槲皮素(四川省维克奇生物科技有限公司, 117-39-5); CAV-1蛋白(Cloud-Clone Corp, P20200605550); 磷酸缓冲盐溶液(Servicebio); 二甲基亚砜(索莱宝, D8371); 吐温-20(索莱宝, T8220); 超级链霉亲和素(FORTEBIO , 2010212); Zeba^TM脱盐离心柱(Thermo, VB296675A); EZ-Link^TM NHS-PEG4-生物素(Thermo, VE300242)。

荧光分光光度计(F-4700, 日立, 日本); 低温恒温槽(LS-2500, 南京宁凯仪器有限公司); 化学发光荧光酶标仪(SpectraMax i3x, 美谷分子); 生物膜干涉分子相互作用仪(Octet K2, FORTEBIO)。

实验所用试剂为分析纯, 所用水为一级水。

荧光猝灭检测已被广泛应用于研究有机化合物与蛋白质的相互作用^[11]。 本研究使用荧光分光光度计并采用温度相关的测量方法检测荧光发射光谱来分析槲皮素与CAV-1蛋白的相互作用。 蛋白CAV-1(1.0× 10^-6 mol· L^-1)溶液10 μ L溶于2毫升PBS缓冲液中。 将不同浓度的槲皮素(0, 0.5× 10^-6, 1.0× 10^-6, 1.5× 10^-6, 2.0× 10^-6, 2.5× 10^-6和3.0× 10^-6mol· L^-1)分别与一定浓度的CAV-1蛋白反应。 样品检测在荧光分光光度计专用比色皿中进行, 在激发波长280 nm, 发射波长300~450 nm范围内, 激发狭缝和发射狭缝宽度均设置为5 nm, 以700 V的电压(PMT)及240的扫描速度, 设定温度为298和310 K, 使用循环水浴控制温度, 分别扫描获得荧光光谱。

在298 K温度下使用相同的溶液进行同步荧光测定, 将Δ λ (波长间隔)参数设置为60 nm, 以筛选微环境中色氨酸残基周围的扰动。 一般来说, 极性大小或亲水/疏水性的变化与最大峰的红移或蓝移有关, 其可影响氨基酸周围微环境^[12]。 于荧光比色皿中加入1 990 μ L PBS和10 μ L蛋白溶液混匀, 使蛋白终浓度为5× 10^-9 mol· L^-1, 蛋白浓度保持不变, 逐渐加入5 μ L的槲皮素溶液, 以其混合液(0, 2.5× 10^-7, 5× 10^-7, 7.5× 10^-7, 10× 10^-7, 12.5× 10^-7和15× 10^-7 mol· L^-1)为样品溶液, 扣除空白, 在Δ λ =60 nm测定。

三维荧光光谱是分析蛋白质在溶液状态下构象变化的有效分析技术^[13]。 设定电压(PMT)为700 V, 增益为2, 扫描速度240 nm· min^-1, 等高线设置为15, 激发波长参数为200~350 nm, 发射波长参数为220~500 nm, 两者扫描间隔均为5 nm。 以蛋白溶液(5.0× 10^-9 mol· L^-1)为样品进行扫描, 再加入相应化合物(1.0× 10^-6 mol· L^-1)体系作为样品溶液, 扫描获得相应的三维荧光光谱。 记录等高线图中特征峰的峰位和峰强度变化。

室温条件下在230~500 nm波长范围内测定CAV-1溶液(1.0× 10^-5 mol· L^-1)和槲皮素溶液(1.0× 10^-5 mol· L^-1)的吸收光谱, 以及CAV-1与槲皮素摩尔比为1∶ 1时的吸收光谱。 在UV-Vis吸收测量中, 通过单独减去PBS的UV-Vis吸收光谱进行背景校正, 对这些化合物的UV-Vis吸收光谱进行了校正。

CAV-1的晶体结构至今尚未解决。 蛋白质数据库(https://www.rcsb.org)中没有CAV-1的晶体结构。 为此, 采用同源模建的方法为CAV-1寻找合适的X射线晶体结构模板^[14]。

登陆NCBI网站, 输入CAV-1的序列检索号AAD23745.1进行检索, 找到CAV-1的蛋白序列, 其蛋白序列如下:

msggkyvdseghlytvpireqgniykpnnkamadelsekqvydahtkeidlvnrdpkhlnddvvkidfedviaepegthsfdgiwkasfttftvtkywfyrllsalfgipmaliwgiyfailsflhiwavvpciksflieiqcisrvysiyvhtvcdplfeavgkifsnvrinlqkei

I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)是一种用于自动化蛋白质结构预测和基于结构的功能注释的在线分析工具^[15]。 提交CAV-1蛋白的氨基酸序列, 模拟生成多个预测模型, 根据I-TASSER提供的置信度分数(C-score)及TM-score挑选合格的模型, 获得模型PDB文件。 根据所提供的配体结合位点, 与槲皮素进行分子对接模拟。

登录DockThor, 上传蛋白文件进行除水、 加氢等自动处理, 上传配体文件并进行加氢, 活性位点定义为“ Blind dDocking” , 整个蛋白被定义为受体, 最后采用蛋白的同源模型结构进行了分子对接分析。 affinity(亲和力/结合能)小于0说明槲皮素与CAV-1可以自发结合, 结合能越小说明两者之间的亲和力越大。 采用PyMOL软件作图进行可视化研究。

应用生物膜干涉技术检测CAV-1与槲皮素体外相互作用, 其采用光干涉信号, 非标记且实时监测, 最大程度保证实验真实性^[16]。 在FORTEBIO Octet K2系统中操作进行生物膜层干涉(bio-layer interaction, BLI)实验, 96孔黑板中每孔加入的试剂体积为200 μ L, 反应温度设置为30 ℃。 首先选择Super Streptavidin(SSA)标记的探针四个, 设置没有固化蛋白的对照传感器, 减去以改善所研究的特异性结合/解离。 提前放入PBST缓冲液中浸湿10 min, 同时将浓度为400 μ g· mL^-1的蛋白与母液浓度为10 mmol· L^-1的生物素化试剂混合进行生物素化, 将混合液加入脱盐柱, 收集流穿并稀释, 获得浓度为200 μ g· mL^-1的生物素化的蛋白。 准备结束后, 基线设置120 s进行平衡, 固定蛋白600 s, 并重新平衡120 s建立新的、 稳定的基线信号。 将探针转移至终浓度依次为100, 50, 25, 12.5和6.25 μ mol· L^-1的槲皮素溶液中进行结合测定, 时间60 s。 将结合后的探针再次转移到缓冲液中进行解离, 时间60 s。 基于BLI原理, 以分子间相互作用大小为判断依据, 亲和力常数(KD值)数值越小亲和力越强, 而分子浓度不影响其数值变化。 从非线性回归后的整体分析进行拟合, 基线校正处理后, 确定一对结合和解离的速率常数, 从而确定一个平衡解离常数, 及响应值, 卡方(χ ²), R²判断拟合的好坏及可信度。

在298和310 K条件下, 蛋白(5.0× 10^-9 mol· L^-1)和不同浓度化合物混合液的光谱分别如图1(a, b)所示。 蛋白质浓度的变化相对较小, 被忽略。 从样品测量中减去与PBS溶液相对应的适当空白, 以校正任何背景荧光。 随着槲皮素的加入, λ _max(发射)几乎没有变化, CAV-1的荧光强度逐渐降低, 表明它们导致蛋白质的荧光被猝灭, 符合静态猝灭机制。 这种形式的内在荧光猝灭可能归因于CAV-1和槲皮素分子的相互作用。 为进一步的理论计算提供了依据。

图1

Fig.1

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	图1 298和310 K下, 不同浓度槲皮素对蛋白荧光猝灭光谱(a, b)Fig.1 Fluorescence quenching spectra of different concentrations of quercetin on proteins at 298 and 310 K (a, b) 0→ 6: 0, 0.5× 10-6, 1.0× 10-6, 1.5× 10-6, 2.0× 10-6, 2.5× 10-6 and 3.0× 10-6 mol· L-1, respectively

为了分析化合物与蛋白的猝灭机制, 使用Stern-Volmer方程分析化合物和蛋白质的荧光猝灭数据^[17]

F0F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q](1)

式(1)中, F₀和F是蛋白的荧光强度和蛋白加入不同浓度的化合物后的荧光强度; K_SV是猝灭常数; K_q为猝灭速率常数; [Q]是化合物的浓度; τ ₀是没有淬灭剂的生物分子的平均荧光寿命(τ ₀=10^-8 s)^[18]。 以F₀/F对[Q]作图, 获得298和310 K的一系列标准曲线(图2)。

图2

Fig.2

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	图2 298和310 K下, 槲皮素对蛋白的相互作用Fig.2 Interaction of quercetin with protein at 298 and 310 K

由图2的Stern-Volmer曲线, 根据直线的斜率可以得到相应温度下K_SV和K_q的值。 结果如表1所示。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 298和310 K下不同化合物与蛋白的KSV和Kq值 Table 1 KSV and Kq values of different compounds and proteins at 298 and 310 K T/K KSV/ (L· mol-1) Kq/ (L· mol-1· s-1) R2 298 7.38× 105 7.38× 1013 0.99 310 1.82× 105 1.82× 1013 0.97

表1 298和310 K下不同化合物与蛋白的KSV和Kq值 Table 1 KSV and Kq values of different compounds and proteins at 298 and 310 K

在298和310 K下, 蛋白的Stern-Volmer曲线均呈现良好的线性关系, 其相关系数分别为0.99和0.97。 K_q值远大于2.0× 10¹⁰ L· mol^-1· s^{-1 [19]}, 并且随着温度的升高K_SV呈下降趋势, 化合物对蛋白的猝灭机制可能是因二者形成了新的络合物而引起了静态猝灭。

根据结合常数和温度之间的关系来区分动态和静态猝灭。 在络合物形成(即静态结合)的情况下, 温度的升高可导致结合常数的减小, 而在动态结合的情况下, 温度的升高导致结合常数的增大^[20]。 对于静态猝灭, 结合常数和结合位点由式(2)^[19]计算。

logF0-FF=logKb+nlog[Q](2)

式(2)中, F₀和F是蛋白的荧光强度和加入不同浓度化合物后的荧光强度; K_b是此反应中的结合常数, n为此反应中的结合位点数。 以log[(F₀-F)/F]为纵坐标log[Q]为横坐标作图, 得到一系列在298和310 K下的标准曲线(图3)。

图3

Fig.3

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	图3 化合物与蛋白的结合常数与结合位点数图Fig.3 Diagram of binding constants and binding sites between compounds and proteins

由log[(F₀-F)/F]对log[Q]图, 得到相应温度下的K_b和n值。 见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 298和310 K下不同化合物与蛋白的Kb和n值 Table 2 Kb and n values of different compounds and proteins at 298 and 310 K T/K Kb/(L· mol-1) n R2 298 2.78× 108 1.474 7 0.99 310 5.45× 105 1.084 6 0.99

表2 298和310 K下不同化合物与蛋白的Kb和n值 Table 2 Kb and n values of different compounds and proteins at 298 and 310 K

由于槲皮素对CAV-1的静态猝灭作用, 随着温度升高, 结合常数变小。 化合物与蛋白质的结合位点受温度影响不大, 说明化合物与蛋白质之间有很强的结合力, 从n值可以看出, 化合物与蛋白质结合时至少有一个结合位点。

进一步计算与结合相互作用相关的热力学参数以确定促进配体-蛋白质形成的主要作用力。 一般来说, 药物与生物分子结合所涉及的各种结合力包括静电力、 氢键、 疏水相互作用(包括Pi-Pi、 Pi-烷基、 Pi-酰胺)和范德华相互作用^[21]。 通过使用Van’ t Hoff方程获得熵变(Δ S)、 焓变(Δ H)和自由能变(Δ G)的值^[22], 分别见式(3)— 式(5)。 小分子与蛋白质之间的主要作用力可以根据Δ H和Δ S的相对大小获得。 结果见表3。

ΔG=-RTlnK(3)

lnK2K1=1T1-1T2ΔHR(4)

ΔS=ΔH-ΔGT(5)

式(3)— 式(5)中, T为绝对温度(298和310 K), K为温度T下的结合常数, R为气体常数(8.314 J· mol^-1· K^-1)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 298和310 K下不同化合物与蛋白的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of different compounds and proteins at 298 and 310 K T/K Δ H/ (kJ· mol-1) Δ S/ (J· K-1) Δ G/ (kJ· mol-1) 298 310 -399.04 -1 177.40 -48.17 -34.04

表3 298和310 K下不同化合物与蛋白的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of different compounds and proteins at 298 and 310 K

据相关研究, 当Δ H> 0和Δ S> 0, 相互作用力主要为疏水作用力; 当Δ H< 0和Δ S< 0, 相互作用力主要为氢键、 范德华力或质子化作用力; 当Δ H≈ 0和Δ S> 0, 相互作用力主要为静电作用力。 槲皮素与CAV-1反应的Δ G, Δ H和Δ S均为负值, 表明结合过程是自发和焓驱动的, 其主要作用力是氢键和范德华力。

按1.2方法测定, 当Δ λ =60 nm时, 以扫描波长和荧光强度分别为横纵坐标, 得到一系列蛋白质加入不同浓度化合物后的荧光曲线(图4)。 从图4可以看出, 随着槲皮素的加入, 化合物的浓度增高, 蛋白质的荧光强度降低, 并且最大发射波长发生了轻微红移。 可见, 槲皮素的加入使CAV-1构象发生改变, 同时Trp 所在的微环境发生变化, 极性增加, 疏水性降低。 进一步证明槲皮素与CAV-1结合为静态猝灭。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 槲皮素的加入对色氨酸微环境的影响Fig.4 Effect of quercetin on tryptophan microenvironment 0→ 6: 0, 2.5× 10-7, 5× 10-7, 7.5× 10-7, 10× 10-7, 12.5× 10-7 and 15× 10-7 mol· L-1, respectively

等高线图中指纹线(λ _ex=230 nm, λ _em=320 nm)处为蛋白质肽链骨架的振动特征峰, 等高线图中指纹线(λ _ex=280 nm, λ _em=350 nm)是酪氨酸和色氨酸残基的特征峰。 加入槲皮素前后CAV-1的三维荧光光谱如图5(a, b)所示。 光谱图坐标轴分别表示激发波长(Ex)、 发射波长(Em)和荧光强度。 从三维荧光光谱图结果中可以看出, 加入槲皮素后CAV-1的荧光强度显著降低, 说明CAV-1与槲皮素发生相互作用。 与荧光猝灭和同步荧光结果一致。

图5

Fig.5

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	图5 CAV-1与槲皮素相互作用前(a)后(b)的三维荧光光谱 槲皮素(0, 1× 10-6 mol· L-1)Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of (b) after (a) before the interaction of CAV-1 with Quercetin Quercetin (0, 1× 10-6 mol· L-1)

采用紫外-可见光谱研究了关于结合机理、 构象变化和蛋白质-底物复合物的形成。 动态猝灭不影响显色团的吸收光谱, 静态猝灭则相反。 芳香族氨基酸残基(Trp和Tyr)在280 nm处有明显的特征峰, 反映了氨基酸的吸收状态^[23]。 图6为槲皮素、 CAV-1及其与槲皮素配合物的紫外-可见光谱, 以进一步证明CAV-1-槲皮素复合物的形成。 结果发现CAV-1紫外-可见吸收光谱的吸收峰在加入槲皮素之后强度明显下降, 表明芳香族残基与黄酮类化合物之间存在有效的相互作用^[24], 并且将两者结合后的可见光谱扣除槲皮素对应光谱, 可以看出CAV-1的光谱和原生CAV-1的光谱没有重叠, 表明CAV-1与槲皮素之间形成了基态复合物, 进一步证实了CAV-1与槲皮素之间的静态猝灭机制。

图6

Fig.6

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	图6 CAV-1与槲皮素体系的紫外可见吸收光谱Fig.6 UV-Vis absorption Spectra of CAV-1 and Quercetin system

通过I-TASSER分析发现, 该蛋白是α -β 蛋白, 其中包含四个α -螺旋(红色)和两个β -链(蓝色)。 在结构组装模拟之后, I-TASSER使用TM-align结构比对程序将第一个I-TASSER模型与PDB库中的所有结构进行匹配, 获得具有最相似结构的蛋白质(TM-score=0.761), 由于结构相似, 这些蛋白质通常具有与靶标相似的功能。 基于I-TASSER结构预测的COFACTOR和COACH对目标蛋白的生物学注释, 选择具有高置信度得分(C-score=0.13)的配体(PDB Hit: 1 oczB)为对接提供配体结合位点。

分子对接技术是一种模拟配体在受体结合位点结合过程的计算方法。 获得的功能模板与槲皮素进行分子对接。 将DockThor对接结果进行“ Analyze” , 槲皮素与蛋白结合力及亲和力为-7.372 kcal· mol^-1, 表明槲皮素成分对蛋白具有较好的亲和力。 选择对接结果“ Protein” 中处理好的蛋白与“ Result” 中的最佳的化合物状态“ Bastranking” , 运用Pymol进行可视化处理, 如图7所示。 分子对接结果发现槲皮素结合点位于由GLU20, ASP70, VAL16和ARG19等氨基酸位点形成的作用口袋中, 与GLN21, VAL16和ARG19产生范德华力作用, 与GLU20和ASP70形成分子内氢键, 从而影响微环境变化, 导致了其荧光性质猝灭。 此结果与热力学结果一致。

图7

Fig.7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 CAV-1与槲皮素分子对接最优结构图 (a): 氢键作用3D图; (b): 相互作用2D图Fig.7 CAV-1 and quercetin molecule docking optimal configuration (a): Hydrogen key action 3D map; (b): interaction 2D

由于BLI技术灵敏度高, 可以快速实时跟踪小分子化合物与蛋白质的动态结合过程, 可以定量研究被测对象之间的亲和力特征, 本部分实验采用该技术研究槲皮素与CAV-1结合的特异性, 并量化两者之间的亲和力。 如图8所示, 纵轴和横轴分别代表不同浓度槲皮素的光移动距离(nm)和吸附/解吸时间(s)。 槲皮素和CAV-1的结合响应信号值随着槲皮素浓度的增加而增强, 表明槲皮素和CAV-1为特异性结合。 经机器自带软件ForteBio Data Analysis分析计算, 得到其分子动力学分析结果(表4)。 曲线R²=0.914 8, X²=0.075 8拟合较好, KD值为2.50× 10^-5 mol· L^-1, 显示出槲皮素与CAV-1蛋白较强的结合力。

图8

Fig.8

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图8 BLI法检测槲皮素与CAV-1的结合解离曲线及拟合曲线Fig.8 BLI method detection of the combined dissociation curve and fit curve of quercetin and CAV-1

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 BLI法检测槲皮素与CAV-1的分子动力学分析结果 Table 4 BLI method detection of molecular dynamics analysis results of quercetin and CAV-1 CONC./ (μ mol· L-1) RESPONSE KD/ (mol· L-1) FULL X2 FULL R2 6.25 0.044 7 12.5 0.045 7 25 0.061 5 2.50× 10-5 0.075 8 0.914 8 50 0.094 1 100 0.112 2

表4 BLI法检测槲皮素与CAV-1的分子动力学分析结果 Table 4 BLI method detection of molecular dynamics analysis results of quercetin and CAV-1