基于FTIR研究不同年份远志药效物质累积规律
李慧, 李建丽, 苏琪辉, 黄玉荣, 程艳刚, 高蕊蕊, 王颖莉*, 詹海仙*
山西中医药大学中药与食品工程学院, 山西 晋中 030619
*通讯作者 e-mail: wyl@sxtcm.edu.cn; zhan030006@126.com

作者简介: 李 慧, 女, 1997年生, 山西中医药大学中药与食品工程学院硕士研究生 e-mail: lh317928120@163.com

摘要

分析远志不同生长年份特征化学成分的药效物质累积规律。 采用傅里叶变换红外光谱法对山西汾阳、 新绛12批不同生长年份的远志药材进行红外光谱扫描分析, 建立远志的红外指纹图谱, 并进行共有峰率和变异峰率双指标序列分析。 远志药材特征吸收峰在3 130, 2 920, 1 650, 1 540, 1 400, 1 260和1 050 cm-1存在明显的共有峰, 醇提物特征吸收峰位于3 150~3 000, 2 950~2 920, 2 850, 1 740~1 710, 1 670~1 630, 1 540~1 520, 1 450~1 400, 1 100~1 050, 990和530 cm-1范围内; 远志吸收峰数目随年限增长呈增加趋势, 同一年份远志药材在3 380, 1 315, 1 060和990 cm-1附近, 醇提物在3 360和1 315 cm-1附近吸收峰的数目、 形状和强度存在差异, 秋采远志在此范围内无特征吸收。 药效物质累积量: 汾阳产远志、 新绛产远志在春季采收药效物质累积量较大; 远志有效成分: 前者细叶远志皂苷、 3,6’-二芥子酰基蔗糖、 远志口山酮Ⅲ药效物质累积量随远志生长年限的增长累积增加; 后者3,6’-二芥子酰基蔗糖的累积量呈先上升后下降的趋势, 远志口山酮Ⅲ和部分皂苷类物质随生长年限的延长呈下降趋势。 远志药材共有峰率在66.7%~100%, 变异峰率在0~63.6%, 醇提物共有峰率在66.7%~94.7%, 变异峰率在0~30.0%; 同一年限远志样品共有峰率较高, 春采之间、 秋采之间共有峰率较高; 同一产地远志共有峰率较高, 药效物质累积量随年限增长较为相似, 无明显差异; 其中变异峰率最高的药材序列是(春采)S-2-3: S-2-5(秋采)为63.6%, 二者为不同年限不同季节采收, 药效物质累积量相差较大。 基于红外光谱法和二阶导数结合双指标序列分析法可以分析探究远志不同生长年份有效化学成分的特征峰变化规律和药效物质累积规律, 为远志的种植采收时间、 质量控制和评价提供参考。

关键词: 远志; 红外光谱; 二阶导数; 双指标序列分析; 药效物质累积
中图分类号:O657.33 文献标志码:A
Study on Drug Substance Accumulation of Polygala Tenuifolia in Different Years Based on FTIR
LI Hui, LI Jian-li, SU Qi-hui, HUANG Yu-rong, CHENG Yan-gang, GAO Rui-rui, WANG Ying-li*, ZHAN Hai-xian*
College of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China
*Corresponding authors
Abstract

To analyze the accumulation rule of pharmacodynamic substances of characteristic chemical constituents of Radix polygala in different growth years. FTIR was used to scan and analyze 12 batches of Radix polyphyllum with different growth years in Fenyang and Xinjiang of Shanxi Province. The infrared fingerprint of Radix polyphyllum was established, and the sequence of common peak rate and variation peak rate was analyzed. There were obvious common absorption peaks at 3 130, 2 920, 1 650, 1 540, 1 400, 1 260 and 1 050 cm-1. The characteristic absorption peaks of ethanol extract were in the range of 3 150~3 000, 2 950~2 920, 2 850, 1 740~1 710, 1 670~1 630, 1 540~1 520, 1 450~1 400, 1 100~1 050, 990, 530 cm-1. The number of absorption peaks increased with the increase of age. In the same year, there were differences in the number, shape and strength of absorption peaks near 3 380, 1 315, 1 060 and 990 cm-1 for P. polygonum, and the number, shape and strength of absorption peaks near 3 360 and 1 315 cm-1 for alcohol extract, and there was no characteristic absorption of P. polygonum in autumn. In terms of the accumulation of pharmacodynamic substances, the accumulation of pharmacodynamic substances in Fenyang and Xinjiang polygonum was larger in spring harvesting, and the accumulation of tenuifolin in fenyang polygonum, 3,6’-Disinapoylsucrose, and Polygalaxanthone Ⅲ increased with the growth of polygonum. The accumulation of 3,6’-Disinapoylsucrose increased firstly and then decreased, while the contents of Polygalaxanthone Ⅲ and some tenuifolin decreased with the increase of growth years. The common peak rates were 66.7%~100%, the variation peak rates were 0~63.6%, the common peak rates of alcohol extract were 66.7%~94.7%, and the variation peak rates were 0~30.0%. The common peak rate of the same period was high, and the peak rate between spring and autumn harvests was high. The common peak rate was high, and the accumulation of pharmacodynamic substances was similar to the increase in age, but there was no significant difference. The highest mutation peak rate was S-2-3 (picked in spring) and S-2-5 (picked in autumn), which was 63.6%. The two sequences were harvested in different seasons in different years, and the accumulation of pharmacodynamic substances differed greatly. The characteristic peaks of effective chemical components and the accumulation of pharmacodynamic substances of P. polygonum in different growth years can be analyzed and explored based on infrared spectroscopy and second derivative combined with double index sequence analysis, which can provide a reference for quality evaluation of Polygala tenuifolia.

Keyword: Polygala; Infrared spectrum; Second derivative; Dual-index sequence analysis; Accumulation of active substances
引言

中药远志始载于《神农本草经》, 列为上品, 历代本草书籍对远志均有记载[1]。 远志来源于远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd. 或卵叶远志Polygala sibirica L.的干燥根, 春、 秋二季采挖, 晒干或抽去木心晒干, 性苦、 辛, 温。 归心、 肾、 肺经。 具有安神益智, 交通心肾, 化痰消肿的作用。 常用于心肾不交所致的失眠多梦、 健忘心悸、 咯痰、 疮疡肿毒等[2]。 现代药理研究表明, 远志还具有镇静催眠、 神经保护等药理作用。 远志在我国广泛分布, 山西省为远志主产区, 所产远志产量大、 品质佳, 称为道地药材。 随着远志需求量的不断增加, 远志野生资源逐渐减少, 再生能力逐渐下降, 现人工种植栽培远志居多, 由于产量下降、 成本的提高, 导致价格迅速上涨, 相继出现药材质量参差不齐、 掺杂混淆的现象。 远志化学成分复杂, 主要成分为三萜皂苷类、 酮类和寡糖酯类[3]。 药典中以细叶远志皂苷、 3, 6’ -二芥子酰基蔗糖和远志口山酮Ⅲ 作为活性指标对远志药材进行质量控制。 远志的研究多在化学成分、 药理作用和活性成分等方面[4], 傅里叶变换红外光谱(FTIR)用于远志药材鉴别、 醇溶性浸出物的红外光谱指纹图谱差异性分析[5, 6, 7]

FTIR是目前应用最广的分析检测技术之一。 通过红外光谱可以整体反映中药最原始的信息, 相同的药材, 由于不同生长环境、 气候条件, 不同产地年限采收可能含有不同的化学成分, 红外光谱可以从吸收峰数目、 位置、 强度等方面将化学成分的差异性呈现出来, 能够快速反映出官能团的精细结构信息, 展现出中药药材整体化学结构特征以及含有化学成分的复杂性[8, 9]。 与其他技术相比具有较高的灵敏度、 分辨率, 散光低、 波段宽以及检测速度快、 重现性好、 不污染环境等优点, 在不损坏样品的情况下, 可同时用于多种物质的定性定量分析[10, 11, 12], 被广泛应用于药物机理研究、 成分检测等众多领域, 发挥着重要的作用[13]。 基于红外光谱结合双指标序列分析法可以对样品进行更深层次的分析比较, 此法避免了复杂的样品前处理, 更加便捷有效[14, 15]

本研究采用FTIR技术建立了12批不同生长年份远志的红外光谱指纹图谱, 利用红外谱图及二阶导数谱图结合双指标序列分析法对远志所含药效物质成分进行整体探究, 分析远志不同生长年份、 采收时间与其有效化学成分的药效物质累积规律的关系, 以期为远志的种植、 采收、 质量评价提供参考。

1 实验部分
1.1 仪器

NICOLETiSIO傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Fisher Scientific公司), ZHD-20红外烘烤灯(天津恒创立达科技发展有限公司), EX125ZH十万分之一电子天平(奥豪斯仪器常州有限公司), HH-S4A电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司), GZX-9140MBE电热鼓风干燥仪(上海博讯实验有限公司医疗设备厂)。

1.2 样品

从山西汾阳、 新绛收集了12批不同远志药材(采收时间2021年4月和10月), 详细信息见表1, 经山西中医药大学裴香萍教授鉴定为远志科植物远志Polygalae tenuifolia Willd.或卵叶远志Polygala sibirica L.的干燥根。 KBr光谱纯(批号: 20050418天津市科密欧化学试剂开发中心)。

表1 远志药材信息表 Table 1 Information of Polygala tenuifolia
1.3 远志红外光谱分析方法

将所收集的12批不同远志原药材粉碎成粗粉, 60 ℃下干燥, 研磨过200目筛, 按照2020版《中华人民共和国药典》四部通则2201项下的热浸法制备醇溶性浸出物, 备用。

精密称取样品粉末或醇提物约2 mg, 干燥的KBr粉末约200 mg (105℃干燥)在玛瑙研钵中研磨并压匀, 均在红外烘烤灯下进行操作。

采用Thermo Fisher Scientific公司的NICOLETiSIO型傅里叶变换红外光谱仪-硅碳棒光源, DTGS检测器, 光谱分辨率为4 cm-1, 扫描次数为32, 在4 000~400 cm-1光谱范围内进行检测。

1.4 数据分析

通过Thermo Fisher Scientific公司操作软件OMNIC 8.2得到红外光谱图及数据, 扣除背景导出数据, 进行基线校正、 自动平滑和归一化等, 用Origin 2018软件处理得到对应的二阶导数谱图。

2 结果与讨论
2.1 汾阳远志药材FTIR谱图分析

2.1.1 原药材FTIR谱图分析

汾阳6个不同年份远志原药材红外光谱图及二阶导数谱图分别见图1(a— d)。 样品所对应的透过率与峰强度反映出远志中某一有效成分在此处吸收能力的强弱, 峰强度在谱图上的表现是峰高低的不同, 峰越高, 吸收越强。 同一年份不同季节采收的药材, 由图1样品吸收峰对应透过率之差可知: 2年生春采(S-1-1)样品和秋采(S-1-4)样品, 在2 920, 2 850, 1 450和1 100 cm-1附近春采透过率较低, 1 743 cm-1附近透过率较高, 体现了糖(苷)类物质于秋采药效物质累积量较大, 黄酮类物质春采累积量较大; 3年生春采(S-1-2)样品和秋采(S-1-5)样品, 在1 743 cm-1附近秋采透过率较高, 黄酮类物质累积量较大; 4年生春采(S-1-3)样品和秋采(S-1-6)样品透过率相差明显, 春采糖(苷)类、 黄酮类所对应的透过率、 吸收峰强度明显大于秋采, 春采药效物质累积量较高[16]。 随着年限的增长, 春采、 秋采远志的有效成分糖(苷)类、 黄酮类物质所对应的透过率之差逐渐增大, 药效物质随年限增加逐渐累积。 这些主要吸收峰的透过率变化同峰强度, 对应在二阶导数图上有很好的分辨率。

图1 汾阳不同年份远志原药材红外光谱和二阶导数光谱图
FITR图: (a) 一波段, (b) 二波段; 二阶导数光谱图: (c) 一波段, (d) 二波段春采: S-1-1, S-1-2, S-1-3; 秋采S-1-4, S-1-5, S-1-6
Fig.1 One-dimensional infrared and second derivative spectra of Radix Polygala in different years in Fenyang
FITR diagram: (a) band, (b) two bands; Second derivative spectra: (c) band, (d) two bands Spring harvest: S-1-1, S-1-2, S-1-3; Autumn harvest: S-1-4, S-1-5, S-1-6

2.1.2 醇提物FTIR谱图分析

汾阳6个不同年份远志醇提物红外光谱图及二阶导数谱图见图2(a— d)。 醇溶性浸出物的红外光谱图、 二阶导数光谱图和原药材谱图基本一致, 与原药材中的多数化学成分都吻合, 6个不同年限远志醇溶性浸出物的红外图谱在3 150, 2 920, 1 670, 1 630, 1 510, 1 400, 1 100, 990和530 cm-1附近有9个主要的共有峰, 远志醇溶性浸出物与原药材红外光谱图最大差异是有几处明显强且尖锐的峰, 在1 670, 1 630和1 510 cm-1附近, 说明远志醇溶性浸出物中含有脂类物质[5]。 同一年份不同季节采收的远志醇提物, 由图2样品吸收峰对应透过率之差可知: 2年生、 3年生春采和秋采样品, 在2 920, 2 850, 1 743, 1 450和1 100 cm-1附近秋采的透过率较高, 部分糖类、 苷类、 黄酮类物质秋采药效物质累积量较大; 4年生春采样品和秋采样品药效物质累积规律与原药材一致, 在1 450~1 100 cm-1范围内春采、 秋采吸收峰基本重合, 这一阶段部分糖类物质累积量变化不大。 随着年限的增长, 春采远志醇溶性浸出物3个样品的有效成分糖(苷)类、 黄酮类物质所对应的透过率之差逐渐增大, 药效物质逐渐累积, 浸出物含量具有增加趋势。 秋采远志醇溶性浸出物3个样品药效物质累积规律不甚明显, 4年生远志药效物质累积速度变缓。

图2 汾阳不同年份远志醇提物红外光谱和二阶导数光谱图
(a): 一波段; (b): 二波段、 二阶导数光谱; (c): 一波段; (d): 二波段
Fig.2 One-dimensional infrared and second derivative spectra of alcohol extracts from Polygala Fenyang in different years
(a): Band; (b): Two bands, second derivative spectra; (c): Band; (d): Two bands Spring harvest: S-1-1, S-1-2, S-1-3; Autumn havest: S-1-4, S-1-5, S-1-6

2.2 新绛远志药材FTIR谱图分析

2.2.1 原药材FTIR谱图分析

新绛6个不同年份远志原药材红外光谱图及二阶导数谱图见图3。 同一年份不同季节采收的药材, 由图3样品吸收峰对应透过率之差可知: 2年生春采(S-2-1)样品和秋采(S-2-4)样品, 3年生春采(S-2-2)样品和秋采(S-2-5)样品, 在2 920, 2 850, 1 450, 1 743和1 100 cm-1附近春采透过率较高, 远志春采药效物质累积量较大; 4年生春采(S-2-3)样品和秋采(S-2-6)样品, 在2 920, 2 850, 1 450和1 743 cm-1附近透过率差异明显, 春采对应的透过率、 吸收峰强度明显大于秋采, 春采药效物质累积量较高。 随着年限延长, 远志春采有效成分糖(苷)类、 黄酮类物质对应的透过率之差逐渐增大, 药效物质的量随年限延长逐渐累积; 远志秋采2年、 3年生样品药效物质累积量逐渐增加, 4年生样品累积较缓, 糖(苷)类物质对应的透过率有降低趋势。 新绛远志春采药效物质累积量较高, 3, 6’ -二芥子酰基蔗糖的累积量呈先上升后下降的趋势, 口山酮Ⅲ 和部分皂苷类物质随生长年限的延长而降低[17]。 这些主要吸收峰的透过率变化同峰强度, 对应在二阶导数谱图上有很好的分辨。

图3 新绛不同年份远志原药材红外光谱和二阶导数光谱图
(a): 一波段; (b): 二波段、 二阶导数光谱; (c): 一波段; (d): 二波段
Fig.3 One-dimensional infrared and second derivative spectra of Radix Polygala in different years in Xinjiang
(a): Band; (b): Two bands, second derivative spectra; (c): Band; (d): Two bands

2.2.2 醇提物FTIR谱图分析

新绛6个不同年份远志醇提物红外光谱图及二阶导数谱图分别见图4(a— d)。 由图可知, 6个不同年限远志醇溶性浸出物的红外图谱在3 150, 2 920, 1 670, 1 630, 1 510, 1 450, 1 400, 1 275, 1 100, 1 055, 990和530 cm-1附近有12个主要的共有峰, 远志醇溶性浸出物与原药材红外光谱图最大差异明显, 多了两个在1 630和1 275 cm-1附近脂类物质存在的吸收峰。 同一年份不同季节采收的远志醇提物, 由图4样品吸收峰对应透过率之差可知: 2年生春采和秋采样品在2 920, 2 850, 1 670和1 630 cm-1附近, 秋采透过率较高, 1 100 cm-1附近相差不大, 部分糖(苷)类、 黄酮类物质在秋采累积量较高; 3年生春采和秋采样品, 秋采样品红外光谱透过率较高, 药效物质累积较大, 春采样品在1 710 cm-1附近有一个尖峰, 推测可能是黄酮类物质大量存在; 4年生春采和秋采样品, 秋采远志透过率较高, 药效物质累积量较大, 在1 450~1 100 cm-1范围内春采、 秋采强度基本一致, 这一阶段部分糖类物质累积量变化不大。 随着年限的延长, 春采、 秋采2年生样品在2 920和2 850 cm-1附近累积量达到最大, 可能是糖(苷)类物质, 在1 100 cm-1附近累积趋于平缓有下降趋势, 可能是部分皂苷累积量的体现; 3年生样品次之, 4年生样品此类物质累积速度变缓。

图4 新绛不同年份远志醇提物红外光谱和二阶导数光谱图
(a): 一波段; (b): 二波段、 二阶导数光谱; (c): 一波段; (d): 二波段
Fig.4 One-dimensional infrared and second derivative spectra of alcohol extracts from Polygala Xinjiang in different years
(a): Band; (b): Two bands, second derivative spectra; (c): Band; (d): Two bands

2.3 远志红外指纹图谱共有峰率、 变异峰率双指标序列分析

2.3.1 汾阳远志红外指纹图谱的双指标序列分析

远志原药材及醇溶性浸出物的红外图谱变化峰、 共有峰率和变异峰率双指标序列分析见表2表3。 结果显示: 6个不同年份远志药材的红外图谱在3 100, 3 000, 2 920, 2 850, 1 740, 1 710, 1 640, 1 540, 1 520, 1 400, 1 100, 1 050和530 cm-1附近有13个主要的共有峰。 汾阳产6个原药材样品的共有峰率≥ 76.5%, 变异峰率≤ 38.5%, 春采样品之间、 秋采样品之间共有峰率较高, 同一年份不同时间采收的远志共有峰率也较高, 差异不大; 6个醇溶性浸出物样品的共有峰率≥ 66.7%, 变异峰率≤ 30%, 远志春采2年生与秋采4年生共有峰率最低, 其余不同年份远志样品醇溶性浸出物和原药材化学成分累积规律一致。 双指标序列表明, 同一产地远志没有明显差异。

表2 汾阳远志原药材红外指纹图谱吸收峰波数 Table 2 Absorption peak wave number of Fenyang Polygala raw materials infrared fingerprint
表3 汾阳远志醇提物红外指纹图谱吸收峰波数 Table 3 Absorption peak wave number of Fenyang Polygala alcohol extract infrared fingerprint

2.3.2 新绛远志红外指纹图谱的双指标序列分析

远志原药材及醇溶性浸出物的红外图谱变化峰、 共有峰率和变异峰率双指标序列分析见表4表5。 结果显示: 6个不同年份远志原药材的红外图谱在3 130, 2 920, 2 850, 1 710, 1 645, 1 400, 1 100, 1 050和530 cm-1附近有9个主要的共有峰。 新绛产6个原药材样品的共有峰率≥ 66.7%, 变异峰率≤ 63.6%。 个别样品: 春采3个样品S-2-1, 2和3与秋采2个样品S-2-5和6之间共有峰率、 变异峰率都较大, 可能由于采收时间、 生长环境等影响因素使成分差异较大; 6个醇溶性浸出物样品的共有峰率≥ 72.2%, 变异峰率≤ 26.9%, 春采样品之间、 秋采样品之间共有峰率较高。

表4 新绛远志原药材红外指纹图谱吸收峰波数 Table 4 Absorption peak wave number of Xinjiang Polygalaraw materials infrared fingerprint
表5 新绛远志醇提物红外指纹图谱吸收峰波数 Table 5 Absorption peak wave number of Xinjiang Polygala alcohol extract infrared fingerprint

2.3.3 远志样品的基本关系组、 对分析

根据建立的序列, 对远志样品进行基本分组, 在最相似的样本对和组中, 按照共有峰率和变异峰率可以分为以下几组(见表6):

表6 远志样品基本关系分组 Table 6 Basic relationship grouping of Polygala samples

A组中, 从两个产地样品的药效物质积累量来看, 这组吸收峰对应情况最好, 共有峰率最高、 变异峰率较低, 序列对应程度最高的样品分别是春采之间, 秋采之间的远志, 每对序列的气候条件、 生长环境和采收时间均相同, 二者药效物质累积、 化学成分性质应相似。

B组中, 春采序列与秋采序列之间, 同一年份不同季节采收的样品共有峰率较高且十分接近, 药效物质累积量接近且质量差异不明显。

C组中, 虽然各个序列样品的共有峰率接近, 但变异峰率差值较大。 其中新绛远志3年生样品序列S-2-2与S-2-5变异峰率相差最大, 春采与秋采药效物质累积量差异较大。

D组中, 汾阳醇提物序列S-1-1与S-1-6样品之间, 新绛原药材序列S-2-1与S-2-5、 6, S-2-3与S-2-5之间共有峰率较低而变异峰率较高, 可能由于不同年份、 不同采收时间等因素影响其药效物质累积量。

3 结论

FTIR技术避免了复杂样品前处理操作, 是官能团结构解析、 混淆掺假、 未知物结构鉴别的分子结构重要分析方法之一, 其特征信息的整体性表现了化学成分的复杂多样性, 根据远志的化学成分特征找出它的主成分特征吸收峰及对应的波段[18]。 FTIR二阶导数光谱图是对原始光谱经过微积分处理得到, 可以平缓背景干扰, 能更清楚、 容易地分辨出光谱的重叠峰以得到更多隐藏的有用信息[19, 20]

样品均采自于主产地山西, 生长条件、 环境等不尽相同。 中药材的药效物质累积量的变化由于特殊的生长规律又受产地气候、 生长年限、 采收期等多因素共同影响, 特别是生长年限的延长对药材有效成分的含量及药效有重要影响。 本研究采用FTIR从透过率、 峰强度方面结合双指标序列分析法对12批同一基源、 不同年份、 产地、 采收时间的远志药材特征化学成分进行药效物质累积规律的研究, 以期对中药远志的合理采收季节和年限进行考察。

实验研究发现, 远志在相同生长年份, 春季采收更为合适, 采收年限应在2年以上。

实验研究可知, 12批远志样品均含有相同的化学成分, 在红外光谱图上特征峰、 峰形、 峰位、 峰高基本一致, 主要显示为糖(苷)类、 酮类物质的特征峰, 推测2 920和2 850 cm-1附近可能属于糖(苷)类特征吸收峰; 1 645~1 630和1 743 cm-1附近可能属于黄酮类物质特征吸收峰; 1 160~1 050 cm-1附近可能属于糖类物质特征吸收峰, 在已发表的文献中, 采用红外光谱法获得远志寡糖的红外特征峰; 提取远志中的皂苷元与其对照品谱图上有相应位置的特征峰; 远志红外谱图多处特征峰具有的一系列官能团, 说明了三萜类化合物的存在。 文献报道的特征峰与本研究得到的特征峰基本一致[21]

鉴于实验只研究了山西汾阳、 新绛12批不同生长年限的远志, 对远志样品数量批次选择的有限性, 所选检测成分得出的实验结果是否具有代表性和可行性, 其他不同种植产区的远志是否与本研究结果具有相同的累积规律, 有必要后续进一步深入研究, 为远志的种植和采收, 质量控制及评价提供更有力、 更可靠的参考依据。

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