的相对位置关系。 Wu^[52]等通过IR-2D-COS分析研究了HSA的二级结构在H/D交换中的变化, 发现β-转角酰胺质子从HSA的外表面, 被交换为氘核, 引起1 683 cm^-1附近峰强的变化; 被包裹的β-转角的质子发生交换体现在1 666 cm^-1处的峰强变化; 而1 653 cm^-1处的吸收峰强变化对应的α-螺旋部分出现了明显的质子交换。

2D-COS能够利用较高的动态分辨力, 观察外界扰动作用下蛋白质结构细微变化和对应的发生顺序, 是表征二级构象的转变发生顺序的有效方法。 Yan^[53]等应用IR-2D-COS研究了全α-螺旋蛋白肌红蛋白(whole α-helixin myoglobin, Mb)在热诱导变性和聚集过程中的二级结构去折叠过程, 发现50和58 ℃之间Mb热转换的同步谱在1 617和1 684 cm^-1处出现了分子间反平行β-折叠的特征谱带, 表明β-折叠的形成是在螺旋结构展开之后, 且Mb聚集的形成比天然螺旋结构的去折叠快, 即在一定条件下, 蛋白质聚集可以在自然结构状态或部分折叠结构状态的情况下形成。 Yan^[54]等以温度为扰动通过IR-2D-COS对Mb热聚集的机理和途径进行了研究, 发现Mb变性存在两个阶段的热转变: 热展开阶段(30~44 ℃)产生无规则卷曲变化, 螺旋结构暴露于溶剂, 诱导聚集; 热聚集阶段, 温度升高, 蛋白质的三级结构变得松散, 表明聚集体的形成和埋藏结构的展开主导了聚集过程。 Rui^[55]等采用衰减全反射(ATR)IR技术, 以温度为扰动采用2D-COS对热诱导血红蛋白(hemoglobin, HB)二级结构和构象的变化进行研究, 揭示了HB热变性温度范围和其分子构象随温度变化的详细过程, 并基于牛血清白蛋白的热诱导构象变化的二维相关实验, 对HB进行分析得出结论, 为分析生物大分子的热诱导行为建立了通用方法。 He^[56]等以温度为扰动对再生丝素蛋白进行IR-2D-COS研究再生丝素蛋白在高温下二级结构转变的发生顺序, 研究发现150℃以下丝素蛋白未发生二级结构的变化, 150 ℃以上, 丝素蛋白主要发生变化的二级结构为α-螺旋、 β-转角、 无规则卷曲和高波数的β-折叠, 并得到各转变发生的时间顺序。 Lin^[57]等则通过以致病菌蛋白质和强酸性电解水接触时间为扰动的IR-2D-COS对致病菌蛋白质二级结构的变化进行分析, 相关光谱中1 636 cm^-1处出现强自相关峰, 对应了β-折叠, 说明强酸性电解水对蛋白质中的化学基团产生干扰, 导致二级结构β-折叠发生明显改变。 Yan^[58]等以热微扰2D-COS和时间微扰2D-COS对冷冻鱼糜进行分析, 不同贮藏时间的鱼糜在热微扰时1 219、 1 396 cm^-1处自相关峰强度随时间延长而减弱, 分别对应于酰胺Ⅲ带的β-折叠结构及蛋白质中甲基的对称弯曲结构, 不同贮藏时间的鱼糜在以时间为微扰时酰胺Ⅱ带与酰胺Ⅲ带处自相关峰强度减弱, 通过2D-COS结果随贮藏时间的变化, 可以对鱼糜的品质变化进行动态监控, 为2D-COS在蛋白质贮存过程中的质量监控中的应用提供参考。

蛋白质之间相互作用机理与关联是生物制药研究的热点, 2D-COS在其中发挥了重要作用。 Kamerzell^[59]等以浓度为扰动, 采用IR-2D-COS研究两种免疫球蛋白(immunoglobulin, IgG)的相互作用。 结果表明, 浓度提高导致的β-折叠的变化先于无规则卷曲和α-螺旋的变化, 谷氨酸和天冬氨酸残基则会触发两种IgG的关联过程。 Saguer^[60]等以温度为扰动采用二维相关光谱研究热诱导展开和猪血浆蛋白分子间结合机理, 发现血清白蛋白在加热过程中通过分子间β-折叠结构的形成表现出更大的聚集敏感性。 在血清部分(血清白蛋白、 球蛋白)中, 相对于血浆聚集明显减少, 而在血浆中(血清白蛋白、 球蛋白、 纤维蛋白原), 聚集率最初相对于血清白蛋白降低, 但在加热过程结束时达到类似的聚集程度。 结果表明, 在热处理过程中, 血清白蛋白和球蛋白改变了纤维蛋白原, α-螺旋结构是对温度扰动最敏感的构象, 其消失与热诱导分子间β-折叠结构的形成密切相关。

2D-COS能通过对H/D交换的先后顺序的分析, 得到不同氨基酸氘化程度, 为研究蛋白质与磷脂膜的相互作用奠定基础。 Richard^[61]等为研究在二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dimyritoyl phosphatidyl glycerol, DMPG)存在和不存在的情况下β-嘌呤硫氨酸的结构, 并确定不同构象和一些侧链氘化的时间顺序。 采用H/D交换作为扰动对在DMPG作用下的β-嘌呤硫氨酸红外光谱变化进行测量并进行二维相关分析, 发现DMPG双层膜引起β-嘌呤硫氨酸氘化水平的显著降低以及α-螺旋含量的增加, 进而解释了精氨酸很可能参与亲水通道的结构, 以及含有酪氨酸残基的部分蛋白质与带负电的DMPG膜相互作用有助于将蛋白质锚定到磷脂膜中。

2D-COS可用于分析化学键形成导致的光谱变化, 通过相应波段分析价键类型, 获得蛋白类物质与小分子物质或有机大分子物质之间结合作用的相关信息。 Xiang^[62]等以pH为扰动测定近红外光谱变化并进行2D-COS分析, 研究了蛋白质与法莫替丁在酸性环境下的相互作用, 发现蛋白质和法莫替丁的结合表现在5 742 cm^-1附近, 表明蛋白质和法莫替丁之间为氢键相互作用。 三氟乙酸酯(trifluoroacetate, TFA)是固相合成多肽的固有成分, Arrondo^[63]等以温度为扰动, 采用IR-2D-COS研究了TFA对合成肽的稳定性和完整性的影响, 发现分子间盐桥是环肽GXXG聚集机理的关键因素, 确定了无TFA时环肽GXXG的二级构象组成, 以及TFA与精氨酸残基的相互作用机理, 并建立了每个配方产生的肽内结构基序的相对稳定性由高到低的排列顺序表。 Mecozzi^[64]等以茶树油Tween-20乳剂和丁香迷迭香Tween-20乳剂的添加为扰动, 研究了使用不同精油处理对蚕豆根次生蛋白结构的影响, 结果表明二者都引起了二级结构(α-螺旋、 β-折叠和β-转角)的变化, 出现了无规则卷曲结构, 证实了上述两种类型精油对蚕豆根次生蛋白结构的影响差异, 为精油在农业中作为农药的潜在用途提供理论基础。 Chen^[65]等应用IR-2D-COS对腐殖酸与牛血清蛋白之间的结合作用进行了研究, 同步谱中得到1 640和1 534 cm^-1处的自相关峰且交叉峰为负, 分别对应了酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带信息且变化方向不一致, 表明2D-COS不仅能够识别蛋白质与腐殖质发生结合作用的酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带信息, 并且能够对其数量变化进行观察, 根据对结合作用的分析在腐殖质中添加适量牛血清蛋白, 解决腐殖质造成的膜污染问题。

2D-COS也可用于再生医学中生物材料与人体细胞内蛋白质相互作用的观察, Kofodziej^[66]等通过Raman-2D-COS得到了两种聚合物纳米复合材料与细胞中蛋白质组分相互作用的信息, 第一种材料的二维相关光谱在1 658、 1 334和1 257 cm^-1出现自相关峰, 对应着蛋白质酰胺Ⅰ带(α-螺旋、 β-构象)、 酰胺Ⅲ带信息, 而第二种材料的二维相关光谱仅观察到微弱的酰胺Ⅰ带信息, 不仅观察到蛋白质与两种材料之间发生相互作用的基团与结构, 还能够将两种复合材料区分开来。

在酶生物化学机理研究中, 应用2D-COS通过二级结构变化可以研究外部条件对酶结构和活性的影响, 以及小分子与酶之间的作用机理。 Ilore^[67]等以温度为扰动, 采用IR-2D-COS对大鼠肝脏蛋氨酸腺苷转移酶(methionine adenosyl transferase, MAT)的二级结构进行研究, 得到MAT在温度升高过程中二级结构展开的顺序, 并发现MAT在55~80 ℃温度区间完成了变性过程, 进一步升高温度后结构不再发生变化, 为MAT二级结构变性关键温度提供了参考。

Ismail^[68]利用温度扰动下的IR-2D-COS研究马、 牛和金枪鱼铁细胞色素c构象变化, 将1 652 cm^-1归属为α-螺旋, 1 637 cm^-1归属为弯折/延伸链, 1 684及1 616 cm^-1归属为蛋白质聚集, 根据三者随温度展开过程中顺序的差异实现三种具有高度的序列一致性的铁细胞色素c的区分。

Otsuka^[69]等采用主成分回归(principal component regression, PCR)技术和IR-2D-COS研究了胰蛋白酶散装粉末在压缩过程中的酶活性变化, 结果表明1634cm^-1对应的β-折叠的转变主导了结晶胰蛋白酶结构的变化。

Arrondo^[70]等使用温度作为扰动获取不同浓度¹³C尿素与Ca²⁺ATP酶光谱变化并进行2D-COS分析, 表征肌浆网Ca²⁺ATP酶的稳定性。 结果表明碳-13尿素浓度升高至3 mol·L^-1以上时会引起酶的二级结构的改变进而导致变性, 尿素的存在阻止了肌浆网Ca²⁺ATP酶从天然状态到“中间结构状态”的热转换。

Stouner和Heremans^[71]应用2D-COS研究了压力对小分子蛋白质牛胰蛋白酶抑制剂(bovine pancreactic trypsin inhibitor, BPTI)及大分子蛋白质脂肪加氧酶(liquid oxygen, LOX)的H/D交换过程动力学的影响, 结果表明压力优先诱导LOX结构变化, 当压力达到0.5 GPA后, BPTI的H/D交换完全。

Yan^[72]等采用二阶导数处理和IR-2D-COS相结合的方法研究了牛胰腺核糖核酸酶A(ribonuclease A, RNase A)热聚集的相关过程, 探索了pH值、 NaCl和乙醇对该酶发生低聚及热诱导聚集的影响, 发现碱性pH值和NaCl均能加速低聚物的热聚集, 但不影响低聚物的形成, 而乙醇则能提高低聚物的聚集速度和分布, 表明RNase A的聚集可能是由疏水相互作用引起、 由寡聚化控制和静电作用介导的。

随着医学的发展, 2D-COS逐渐被应用于病理研究和疾病诊断领域。 Buchet^[73]等在生理条件下以时间为扰动对成骨细胞磷酸酶(tissue non-specific alkaline phosphatase, TNAP)进行IR-2D-COS分析, 以1 080 cm^-1处的强度变化来计算酶活性, 并结合差谱分析不同人体来源的TNAP在成骨细胞中的活性值差异, 为细胞内酶活性的代谢指纹分析提供了有效的工具。

Cui^[74]等为从血清样本中探索潜在的诊断信息, 以温度为扰动测得健康对照者、 Ⅱ型糖尿病患者和冠心病患者血清的NIR-2D-COS, 获得反映血清溶液中相互作用的水光谱变化, 通过2D-COS与化学计量学计算, 结果表明患者和健康对照组的同步图谱中强氢键(strong hydrogen bonds, SHB)/非氢键(non-hydrogen bonding, NHB)比率存在明显差异。 结合同步谱和异步谱分析, 发现水中不同氢键种类SHB和WHB之间的相关性能够区分糖尿病和心脏病患者, 准确率分别为83.70%和75.00%。

文献[75]等采用Raman分析、 电子顺磁共振光谱(electron paramagnetic resonance, EPR)分析和2D-COS分析以时间为扰动分析恶性疟原虫感染后红细胞在衰老过程中的变化, 并与人体健康血细胞自然衰老过程进行比较。 二维相关拉曼同步峰的变化揭示了寄生虫入侵引起的红细胞变化过程, 其中归属为磷脂和氨基酸His和Phe的同步峰变化反映了红细胞膜的改变; EPR-2D-COS的交叉峰则揭示了低自旋和高自旋配合物中的铁离子在血液中发生了复杂变化。

Popescu^[76]等采用IR-2D-COS和PCA对不同分期的胃恶性组织进行特异性生化分析, 结果显示, 由于正常组织和肿瘤样本的评分存在部分重叠, 单纯的PCA不能明确区分正常组织和恶性组织; 与2D-COS结合则能在异步谱中通过存在的演化顺序信息实现区分, 为区分癌症的发展阶段提供了一种筛选方法。

Pietruszewska^[77]等采用Raman-2D-COS, 以时间为扰动对接触EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)时淋巴细胞的活化过程进行研究。 通过同步谱中的脂质和蛋白质甲基(2 929 cm^-1附近)、 α-螺旋(1 638 cm^-1附近)、 核酸和氨基酸(1 585 cm^-1附近)等信息的变化监测受体复合物的形成; 而随着功能性淋巴细胞的成熟, 异步谱则揭示了b细胞发育趋向于免疫反应, 即免疫球蛋白的形成。