大豆蛋白分离液(SPI, 纯度90%)购于酷尔化学科技有限公司; 氯金酸(HAuCl₄)购于北京索莱宝科技有限公司; 对苯二甲酸(PTA)、 苯甲酸(BA)、 2, 6-吡啶二羧酸(DPA)(99%, 购自上海麦克林生化科技有限公司); 所用化学试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水(电阻率≥ 18.25 MΩ · cm)。

UV2550紫外-可见分光光度计(UV-Vis, 日本岛津); F-4500荧光分光光度计(FL, 美国赛默飞); F200X G2透射电子显微镜(TEM, 美国泰勒斯); Escalab 250Xi X射线光电子能谱仪(XPS, 美国赛默飞); MS-100恒温混匀仪(杭州奥盛); IRTracer傅里叶变换红外光谱仪(FTIR, 日本岛津)。

室温条件下, 加入2.9 mL 70 mg· mL^-1 SPI于锥形瓶中, 在磁力搅拌下加入1.7 mL 10 mmol· L^-1 HAuCl₄, 然后逐滴加入0.5 mL 1 mol· L^-1 NaOH溶液, 此时溶液颜色变为浅黄色, 继续加入900 μ L超纯水, 搅拌2 min后。 微波加热1.5 min, 得到浅棕色的SPI-AuNCs, 4 ℃保存备用。

向2 mL EP管中加入50 μ L SPI-AuNCs, 50 μ L 100 μ mol· L^-1的Cu²⁺溶液, 用PBS缓冲液定容至200 μ L, 混匀反应15 min, 再向上述混合液中加入不同浓度的DPA标准溶液, 振荡混匀, 反应3 min后, 在λ _ex=370 nm下测定λ _em=680 nm处的荧光强度, 计算荧光恢复率(Δ F/F₁)(Δ F=F₂-F₁, 其中F₂和F₁分别表示存在和不存在DPA条件下680 nm处的荧光值)。

由于炭疽杆菌可感染动物进而导致动物制品被污染, 另外在外环境中炭疽杆菌可以形成芽孢, 拥有很强抵抗干燥、 高热、 紫外线的能力, 能持久污染水源、 土壤。 因此本文选择牛奶和环境水样作为实际样品评价方法的可行性, 样品1为当地超市购买的特伦苏纯牛奶, 样品2为公园荷花池(西湖公园)采集的水样。 牛奶通过蛋白质等电点沉淀法除去蛋白, 进一步离心10 min得到上清液, 经0.22 μ m滤膜过滤后备用; 水样经离心10 min处理后, 用0.22 μ m滤膜过滤后备用。

SPI-AuNCs荧光探针的合成及检测DPA原理如图1所示。 以大豆蛋白为模板, 微波加热1.5 min合成SPI-AuNCs。 该金纳米簇在370 nm波长激发下, 在680 nm处发射强烈的红色荧光, Stokes位移大。 由于SPI中氨基酸的— NH₂和— COOH可与顺磁性Cu²⁺发生配位和光致电子转移作用, 导致SPI-AuNCs荧光基团电子密度降低, 使SPI-AuNCs荧光猝灭^{[15, 16, 17]}, 呈现荧光信号“ 关闭” 状态。 向荧光猝灭后的复合物溶液中加入DPA, 由于Cu²⁺与DPA分子的羧基或吡啶氮的螯合作用强于Cu²⁺与金纳米簇的配位作用, 使体系荧光恢复, 荧光信号“ 打开” 。 随着DPA浓度的增加, 荧光逐渐增强, 基于SPI-AuNCs荧光强度变化实现DPA的灵敏检测。

图1

Fig.1

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	图1 SPI-AuNCs的合成及检测DPA的原理图Fig.1 Synthesis of SPI-AuNCs and the principle for DPA detection

采用透射电镜(TEM)对制备的SPI-AuNCs进行形貌表征, 表征结果如图2(a)所示, 所合成的SPI-AuNCs呈球形, 在水溶液中分散性好。 图2(b)是SPI-AuNCs的粒径分布图, 粒径大小均匀, 主要分布在1.8~3.2 nm范围内, 平均粒径为2.65 nm。

图2

Fig.2

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	图2 (a)SPI-AuNCs的TEM图; (b)粒径分布图Fig.2 (a) TEM image and (b) particle size distribution image of SPI-AuNCs

采用傅里叶红外光谱仪(FTIR)对SPI-AuNCs 的官能团组成进行分析。 大豆蛋白(黑线)和SPI-AuNCs(红线)的红外光谱如图3所示, 可见SPI和SPI-AuNCs均在1 523和1 645 cm^-1有特征吸收, 吸收峰分别归因于C— N与C=O伸缩振动。 SPI-AuNCs在2 500和3 000 cm^-1之间存在弱的S— H吸收峰。 由于SPI-AuNCs的形成, SPI在2 943 cm^-1处的吸收峰出现减弱, 说明SPI与Au成功形成Au— S共价键。 比较SPI-AuNCs和SPI的FTIR光谱, 发现SPI-AuNCs与SPI具有相似的红外光谱, 表示SPI-AuNCs的形成对蛋白的表面结构没有太大影响^[18]。

图3

Fig.3

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	图3 SPI和SPI-AuNCs的傅里叶变换红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of SPI-AuNCs and free SPI

通过X射线光电子能谱(XPS)进一步表征了SPI-AuNCs所含的主要元素, 结果如图4所示。 图4(a)是SPI-AuNCs XPS谱图的总谱, 在284.5、 400.0、 531.0、 162.8和84.0 eV峰位处。 分别是C、 N、 O、 S、 Au元素。 图4(b)是高分辨率C(1s)谱图, 在284.5、 286.0和288.0 eV处有三个特征峰, 分别对应C=C/C— C、C— O/C— N、 C=O键^[19]。 图4(c)是N(1s)光谱图, 可以观察到在399.6和400.0 eV有两个峰, 提示氨基氮和C— N键存在。 O(1s)的XPS图谱[图4(d)]显示531.0和532.9 eV处两个峰分别对应C— O键和C=O/C— OH键。 S(2p)的高分辨率光谱图[图4(e)]拟为两个峰, 分别位于161.5和162.8 eV处, 表明硫原子主要以S— H键和C— SO_x(x=2, 3, 4)基团中的C— S键存在。 图4(f)是Au(4f) XPS光谱, 在87.3和84.0 eV处分别为Au(4f_5/2)]和Au(4f_7/2)^[20], 这表明合成的SPI-AuNCs中同时存在Au(0)和Au(Ⅰ )。

图4

Fig.4

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	图4 (a)SPI-AuNCs的XPS全谱图; (b— f)C(1s)、 N(1s)、 O(1s)、 S(2p)、 Au(4f)的高分辨率图谱Fig.4 (a) XPS spectra of SPI-AuNCs; (b— f) High-resolution XPS narrow-scan spectrum of C(1s), N(1s), O(1s), S(2p), Au(4f)

采用紫外-可见分光光度计、 荧光分光光度计对SPI-AuNCs光学性质进行表征。 紫外-可见吸收光谱图如图5(黑线)所示, SPI-AuNCs在250~350 nm之间有吸收峰, 源于大豆蛋白的色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸残基^[21]。 荧光光谱图(图5红线和蓝线)可见SPI-AuNCs的最大激发波长为370 nm, 最大发射波长为680 nm, Stokes位移为310 nm。 较大的斯托克斯(310 nm)使激发和发射带分开, 这样可以有效地减少自吸或自发荧光引起的干扰^[22]。

图5

Fig.5

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	图5 SPI-AuNCs的紫外光谱和荧光光谱图Fig.5 The UV spectra and fluorescence spectra of SPI-AuNCs

为获得荧光最强的SPI-AuNCs, 优化了合成SPI-AuNCs的SPI、 HAuCl₄、 NaOH溶液的浓度和微波加热时间。 结果表明, 在SPI浓度为33.8 mg· mL^-1, HAuCl₄浓度为2.83 mmol· L^-1, NaOH溶液浓度为83.3 mmol· L^-1, 微波加热1.5 min时, 合成的SPI-AuNCs荧光最强。

首先优化了缓冲液种类、 pH、 反应温度和时间对Cu²⁺ 猝灭SPI-AuNCs荧光的影响。 在pH 5.5的PBS缓冲溶液中, 反应温度为30 ℃, 反应15 min条件下, Cu²⁺对SPI-AuNCs的猝灭效果最好。 进一步考察猝灭剂Cu²⁺的最适用量。 随着Cu²⁺浓度增加, 导致SPI-AuNCs在680 nm处的荧光强度急剧降低, 当Cu²⁺溶液浓度大于20 μ mol· L^-1时, 荧光猝灭程度变缓, 反应基本达到平衡。 综合考虑后, 选择20 μ mol· L^-1的Cu²⁺ 进一步实验。 最后, 优化了检测DPA时需要的反应时间, 由于DPA与Cu²⁺反应速度较快, 反应3 min时体系荧光恢复率达到最大。 因此, 选择3 min作为最佳反应时间。

在最佳实验条件下, 测定不同DPA浓度时体系的荧光强度, 以DPA浓度C为横坐标, 荧光恢复率(Δ F/F₁)为纵坐标, 绘制标准曲线。 如图6所示, 在1.15~70.0 μ mol· L^-1浓度范围内, 荧光恢复率(Δ F/F₁)与DPA浓度呈正相关, 线性方程为Δ F/F₁=0.011c+0.131, 相关系数r=0.991。 根据公式LOD=3Sb/k计算出该方法的检出限为0.34 μ mol· L^-1。 为评价该方法的精密度, 选取8.0、 16.0和40.0 μ mol· L^-1三个浓度分别平行测定7次, 计算得到相对标准偏差(RSD)分别为0.65%、 2.42%、 4.19%。

图6

Fig.6

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	图6 检测DPA的标准曲线Fig.6 The standard curve of DPA detection

考查了实际样品中可能共存的干扰物质对测定的影响, 结果如图7所示。 以60 μ mol· L^-1的DPA作为对照, 将相对误差控制在± 5%以内, 10 mmol· L^-1的蔗糖、 葡萄糖、 十二烷基磺酸钠, 1 mmol· L^-1的草酸、 苯甲酸、 对苯二甲酸、 半胱氨酸、 赖氨酸、 Zn²⁺、 S O42-、 K⁺、 Cl^-、 Ca²⁺, 0.5 mmol· L^-1的色氨酸、 苯丙氨酸、 抗坏血酸、 Mg²⁺、 Fe²⁺、 Mn²⁺、 尿素、 氯代十二烷基吡啶、 溴代十二烷基吡啶、 GSH、 叶酸, 7.2 μ mol· L^-1的EDTA对DPA检测无影响, 表明该方法具有较好的特异性。

图7

Fig.7

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	图7 干扰物质的影响Fig.7 The influence of interfering substances a— z: DPA, K+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Fe2+, Mn2+, Cl-, S O42-, Cysteine, L-lysine, Phenylalanine, Tryptophan, Sucrose, Glucose, SDS, Urea, Ascorbic acid, Benzoic acid, Pure Terephthalic Acid, Dodecy-lpyridinium chloride, Dodecy-lpyridinium Bromide, GSH, CA, Folic acid, Ethanedioic acid, EDTA

通过检测实际样品湖水、 牛奶评价本文所建方法的可行性, 结果如表1所示。 由于不是炭疽疫区, 上述实际样品中未发现DPA。 将不同浓度标准DPA溶液加入到实际样品中, 平行测定7次, 得到加标回收率在97.3%~103.6%之间, 表明该方法准确度较好, 可用于实际样品检测。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实际样品中DPA检测结果(n=7) Table 1 Determination results of DPA in the samples (n=7) Samples Found/ (μ mol· L-1) Added/ (μ mol· L-1) Total found/ (μ mol· L-1) Recovery /% RSD /% 8.0 8.3 103.6 2.7 Lake water - 20.0 19.8 99.1 4.8 50.0 50.6 101.3 3.2 8.0 7.8 97.3 3.6 Milk - 20.0 19.8 100.8 2.9 50.0 49.2 98.4 3.0 Note: “ -” Not found

表1 实际样品中DPA检测结果(n=7) Table 1 Determination results of DPA in the samples (n=7)