光谱采集选用杭州SPL谱镭光电技术有限公司生产的USB2000+近红外光谱试验平台以及USB4000+激光诱导荧光光谱试验平台, 光谱检测范围为350~1 100 nm。 设定好参数后将设备预热30 min, 待谱图稳定储存其反射率及强度的光谱数据。 光合速率的检测采用美国LI-COR公司生产的便携式LI-6400光合作用测量仪, 测量之前将仪器预热15~20 min, 检查缓冲瓶稳定情况, 打开叶室夹住待测量活体叶片, 待显示器上所有数据稳定在正常范围内时记录其Pn值。

实验材料取自沈阳农业大学北山科研基地, 选取45个黄瓜白粉病叶片、 45个黄瓜健康叶片进行识别, 抽取其中60个作为建模集, 其余30个作为预测集。 光谱采集软件为海洋光学提供的Ocean Optics SpectraSuite软件, 通过调整参数, 设置近红外光谱的积分时间为100 ms, 平均次数为5, 平滑度为1; 荧光光谱积分时间为65 ms, 平均次数为9, 平滑度为1, 激光电流强度为1.645 A。 获取的光谱图像如图1所示。 选取可见-近红外光谱的490~900 nm和荧光光谱的640~788 nm作为分析研究的谱区。

图1

Fig.1

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	图1 两种光谱曲线图 (a): 近红外光谱; (b): 荧光光谱Fig.1 Two spectral curves (a): NIR spectra; (b): Fluorescence spectra

图1(a)所示的近红外光谱图, 可以看出在550、 680、 750 nm波段范围内出现了波峰; 图1(b)所示的为激光诱导荧光光谱图像, 波峰出现在红荧光(red fluorescence, RF, 波长690 nm附近)和远红荧光(far-red fluorescence, FRF, 波长740 nm附近)^[10], 主要由叶片中非叶脉区域产生。

计算机视觉和图像处理在农业领域的应用逐渐增多, 但将叶片从复杂背景的图像中识别出来还是具有一定的困难^[11], 由于待分析的黄瓜叶片主要为绿色, 因此以白色的非反光的卡纸为背景以突出显示叶片区域。 选择Nikon-D7500型号相机搭配18~140 VR镜头作为图像采集设备, 采集到的彩色图像的分辨率为5 568× 3 712 pixels。 调整镜头焦距使得叶片大小在图像中的大小适中, 成像清晰。 调整好后, 固定相机与镜头, 光照条件为自然光照, 即可进行图像采集。

采用皮尔逊相关系数(pearson correlation)对光合速率与光谱数据之间的相关性进行分析。 在统计学中, 皮尔逊相关系数广泛用于度量两个变量之间的相关程度, 其值介于-1与1之间, 0代表无相关性, 负值为负相关, 正值为正相关。 两个变量之间的皮尔逊相关系数定义为两个变量之间的协方差和标准差的商。 皮尔逊相关系数常用英文小写字母r表示, 其表达式如式(1)所示。

r=1n-1∑i=1nXi-X̅σxYi-Y̅σy(1)

式(1)中, Xi-X̅σx、 X̅及σ _x分别是对样本的标准分数、 样本平均值和样本标准差。

定性分析采用MATLAB2018中内置Classification Learner工具箱进行模型的训练, 其中包括多种分类算法, 如决策树(Tree)、 支持向量机(SVM)、 K-近邻算法、 集成学习(Ensemble leaner)等, 此工具箱还具备数据的特征选择、 方案验证、 训练模型、 检验训练结果等功能, 有着良好的人机交互性。 在交叉验证(cross-validation)后得到每种算法的分类准确率, 选择合适的算法模型。

定量预测模型采用The unscrambler10.4软件, 分析方法为偏最小二乘回归方法(partial-least squares regression, PLSR), 此方法是一种用于对多个样本对应多个因素进行建模分析的方法。 建模前, 对光谱信息进行多种预处理以减少噪声的干扰, 通过比较模型精度R²、 校正均方根误差(root mean square error of calibration, RMSEC)以及预测均方根误差(root mean square error of prediction, RMSEP)确定最终的定量预测模型, 并得到预测数据与实测数据进行对比。

为避免背景对识别结果的影响, 首先需要进行图像的灰度化与增强处理。 图像处理采用德国MVtec公司开发的HALCON机器视觉软件。 如图2所示, 将图像分为红(R)绿(G)蓝(B)三通道, 可以看出三个通道中R与B通道中叶片整体与背景对比较为明显, 但一些枯萎叶片边缘所产生的泛黄卷曲可能影响后续对叶片区域的分割以及白粉病斑的识别。 L^* a^* b^* 色彩空间是一种与设备无关的颜色模型, 也是一种基于生理特征的颜色模型^[12]。 L^* a^* b^* 颜色空间模型由三个要素组成, 亮度通道L^* , 红绿颜色通道a^* 以及黄蓝颜色通道b^* 。 因此, 这种色彩空间对颜色的鲜艳程度及其变化非常敏感。 由图2, a^* 与b^* 通道中, 叶片的颜色差别较大, 可采用二者做差的方式对叶片区域进行增强。 采用式(2)中计算方式对图像进行灰度化与增强处理, 得到的增强图像如图2(h)所示, 可以看出此时叶片区域与背景区域的对比度明显增强。

gsub=2ga-gb+150(2)

式(2)中, g_sub为所得到增强图像的灰度值; g_a为a^* 通道图像的灰度值; g_b为b^* 通道图像的灰度值。

图2

Fig.2

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	图2 不同色彩空间及各通道图像 (a): 彩色原图像; (b): R通道图像; (c): G通道图像; (d): B通道图像; (e): L* 通道图像; (f): a* 通道图像; (g): b* 通道图像; (h): 叶片区域增强图像Fig.2 Different color spaces and image in each channel (a): Colorized original image; (b): R-channel image; (c): G-channel image; (d): B-channel image; (e): L* -channel image; (f): a* -channel image; (g): b* -channel image; (h): Enhanced leaf image

将黄瓜叶片区域作为感兴趣区域(region of interest, ROI), 因此图像增强后需要采用二值化的方法将叶片区域从背景区域中分割开。 采用了一种背景区域灰度值作为参考的方法进行阈值选取, 经过多次试验对比选取为30。 由于在增强图像中背景区域灰度值高于叶片区域, 因此二值化操作实现如式(3)所示。

gbina=0, gsub≥gm-Offsetgbina=1, gsub< gm-Offset(3)

式(3)中: g_bina为叶片增强图像二值化操作惑的灰度值; g_m为两矩形区域的平均灰度值; g_sub为增强后的图像的灰度值; Offset为阈值补偿值。

完成二值化处理后, 识别到的叶片区域存在一些空洞如图3(a)所示, 因此采用形态学操作^[13]对二值化结果进行了处理。 首先, 采用闭操作对这些孔洞进行填充处理, 为防止闭操作对边缘处的填充效果, 又进行了腐蚀操作, 最终得到的ROI区域如图3(b)所示, 其中红色区域代表灰度值为1, 黑色区域表示灰度值为0。 可以看出得到的叶片区域正确且完整。

图3

Fig.3

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	图3 二值化与ROI区域提取结果 (a): 二值化操作结果; (b): 形态学操作后提取到的ROI区域Fig.3 Binarization and ROI extraction results (a): Binarization; (b): ROI extraction after morphological manipulation

图2(b)和(d)的R和B通道中, 白色的病斑与绿色的叶片区域对比明显, 因此, 将二者进行一定灰度调整系数(选取0.95)的相加, 使得患病区域增强, 但不增强叶片其他区域, 如图4(a)所示。 而后进行二值化处理, 即可得出所需的病斑区域。 计算方法如式(4)所示

Gbina=0, (gr+gb)f∈[0, 220)Gbina=1, (gr+gb)f∈[220, 255](4)

式(4)中, G_bina为病斑增强图像二值化操作后的灰度值; f为灰度调整系数。

图4

Fig.4

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	图4 病斑区域提取结果及病斑覆盖程度识别结果 (a): 病斑增强图像; (b): 病斑区域识别结果; (c):病斑覆盖程度识别结果Fig.4 Results of spot area extraction and spot coverage recognition (a): Enhanced image of disease spots; (b): Spot area identification; (c): Lesion coverage recognition

完成二值化处理后, 识别到的病斑区域如图4(b)所示, 为避免一些噪声点对其造成的干扰, 基于白粉病发病通常呈显斑块状的特征, 选取面积在800 pixels以上的区域作为最终的患病识别结果, 以患病区域面积占叶片区域总面积的百分比对比白粉病患病级别判断标准。 根据国家农业行业标准(NY/T 1857.2— 2010)的“ 黄瓜抗白粉病鉴定技术规程” 中的病情分级表, 将图像识别的白粉病斑进行病情分级即可得出最终的患病区域覆盖情况与最终的诊断情况。 按表1所示的病情级别划分表, 45个患白粉病的黄瓜叶片中, 1级有9个, 2级6个, 3级12个, 4级12个, 5级6个。 选取其中6幅典型的叶片病情分级结果, 如图5所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 黄瓜白粉病病情级别划分 Table 1 Classification of cucumber powdery mildew disease 级别 特征 0 无症状 1 病斑面积占叶面积的1/3以下, 白粉状病斑模糊不清 2 病斑面积占叶面积的1/3~2/3, 白粉状病斑较为明显, 但分散不连片 3 病斑面积占叶面积的2/3以上, 白粉状病斑连片, 叶片开始变黄 4 白粉层浓厚, 由叶缘向里变褐 5 叶片变褐坏死斑面积占叶面积的2/3以上, 叶缘上卷

表1 黄瓜白粉病病情级别划分 Table 1 Classification of cucumber powdery mildew disease

图5

Fig.5

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	图5 白粉病病情分级Fig.5 Classification of powdery mildew

当白粉病菌侵入叶肉细胞后, 叶绿体遭到破坏, 引起细胞水分流失, 色素、 水分的吸收作用减弱, 导致染病叶片光谱反射率增高^[14], 叶绿素发射荧光的能量与用于光合作用的能量是相互竞争的关系^[15], 当黄瓜叶片受到白粉病侵染时, 不仅使叶绿素含量降低, 更主要的是使光合作用效率降低, 随着白粉病病情的加重, 光合速率降低、 荧光强度增高。 不同病情分级下, 两种光谱的谱图如图6和图7所示。

图6

Fig.6

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	图6 不同分级下近红外光谱反射率变化Fig.6 NIR spectral reflectance changes of leaves with different disease levels

图7

Fig.7

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	图7 不同分级下荧光光谱强度变化Fig.7 Fluorescence spectra of leaves with different disease levels

光合速率作为衡量叶片健康与否的重要指标, 除了水分、 CO₂, 叶绿素也是重要的影响因素, 它决定了叶片对光能的选择、 传递和分配。 叶绿素分子吸收能量后跃迁到高激发态, 在退激过程中发出比入射光的波长长的出射光, 这种光被称为叶绿素荧光, 其与光合作用存在一定的竞争性即负相关性, 因此被称作植物光合作用的无损探针。 当白粉病干扰到叶片正常的光合作用时, 荧光强度会增强, 反之则减弱。 图8所示为90个黄瓜叶片样本的光合速率Pn值分布情况, 健康叶片的光和速率Pn平均值为11.803, 患白粉病叶片的光合速率Pn平均值为5.546, 健康叶片的光合速率Pn值高于患白粉病叶片的光合速率Pn值。

图8

Fig.8

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	图8 光合速率数据分布图Fig.8 Distribution of photosynthetic rate data

光合速率Pn值与近红外光谱和激光诱导荧光光谱进行皮尔逊相关性分析, 结果如图9所示。 由图9(a)可知光合速率Pn值与光谱具有负相关性, 与近红外光谱在680~700 nm波段范围内具有较强负相关, 相关系数可达到0.619; 与荧光光谱在660~670、 690~710和750~760 nm波段附近都存在相关性陡然变化的情况, 如图9(b), 并且都有伴随光谱强度的增强相关性减弱的现象。 因此采用原始光谱及相关性较大的波段对光合速率进行预测具有可行性。

图9

Fig.9

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	图9 光合速率相关性分析图 (a): 近红外光谱; (b): 荧光光谱Fig.9 Correlation analysis of photosynthetic rate (a): NIR spectrum; (b): Fluorescence spectrum

通过MATLAB中Classification Leaner工具箱对近红外光谱、 荧光光谱与光合速率数据进行了模型训练。 各种算法的准确率如图10所示, Ensemble-Subspace Discriminant算法的识别精度更高可达到98.3%, 该种算法预测速度及训练速度虽不及其他几种算法, 但对于中小规模的数据集, 精度高, 性能好。 在模型的训练与验证过程中, 给定患病叶片类别标签为“ 1” , 健康叶片类别标签为“ 0” , 并将其设置为响应值, 通过将模型输出的响应值与已知的类别对比, 经验证后各模型算法准确率如表2所示。

图10

Fig.10

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	图10 训练后各算法精度(%)Fig.10 The accuracy of each algorithm after validation

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 验证后各算法准确率(%) Table 2 The accuracy of each algorithm after validation 类别 Tree LDA logistic Regression SVM KNN Ensemble- Subspace Discriminant 近红外光谱 100 100 76.7 100 100 100 荧光光谱 86.7 90 66.7 50 60 93.3

表2 验证后各算法准确率(%) Table 2 The accuracy of each algorithm after validation

经过6种算法准确率的比较, Ensemble-Subspace Discriminant算法的准确率相对较高, 以此来完成黄瓜白粉病与健康叶片的分类模型构建。 将30个样本作为测试集进行模型的验证, 图11(a)中近红外光谱模型中15个健康样本与15个患白粉病样本均预测准确, 图11(b)中有两个健康样本被误判为患病样本。 由此可证明光合速率与近红外光谱结合建立的定性分析模型对白粉病的识别准确率更高, 能够实现对黄瓜白粉病叶片和健康叶片的识别。

图11

Fig.11

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	图11 测试集的分类结果 (a): 近红外光谱模型; (b): 荧光光谱模型Fig.11 Classification results of testing samples (a): Model of NIR spectrum; (b): Model of Fluorescence spectrum

利用PLSR完成黄瓜白粉病与健康叶片光合速率定量模型的构建, 首先经过平滑处理、 光程校正处理、 微分处理等预处理方法的比较, 最终得到光程校正中MSC方法可以有效去除干扰信息。 通过近红外与荧光光谱PLSR模型的对比得到, 近红外光谱结合光合速率的模型精度R²(0.977 8)高于荧光光谱模型精度0.930 6, 其校正均方根误差(0.570 9)和预测均方根误差(0.548 5)相对较小, 且RMSEP(0.548 5)< RMSEC(0.570 9)。 两种光谱模型光合速率Pn值实际测量结果与预测结果对比图如图12所示, 前15个患白粉病样本与后15个健康样本区分明显, 与前文相呼应, 且近红外预测值更接近实际测量值, 由此可以得到近红外光谱+光合速率模型具有更高的鲁棒性。

图12

Fig.12

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	图12 光合速率预测结果对比图Fig.12 Comparison of photosynthetic rate prediction results