本研究中使用的所有动物程序均按照中国动物福利法进行, 并得到中国医学科学院放射医学研究所实验动物护理和使用伦理委员会的批准。 选取70只健康的成年雄性Sprague Dawley大鼠进行模型制备, 体重均为230~240 g, 将其按照脑缺血时间(0, 0.5, 1, 2, 4, 6和24 h)随机分为7个小组, 包括6个脑缺血模型组与1个对照组, 每组10只大鼠。 采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型^[14]。 对实验组大鼠腹腔注射质量分数为3.5%的水合氯醛, 使其进入深度麻醉状态后将其仰卧固定在手术台上, 颈部备皮, 在大鼠右侧大脑中动脉置入直径0.34 mm的线栓以阻断脑血流。 模型制备成功后, 在相应的缺血时间点进行样品采集。 采用枕骨大孔直接穿刺法对无色透明的脑脊液进行取样, 采集量为60~100 μ L。 采用眼眶静脉丛采血法对血浆进行取样, 之后通过离心获得呈无色透明的血清, 采集量为500 μ L。 将脑脊液和血清样品均放置于-4 ℃环境中低温保存, 在取样后12h内完成液体样品的太赫兹时域光谱检测, 以确保实验的准确性。

实验采用日本Advantest公司的TAS7500型太赫兹时域光谱仪进行样品光谱检测, 为了获得较高信噪比的太赫兹光谱, 我们将光谱分辨率设置为7.6 GHz, 太赫兹频率范围设置为0.5~2.0 THz, 测量模式为衰减全反射(attenuated total reflection, ATR)。 为了降低空气中水蒸气对实验的干扰, 实验过程中采用密闭罩将光路系统封闭, 并在每次测量前向其中充入干燥空气, 测量过程中相对湿度保持在1%~4%, 温度保持在(23± 1) ℃, 整个过程可以忽略样品的蒸发。 图1为衰减全反射式太赫兹时域光谱系统示意图。 系统中采用高阻硅材质(n=3.42)制成的全反射棱镜, 太赫兹光束经离轴抛面镜聚焦后, 以57° 的入射角入射至全反射棱镜, 焦点位于全反射棱镜表面。 利用移液枪吸取和转移容量为60~80 μ L的液体样本, 滴在棱镜表面, 倏逝波与样品相互作用后, 携带样品信息的太赫兹波经两个离轴抛面镜后被探测器接收。 测量结束后, 用蒸馏水、 酒精和擦镜纸擦拭干净棱镜表面。 每种样本均重复上述样本测量过程, 保证实验条件的一致性。

图1

Fig.1

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	图1 衰减全反射式太赫兹时域光谱系统示意图Fig.1 Schematic diagram of the ATR terahertz time-domain spectroscopy system

为了验证MCAO模型的手术成功性, 每组中随机取出1个新鲜脑组织进行氯化三苯基四氮唑(TTC)染色, 以评估不同脑缺血时间引起的脑组织缺血程度^[15]。 正常组织中的脱氢酶与TTC发生反应呈红色, 而缺血脑组织中的脱氢酶活性下降, 无法被TTC染色或染色较浅, 因此根据着色部位和着色程度可以初步识别脑组织的缺血区域和脑缺血严重程度。 当缺血时间小于4 h时, 左右脑组织的TTC着色程度没有明显差异^[13], 因此, 只选取缺血时间在4 h之后的脑组织进行染色。 实验中对脑组织的不同位置进行切片染色, 如图2(a)所示, 图2(b)是脑缺血时间分别为4, 6和24 h脑组织的TTC 染色结果。 由图可知, 缺血4 h的左右脑组织基本呈红色; 缺血6 h的右脑组织开始呈白色而左脑无明显变化; 当缺血时间达到24 h时, 左右脑组织几乎完全呈白色, 说明坏死区向周围浸润, 缺血性脑损伤严重。

图2

Fig.2

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	图2 (a) 大鼠脑组织实物图; (b) 缺血4, 6和24 h的新鲜脑组织的TTC染色结果Fig.2 (a) Image of brains inrats; (b) TTC staining results of fresh brains of cerebral ischemia at 4, 6 and 24 h

脑脊液是存在于脑室以及蛛网膜下腔内的一种体液, 血清是血浆经过离心后去除纤维蛋白原和凝血因子后的部分, 临床上常用这两种样本作为反映身体机能和健康状况的病理学检测样本^[16]。 我们测量了脑缺血和正常大鼠的脑脊液和血清样品的太赫兹光谱。 为了减小系统不稳定性带来的测量误差, 我们在实验中对单一样本反复进行5次测量。 进一步, 为了剔除反复测量得到的光谱数据中的异常值, 提取每组样本太赫兹光谱图中若干频点处的吸收系数和折射率, 计算这些频点处数据的均值和四分位数, 根据上下四分位数绘制对应的箱形图, 以此来排除在箱形图中超过1.5倍四分位间距(interquartile range, IQR) 的数据异常值^[17]。 将每组样本剔除数据异常值后的光谱取平均值, 计算出脑脊液和血清样本的太赫兹波吸收系数和折射率, 如图3所示。 从图中可知, 当频率从0.5 THz增加到2.0 THz时, 不同脑缺血时间的大鼠脑脊液和血清的吸收系数随频率增加而单调上升, 折射率随频率增加而单调下降。 图3(a)和(b)分别为脑脊液的吸收系数和折射率, 插图显示了在1.2~1.6 THz范围内的放大图。 如图3(a)所示, 当太赫兹波频率范围为0.5~1.0 THz时, 不同脑缺血时间的大鼠脑脊液的吸收系数和折射率没有明显变化。 当太赫兹波频率范围在1.0~2.0 THz时, 相比于正常组, 脑缺血时间为0.5, 1和2 h的大鼠脑脊液吸收系数逐渐下降, 且均低于正常组; 脑缺血时间为4和6 h的大鼠脑脊液吸收系数逐渐增大, 且均高于正常组。 当脑缺血时间达到24 h时, 大鼠脑脊液的吸收系数再次下降, 且低于脑缺血2 h的脑脊液吸收系数。 而在1.0~2.0 THz范围内, 脑缺血时间为0.5和1 h的大鼠脑脊液折射率逐渐上升, 且均高于正常组; 脑缺血时间为2, 4和6 h的大鼠脑脊液折射率逐渐降低, 且均低于正常组。 脑缺血时间为24 h的脑脊液折射率显著上升, 且高于脑缺血时间为1 h的脑脊液折射率。 由此可知, 吸收系数随缺血时间的变化与折射率随缺血时间的变化呈相反趋势。 图3(c)和(d)为大鼠血清的太赫兹波吸收系数和折射率, 插图显示了在1.2~1.6 THz范围内的放大图。 由图3(c)可知, 在0.5~1.0 THz频率范围内, 不同脑缺血时间的大鼠血清的吸收系数没有明显变化。 当太赫兹波频率范围在1.0~2.0 THz时, 脑缺血时间为0.5, 1, 2, 4和6 h的大鼠血清的太赫兹波吸收系数均高于正常组, 其中, 脑缺血时间为0.5 h的大鼠血清的吸收系数与正常组的差异较小, 脑缺血时间为1和2 h的大鼠血清的吸收系数与正常组的差异较为明显。 随着缺血时间的进一步增加, 大鼠血清的吸收系数逐渐下降至接近正常组水平, 当脑缺血时间达到24 h时, 吸收系数低于正常组。 大鼠血清的太赫兹波折射率变化趋势与吸收系数变化趋势相反。 在0.5~1.0 THz频率范围内, 不同脑缺血时间的大鼠血清的折射率没有明显变化。 在1.0~2.0 THz频率范围时, 脑缺血时间为0.5, 1, 2, 4和6 h的折射率均低于正常组, 当脑缺血时间达到24 h时, 血清折射率明显上升, 且高于正常组。 为了更清楚地观察脑脊液和血清的吸收系数及折射率随缺血时间的变化情况, 选择了1.5 THz处的吸收系数和折射率进行归一化处理, 结果如图3(e)所示。 上述分析表明, 脑缺血引发的一系列生理反应会破坏大鼠血脑屏障的渗透性及其结构功能性, 导致脑脊液和血清中某些生物分子的含量发生变化, 不同缺血时间的脑脊液和血清的吸收系数和折射率与正常组之间的差异可以反映出上述变化。 值得注意的是, 脑脊液和血清的太赫兹光谱特征与正常组的差异有所不同。 例如, 在1.6 THz处, 正常组与缺血1 h组的大鼠脑脊液吸收系数差值为14.19 cm^-1, 而在血清中此差值为49.92 cm^-1。 同样地, 在缺血时间为0.5和2 h组, 大鼠脑脊液的吸收系数与正常组的差值分别为7.39和29.77 cm^-1, 而大鼠血清的吸收系数与正常组的差值分别为和16.41和45.79 cm^-1, 明显大于脑脊液的吸收差异。 综上可知, 脑脊液和血清均可以作为脑缺血的早期诊断指标, 且血清对早期脑缺血的病理变化比脑脊液更为敏感。

图3

Fig.3

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	图3 不同缺血时间大鼠脑脊液的(a)吸收系数, (b)折射率; 不同缺血时间大鼠血清的(c)吸收系数, (d) 折射率; (e) 1.5 THz处归一化处理后的血清和脑脊液的吸收系数和折射率与缺血时间关系图Fig.3 THz spectra of CSF and serum (a) absorption coefficient and (b) refractive index spectra of CSF; (c) absorption coefficient and (d) refractive index spectra of serum; (e) the normalized absorption coefficient and refractive index values at 1.5 THz

由于系统误差、 测量误差等因素, 不同脑缺血程度大鼠的脑脊液与血清的太赫兹光谱部分区域相互重叠, 对缺血程度的分类识别造成了一定的困难。 为了实现更为精确、 科学的脑缺血识别, 基于主成分分析(principal component analysis, PCA)和机器学习分类器相结合的方法对脑脊液和血清的太赫兹吸收系数进行分类与识别^{[18, 19, 20]}。 首先, 在对不同脑缺血时间的大鼠脑脊液和血清的太赫兹光谱进行剔除异常值的处理后, 将光谱数据进行汇总, 分别建立脑脊液和血清的可用光谱数据库, 如表1所示, 脑脊液和血清的太赫兹吸收系数总数分别为90和117。 将吸收系数按照不同脑缺血时间划分为0组、 1组、 2组和3组, 其中, 对照组为0组; 脑缺血1和2 h样本的太赫兹光谱变化趋势相似, 因此将其均划分为1组; 同理, 将脑缺血4和6 h样本的太赫兹光谱数据划分为2组; 脑缺血24h样本的太赫兹光谱数据为3组。 在数据库有限的情况下, 通过这种方式来增加各组的数据量, 可以有效避免光谱分类精度的大幅度下降。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 脑脊液和血清的太赫兹光谱数据库 Table 1 THz spectroscopy data base size of CSF and serum Classes (Ischemia time) 0 (0 h) 1 (1~2 h) 2 (4~6 h) 3 (24 h) Total CSF 27 25 21 17 90 Serum 28 39 35 15 117

表1 脑脊液和血清的太赫兹光谱数据库 Table 1 THz spectroscopy data base size of CSF and serum

为了提高分类效率, 采用PCA分别对分组后的脑缺血大鼠脑脊液和血清的吸收系数进行数据降维和特征提取, 便于进一步的光谱识别与分类研究。 选取在0.5~2.0 THz频率范围内的225个频点处的脑脊液和血清的太赫兹吸收系数为输入数据进行PCA处理。 图4为PCA处理后的前5个主成分的特征值(eigen value, EV)和累计方差贡献率(cumulative percentage of variance, CPV)。 由图可知, 随着主成分(principal component, PC) 数量的增加, 特征值迅速下降, 前3个PC的累计方差贡献率均达到了99%以上, 分别为99.54%和99.32%, 这说明, 前3个PC组成的特征数据集即可准确描述原始吸收系数。 图5(a)与(b)分别为基于脑脊液和血清的太赫兹吸收系数经PCA处理后的二维主成分散点图。 每个散点代表一个样品, 并且它们的类别具有不同的颜色, 代表不同的分组。 在散点图上, 基于95%的置信区间绘制了置信椭圆。 可以看出, 四组样品在每个二维分布散点图上均具有较好的聚类性。

图4

Fig.4

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	图4 前5个主成分的特征值和累计方差贡献率Fig.4 Eigenvalue and cumulative percentages of the variance of the first 5 PCs

图5

Fig.5

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	图5 PCA处理结果 (a): 脑脊液光谱主成分散点图; (b): 血清光谱主成分散点图Fig.5 Analysis results of PCA (a): 2D scatter plot of CSF spectra principal components; (b): 2D scatter plot of serum spectra principal components

在此基础上, 分别采用k-最近邻(k-nearest neighbor, kNN)和支持向量机(support vector machine, SVM)两种分类算法对不同脑缺血程度的大鼠脑脊液和血清的太赫兹光谱进行分类识别^[7]。 由于样品量相对较小, 首先使用交叉验证方法评估分类模型的性能, 从PC数据中随机选取80%的吸收系数的数据作为训练集, 其余的20%作为测试集。 基于不同样品的数据库和不同分类方法, 分别训练了四个分类模型: 基于脑脊液的kNN分类模型和SVM分类模型, 基于血清的kNN分类模型和SVM分类模型。 为了防止模型训练过程中出现过拟合, 对kNN分类算法参数进行了优化, 将近邻数k值设置为3, 并采用曼哈顿距离对样品数据之间的距离进行判别。 SVM采用高斯函数作为算法核函数, 可有效解决光谱数据线性不可分的问题, 并采用“ 一对多” 策略实现多类别分类。 在模型训练过程完成之后, 使用测试集评估每个分类模型的性能。 图6显示了一组测试中光谱数据在不同分类模型中的预测结果, 其中, 横坐标表示真实分类结果, 纵坐标表示预测分类结果。 从图中可以看出虽然不同分类模型对同组数据的预测结果不同, 但均可保持较高的分类准确率。 根据多次预测结果取平均值, 得到了分类模型的两类性能参数: 准确率与F1值, 如表2所示。 其中, 准确率为预测正确的样本个数占所有样本个数的比例, F1值为灵敏度和特异性的调和均值, 可作为某一组样本的漏诊率和误诊率的综合参考。 从表2中可以看出, 四个分类模型的分类准确率均达到了86%以上, 其中, 基于脑脊液吸收系数的SVM分类模型的识别准确率最高, 达到了89.3%, 且预测每一组样本的F1值相对稳定, 即在相对较高的灵敏度和特异性下对每一组样本进行了分类识别。 基于以上分析得出, 根据大鼠脑脊液和血清的吸收系数, 可以通过kNN和SVM分类模型对脑缺血的严重程度进行自动识别与分类。

图6

Fig.6

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	图6 分类模型的预测结果 (a): 脑脊液光谱的kNN分类器; (b): 血清光谱的kNN分类器; (c): 脑脊液光谱的SVM分类器; (d): 血清光谱的SVM分类器Fig.6 Prediction results of classification models (a): kNN classifier based on CSF spectra; (b): kNN classifier based on serum spectra; (c): SVM classifier based on CSF spectra; (d): SVM classifier based on serum spectra

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同分类模型的性能参数 Table 2 Prediction parameter of varied classification models Classification method Sample type Accuracy/% F1-score/% Class 0 Class 1 Class 2 Class 3 kNN CSF 88.6 78.3 95.2 95.7 85.7 Serum 86.7 90.9 75.5 83.9 100 SVM CSF 89.3 93.3 83.3 85.7 93.3 Serum 87.5 85.7 82.4 82.4 100

表2 不同分类模型的性能参数 Table 2 Prediction parameter of varied classification models