在SERS光谱中, 尿液与芬太尼类在1 000与1 030 cm^-1两处特征峰高度重合。 芬太尼类物质主要特征峰几乎被尿液背景峰所覆盖。 为了提取出芬太尼类SERS光谱, 利用算法对尿液背景峰进行扣除, 还原芬太尼类物质原本SERS光谱特征, 建立尿液与芬太尼类SERS光谱解析模型, 通常使用高斯线型进行谱峰解析, 拉曼谱峰实际线型更贴近劳伦兹线型^[18]。 但是由于检测仪器与样本的不同, 实际SERS光谱特征峰更接近Voigt线型。 Voigt线型定义如式(1)所示^[19]

A(x)=αβexp4(x-ω)2ln2φ2+(1-α)βφ2(x-ω)2-φ2(1)

式(1)中, α 为高斯-劳伦兹系数; β 为峰高; x为拉曼位移; ω 为峰位; φ 为半峰宽, 可直接影响Voigt线型。 待解析光谱则可视为n个Voigt峰之间的叠加。 如式(2)所示

AA(x, θ)=∑\mathrm{i=1}nAi(x, θi)(2)

式(2)中, θ _i为解析模型中第i Voigt线型的需要求解的参数。 针对以上解析模型, 一般使用非线性最小二乘法对n以及需要求解的参数进行迭代, 寻找其最优解。 由于噪声干扰与荧光背景, 结合对初始值不敏感的无约束非线性优化算法(Nelder-Mead算法)进行参数迭代。

尿液与芬太尼类SERS光谱谱峰大多为单峰与重叠峰。 在进行单峰谱峰解析时, 光谱片段噪声与荧光背景不多, 可直接对其进行迭代计算。 但尿液中芬太尼类SERS光谱1 000与1 030 cm^-1处为重叠峰。 在进行重叠峰分解时, 其为多个谱峰的叠加且噪声等干扰较多, 不能单独进行分解, 需对其进行联合分解, 并考虑其重叠部分。 本文提出在进行谱峰解析前直接设定需要解出谱峰的个数N, 并对其进行迭代参数粗略的预估与设计。 对重叠峰的谱峰分解步骤如下所示:

(1)载入光谱片段, 去基线, 并对处理后的光谱进行峰值归一化;

(2)初始化分解峰集合Ω ={}与光谱解析峰的个数N=1;

(3)对ω (峰位)、 φ (半峰宽)与α (高斯-劳伦兹系数)进行预估;

(4)利用Nelder-Mead算法进行迭代, 并计算拟合光谱与原始光谱的误差, 然后将拟合峰存入Ω 中;

(5)若误差小于0.1, 则其算法结束, 集合Ω 即为背景光谱的所有解析峰, 若误差大于0.1, 则需拟合峰的个数N+1, 返回步骤(3)继续算法。

在步骤(3)中对ω (峰位)的预估的方法与峰个数N与光谱起始位置有关, 将光谱平均分成N等份, 以分割线的位置作为ω (峰位)的预估值。 等份的长度作为φ (半峰宽)的预估值。 α (高斯-劳伦兹系数)初始值为0.4。

为了还原其中芬太尼类物质SERS特征峰, 不仅需要对其进行谱峰分解, 还需扣除尿液背景峰。 在进行谱峰解析后, 根据拉曼特征峰的特点对分解峰进行滤除, 自动扣除尿液背景干扰, 还原芬太尼类SERS光谱。 利用SERS光谱特征半峰宽对芬太尼类光谱进行还原步骤如下所示:

(1)载入光谱片段, 并对光谱进行谱峰解析, 得到其分解峰集合Ω ;

(2)计算原始光谱1 000与1 030 cm^-1处半峰宽x₁与x₂;

(3)若集合Ω 中解析峰半峰宽x_Ω ∈ [x₂, x₁], 则该分解峰计入芬太尼类SERS光谱分解峰中, 反之则计入尿液背景峰中;

(4)对芬太尼类SERS光谱分解峰集合进行拟合, 并在标准品数据库中进行搜索, 用相似系数HQI作为物质分类的标准, HQI计算公式如式(3)所示:

HQI=∑m∑n(Amn-A̅)(Bmn-B̅)∑m∑n(Amn-A̅)2∑m∑n(Bmn-B̅)2(3)

(5)遍历光谱库中标准品SERS光谱后, 匹配系数最大且高于85%的标准谱为最终结果。

式(3)中, A为待识别光谱数据, B为数据库中光谱数据, A与B的第一行为光谱拉曼位移第二行为光谱相对位移。 A̅与 B̅是矩阵A与B的均值, m与n分别为矩阵的行数与列数。

SERS增强基底由安徽中科赛飞尔科技有限公司提供。 呋喃芬太尼、 乙酰芬太尼与奥芬太尼均来自安徽省公安厅物证鉴定中心。 在整个实验过程中使用的超纯水为18.25 MΩ · cm。

尿样来自于中国科学院合肥肿瘤医院, 分别将三种芬太尼加入到人的尿样中, 分别制备成含有50, 10, 1和0 mg· kg^-1三种芬太尼类物质的模拟尿样。

手持式拉曼光谱仪由安徽中科赛飞尔科技有限公司提供, 具体配置为: 焦距为7.5 mm, 光谱分辨率为7 cm^-1, 光斑范围1 μ m², 激光波长785 nm, 最大功率为500 mW。 数据分析所用软件为: Matlab 2016b。 电脑配置为: Intel core i7-9750 H。

每种浓度样品各准备10个样品, 每个样品测20条光谱。 部分SERS光谱数据如图1所示。 分析尿液与芬太尼类拉曼特征, 发现其在1 000与1 030 cm^-1处高度重合, 于是选取935~1 100 cm^-1拉曼片段进行谱峰分解。

图1

Fig.1

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	图1 尿液与含不同芬太尼尿样的SERS光谱对比图Fig.1 Comparison of SERS spectra of urine and urine containing different fentanyl

在进行谱峰分解时, 需要选择合适的线型对光谱片段进行解析。 线型的选择与解析结果密切相关。 通常使用高斯线型对光谱谱峰进行解析, 但是其拟合效果较差, 无法较精准拟合原始光谱, 容易出现峰位偏移与峰形畸变。 检测仪器与检测样本的不同, 洛伦兹线型并不能还原芬太尼类标准品的拉曼特征, 几乎无法对模型进行求解。 但高斯线型与劳伦兹线型特点相结合的Voigt线型对谱峰进行分解, 其对尿液中芬太尼类物质特征有较为准确的解析, 它能够扣除尿液背景峰, 还原芬太尼类物质拉曼特征峰。 三种函数线型如图2所示。

图2

Fig.2

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	图2 Voigt线型、 洛伦兹线型和高斯线型三种函数线型的对比Fig.2 Comparison of the Voigt, Lorentz and Gaussian line types of functions

由图2可以看出这三种线型的半峰宽、 峰高与峰位一致时, 差距主要在谱线下半部分。 谱线的半峰宽主要分为均匀半峰宽、 非均匀半峰宽和综合半峰宽这三大类。 洛伦兹线型属于均匀半峰宽的谱线轮廓, 是理论中符合拉曼光谱特征的线型。 高斯线型是多普勒频移效应导致的非线性半峰宽, 是大部分谱峰解析时使用的线型。 Voigt线型则是典型的综合半峰宽, 其谱线展宽并不是单一存在而是多种的叠加, 但高斯线型与洛伦兹线型是单一谱线半峰宽的线型。 然而在实验中导致谱线展宽的因素并不唯一, 所以选择Voigt线型设计谱峰解析模型。 洛伦兹线型在此解析方法中无法得出结果, 图3仅展示高斯线型与Voigt线型的解析结果对比图。

图3

Fig.3

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	图3 高斯线型与Voigt线型的解析结果对比图Fig.3 Comparison of the resolution results for Gaussian and Voigt line shapes

通过图3可以看出使用高斯线型与Voigt线型对尿液中奥芬太尼SERS光谱同一片段进行谱峰解析时, 虽然两者拟合光谱与原始光谱相似度均超过0.99, 但是在上图中也能明显看出Voigt线型的拟合效果明显优于高斯线型的拟合效果, 高斯线型拟合结果明显出现峰位的偏移。 且在解析峰集合中高斯线型解析结果中也并不含有奥芬太尼特征的解析峰, 而Voigt线型解析峰中包含奥芬太尼特征的解析峰。 这为尿液基质背景峰的扣除以及芬太尼类特征峰的还原提供了基础条件。

尿液背景峰与芬太尼类拉曼特征峰在1 000与1 030 cm^-1几乎完全重合。 而在芬太尼类SERS光谱中特征峰也在1 000与1 030 cm^-1处, 由此对尿液中芬太尼类混合SERS光谱高度重合部分935~1 100 cm^-1进行谱峰解析。 解析结果大致如图4所示。

图4

Fig.4

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	图4 谱峰解析结果Fig.4 Results of spectral peak resolution

由图4可知, 在进行谱峰分解后得出的是一个Voigt峰的集合。 集合中包含芬太尼类物质拉曼峰和尿液背景峰。 根据拉曼峰特征对Voigt峰的集合进行筛选, 提取其中芬太尼类SERS光谱, 扣除尿液背景峰。 通过分析尿液与芬太尼类标准品SERS光谱1 000与1 030 cm^-1两处拉曼特征峰进行分析, 发现其在半峰宽处有较大的差异。 根据这一特点设置条件, 对Voigt峰的集合进行筛选。

首先计算原始光谱1 000与1 030 cm^-1处半峰宽x₁与x₂, 将集合Ω 中解析峰半峰宽x_Ω 与其进行对比, 若解析峰半峰宽x_Ω 在x₂与x₁之间, 则该分解峰计入芬太尼类SERS光谱分解峰中, 反之则为尿液背景峰。 最后对芬太尼类还原光谱进行拟合, 作为扣除尿液背景后还原的芬太尼类光谱。 其还原效果如图5所示。

图5

Fig.5

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	图5 尿液中芬太尼类SERS光谱还原效果Fig.5 Reduction effect of fentanyl SERS spectra in urine

根据图5可以看出, 尿液中芬太尼类SERS光谱还原效果较好。 还原后的芬太尼类光谱与标准品SERS光谱相似度均在95%以上, 且1 000与1 030 cm^-1两处光谱的半峰宽与峰比例几乎一致, 符合芬太尼类SERS光谱特征。 因此, 可利用还原后芬太尼类SERS光谱进行光谱类别判断。

由于尿液背景中与芬太尼类强信号峰1 000与1 030 cm^-1高度重合, 直接对两种物质进行建库与识别时, 仅依靠峰位的识别方法已经无法进行区分。 而使用相似度识别方法也并没有较大的差距, 光谱之间的相似度均达到99%以上。 对于仪器分辨率不高的手持式拉曼而言几乎无法进行区分。 同样, 与芬太尼类标准品SERS光谱进行匹配时, 其也几乎无法准确识别。 尿液中芬太尼类SERS光谱匹配情况如图6所示。

图6

Fig.6

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	图6 尿液中芬太尼类SERS光谱匹配情况Fig.6 SERS spectra matching of fentanyl in urine

根据图6可知, 尿液中芬太尼类SERS光谱的识别效果并不理想。 对光谱强信息片段进行谱峰分解并还原的光谱进行种类识别发现, 其识别效果有一定程度上的提高。 虽然仍然无法通过峰位的方法进行识别与区分, 但是由于其高度还原了芬太尼类SERS光谱的特征峰特征, 包括半峰宽、 峰高以及峰比例。 因此可以利用芬太尼类标准品SERS光谱进行建库, 再利用相似系数作为判断依据进行识别。

尿液中芬太尼类SERS光谱识别步骤如下所示。 首先使用芬太尼类标准品SERS光谱数据进行建库, 并对其进行平滑去噪处理; 接着对待识别光谱进行谱峰解析并扣除尿液背景还原SERS光谱特征; 然后进行相似系数计算; 最后得出对应芬太尼类别。

根据图7可知, 相比未进行还原的尿液中芬太尼类SERS光谱而言, 其识别效果有一定程度的改善。 且具有一定的区分度, 在一定程度上可以减少分辨率较低的手持式拉曼检测仪数据识别的问题。 在对数据分解还原的过程中, 对于纯尿液光谱数据而言, 还原光谱仍然保留纯尿液光谱特征, 分解峰集合中。 这表明所建立的数学模型适合进行尿液中某些物质的SERS光谱识别与分析。

图7

Fig.7

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	图7 还原光谱识别效果Fig.7 Recognition effect of reduction spectrum

针对上述中纯尿液与尿液中芬太尼类SERS光谱进行谱峰分解时产生的不同情况进行分析, 在纯尿液进行1 000与1 030 cm^-1处进行谱峰分析时, 其并不会分解出含有芬太尼类的谱峰。 而尿液中含有芬太尼类物质时, 则可利用谱峰解析出含芬太尼类光谱的特征峰, 并根据还原光谱对芬太尼种类进行有效区分。 针对此种情况将从以下两个方面进行探究: 一是混合光谱, 二是分子振动。

在进行尿液中芬太尼类SERS光谱分析时, 发现尿液中不同种类的芬太尼其特征峰1 000与1 030 cm^-1的半峰宽与峰高之间具有一定差距。 芬太尼类标准品SERS光谱的半峰宽和峰高与纯尿液本身具有较大的差距。 尿液中的芬太尼类SERS光谱在半峰宽与峰高间也存在着较大的差异。 纯尿液拉曼特征峰与芬太尼类拉曼特征峰的差异如图8所示。

图8

Fig.8

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	图8 尿液与芬太尼类拉曼特征峰及其振动模式Fig.8 Raman characteristic peaks of urine and fentanyl and their vibration modes

由图8可知, 纯尿液SERS光谱在1 000 cm^-1处特征峰半峰宽较宽, 而芬太尼类在此处半峰宽都较窄。 且纯尿液与芬太尼类SERS光谱1 000与1 030 cm^-1之间的峰高比例也不同。 而尿液与芬太尼类物质不会发生新的化学反应, 所以当两种物质混合在一起时光谱也会具有半峰宽与峰高上的特征。 而谱峰分解模型中半峰宽与峰强对解析结果有影响, 所以采用此方法可以还原芬太尼类拉曼特征峰, 扣除尿液背景干扰。 芬太尼类SERS光谱特征峰半峰宽与峰高不同的原因是分子振动模式与振动频率的不同。 图8中包含三种芬太尼1 000与1 030 cm^-1处的分子振动模式。 ν 为伸缩振动, δ 为面内变形振动。

由图8可以看出三种芬太尼两处特征峰的振动位置与振动模式均不相同, 乙酰芬太尼1 000 cm^-1处谱峰归因于B2上C=C的面内弯曲振动, 1 030 cm^-1处谱峰归因于pip上C— C伸缩振动^[20]。 呋喃芬太尼分子在1 000 cm^-1处则是B1上C=C两个单取代的面内弯曲振动造成的, 1 030 cm^-1处的峰位来源于B2上C=C拉伸与C— H弯曲的组合振动^[11]。 奥芬太尼其1 000 cm^-1处强峰是由B2上C=C的面内振动产生, 1 030 cm^-1处则是B1与B2上C=C伸缩组合振动引起。 这种振动模式与位置的差异直接导致SERS光谱的差异, 可通过还原光谱对其进行种类区分。