引用本文
陈珊, 林兰, 陈钧, 刘樱. 利用拉曼光谱技术研究低剂量X射线辐射对人神经母细胞瘤细胞的影响. 光谱学与光谱分析, 2023,43(1): 129-132
CHEN Shan, LIN Lan, CHEN Jun, LIU Ying. Study on the Radiobiological Effects of Low-Dose X-Ray on Human Neuroblastoma Cells by Raman Spectroscopy. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2023,43(1): 129-132.  
Doi: 10.3964/j.issn.1000-0593(2023)01-0129-04
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利用拉曼光谱技术研究低剂量X射线辐射对人神经母细胞瘤细胞的影响
陈珊1, 林兰2, 陈钧3, 刘樱1,*
1. 中国工程物理研究院材料研究所, 四川 绵阳 621907
2. 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室分子医学中心, 四川 成都 610041
3. 表面物理与化学重点实验室, 四川 江油 621908
*通讯作者 e-mail: liuying2016@caep.cn

作者简介: 陈 珊, 1988年生,中国工程物理研究院材料研究所助理研究员 e-mail: 574853882@qq.com

收稿日期: 2021-11-04 接受日期: 2022-03-16
基金项目: 国家自然科学基金项目(11705170, 21573223),中国工程物理研究院材料研究所特聘人才基金项目(TP02201709)和重点实验室稳定支撑项目(WDZC201901)资助
摘要

低剂量电离辐射引发的生物效应复杂而多样, 其研究往往又受到辐射标志物和检测技术手段的限制。 将拉曼光谱技术应用于低剂量辐射生物效应研究, 利用10 mW, 532 nm共聚焦拉曼光谱对经过100, 200和500 mGy三种辐射剂量的X射线辐照之后的人神经母细胞瘤细胞进行检测, 发现细胞嘌呤核苷酸(722~728和1 572~1 581 cm-1等等)、 嘧啶核苷酸(770~785 cm-1等等)等DNA相关的拉曼特征峰受到电离辐射影响而发生变化, 说明低剂量X射线辐照造成细胞DNA水平改变。 采用流式细胞术对同样条件辐照后培养6 h的人神经母细胞瘤细胞进行细胞周期分析发现, 三种剂量的X射线电离辐射均造成细胞在G2期阻滞, 同样提示电离辐射引起DNA水平升高。 通过划痕实验分析辐照后20 h的细胞迁移能力, 结果显示, 相较于未接受X射线照射的对照细胞, 受到三种剂量电离辐射的人神经母细胞瘤细胞均出现迁移水平下降。 研究结果表明, 通过拉曼光谱分析发现低剂量X射线电离辐射引起人神经母细胞瘤细胞DNA水平变化, 其结果与细胞周期分析和迁移分析的结果相一致, 但检测时间大大提前, 利用拉曼光谱技术可以实现低剂量辐射损伤等细胞生物学效应的早期发现与监测。

关键词: 拉曼光谱; 低剂量电离辐射; 辐射生物效应
中图分类号:O657.3 文献标识码:A
Study on the Radiobiological Effects of Low-Dose X-Ray on Human Neuroblastoma Cells by Raman Spectroscopy
CHEN Shan1, LIN Lan2, CHEN Jun3, LIU Ying1,*
1. Institute of Materials, China Academy of Engineering Physics, Mianyang 621907, China
2. Molecular Medicine Research Center, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
3. Science and Technology on Surface Physics and Chemistry Laboratory, Jiangyou 621908, China
*Corresponding author
Abstract

The biological effects induced by low-dose ionizing radiation are complex and diverse. Radiation biomarkers and detection techniques often limit the studies. In this paper, Raman spectroscopy was applied to study the biological effects of low-dose radiation. Raman spectroscopy at 10 mW and 532 nm were used to analyze human neuroblastoma cells irradiated by X-ray at 100, 200 and 500 mGy. The DNA related Raman characteristic spectroscopic peaks of purine nucleotides (722~728, 1 572~1 581 cm-1, etc. ) and pyrimidine nucleotides (770~785 cm-1, etc.) were changed by ionizing radiation, indicating that low-dose X-ray irradiation caused changes in cell DNA level. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle of human neuroblastoma cells cultured for 6 hours after irradiation under the same conditions. All three doses of X-ray ionizing radiation caused cell stagnation in the G2 phase of the cell cycle, which also suggested that ionizing radiation caused the increase of DNA level. Analysis of cell migration at 20 h after irradiation by scratch assay showed that human neuroblastoma cells exposed to all three doses of ionizing radiation showed reduced levels of migration compared to control cells not exposed to X-ray. Raman spectroscopy showed that low dose X-ray ionizing radiation induced changes in the DNA level of human neuroblastoma cells, and that was consistent with the cell cycle analysis and migration analysis, but the detection time was much earlier. Raman spectroscopy can be used to detect and monitor the early biological effects of low-dose radiation.

Key words: Raman spectroscopy; Low-dose ionizing radiation; Radiobiological effects
引言

低剂量电离辐射(通常指200 mGy以下)普遍存在于自然和人工环境中, 其细胞生物学效应相较于高剂量电离辐射更加隐秘、 复杂而多样[1, 2]。 低剂量辐射生物效应在生物医学和临床医学等领域具有重要的研究意义和应用价值, 但目前仍然缺乏理想的低剂量辐射生物标志物以及简易快速的生物效应分析检测技术手段[3]。

拉曼光谱是基于拉曼散射效应的分子振动光谱, 既可以检测分子结构的变化, 也能够检测分子组成的变化[4, 5]。 拉曼光谱在生命科学研究领域有着独特的技术优势, 诸如: 高灵敏度, 样本无需标记、 无需复杂的预处理, 可实现原位定点检测, 等等[6]。 目前已经建立了包括核苷酸、 多肽、 脂类在内的诸多生物分子的拉曼图谱[7, 8, 9, 10, 11, 12]。 本文利用共聚焦拉曼光谱技术研究低剂量X射线辐射对人神经母细胞瘤细胞的影响, 探索一种相对简易的、 能够及时发现早期低剂量辐射生物学效应的新方法。

1 实验部分
1.1 细胞培养

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购买自揽宝生物(中国上海), 在含有10%FBS(Hyclone, 美国)和1%三抗(Gibco, 美国)的DMEM培养基(Biological Industries, 以色列)中, 于37 ℃, 5%CO2的合适湿度中培养。

1.2 X射线辐照

采用X-RAD 320辐照仪(Precision X-Ray Incorporated, 美国)和F2滤板(1.5 mm Al+0.25 mm Cu+0.75 mm Sn)对细胞进行照射, 电压320 kV, 电流2 mA, 单次源靶距60 cm, 剂量率1.8 mGy· s-1。 辐照剂量分别为0(对照), 100, 200和500 mGy。

1.3 样品制备

将SH-SY5Y细胞以5× 104细胞/孔的密度接种在6孔板(Corning, 美国)中的24 mm圆形玻璃盖玻片(Solarbio, 中国北京)上, 并培养过夜。 辐照后静置30 min, 将细胞用PBS洗涤一次, 并用4%多聚甲醛(Solarbio)固定30 min, 然后用PBS洗涤两次。 盖玻片上的细胞在检测之前存储在4 ℃。

1.4 光谱采集

拉曼光谱测量采用自研的共聚焦拉曼光谱设备进行, 激发光波长为532 nm, 激光功率10 mW, 使用100× 物镜(NA=0.90)聚焦激光和收集拉曼信号。 设备已经过氖灯灯线进行光谱线性和频率校正, 并进一步采用硅和金刚石拉曼信号进行校正。 光谱分辨率为3.6 cm-1, 连续采集光谱的信号重复性优于0.1 cm-1。

每个拉曼图谱由3次信号采集平均而得。 每个样品采集10~15个细胞, 每个细胞采集细胞核内7~10个不同位点; 由此, 每个样品采集100多个图谱, 取其平均用于比较和分析。 玻璃盖玻片的拉曼信号同样被采集, 并在后续分析中扣除。

1.5 细胞周期分析

X射线照射后的细胞继续培养6 h。 用胰蛋白酶(普诺赛, 中国武汉)消化后收集细胞, 用PBS洗涤一次, 以2 500 r· min-1的速度离心4 min, 然后用70%的乙醇固定并在4 ℃孵育过夜。 细胞周期分析试剂盒(碧云天, 中国江苏)用于检测细胞周期。 细胞以2 500 r· min-1的速度离心4 min后用PBS洗涤一次, 将细胞沉淀重悬于500 μ L染料结合溶液中, 并与RNase A(50 μ g· mL-1)和PI(20× )在37 ℃孵育30 min。 使用流式细胞仪(Accuri C6 Plus, BD Biosciences, 美国)分析样品。

1.6 细胞迁移分析

利用划痕实验检验X射线对细胞迁移的抑制。 SH-SY5Y细胞在24孔板(Corning)中培养24 h, 然后用10 μ L枪头在汇合的单层细胞上划一道, 用PBS洗涤划痕两次, 以除去未贴壁的细胞碎片, 并向每个孔中加入2 mL新鲜的10%培养基。 X射线照射后培养20 h, 以100倍放大倍数在显微镜(Mshot, 中国广州)下拍摄穿过伤口区的迁移细胞。 手动测量划痕面积, 计算20 h后划痕面积占之前划痕面积的百分比。 比值越大, 则迁移水平越低。

1.7 统计学分析

每组实验进行三次或三次以上生物学重复, 并计算平均值和标准偏差。 单因素方差分析用于成对数据, 多因素方差分析用于分析成组数据。 p< 0.05的值被定为具有显著的统计学意义。

2 结果与讨论
2.1 拉曼光谱分析显示辐照后细胞内核苷酸水平变化

图1显示的是不同剂量X射线辐照之后的细胞样品的拉曼光谱(已扣除玻璃盖玻片本底信号)。 灰色标记的4个拉曼峰与DNA相关: 725 cm-1(腺嘌呤)[9]、 780 cm-1(O— P— O stretching、 嘧啶核苷酸)[9, 10]、 1 093 cm-1(O— P— O stretching)[9, 11, 12]、 1 580 cm-1(腺嘌呤、 鸟嘌呤)[9]。 我们对这4个拉曼特征峰进行积分, 计算获得了相应的峰面积, 列入表1。 X射线辐照过的细胞相较于对照细胞的4个拉曼峰面积均有不同程度的增加, 提示DNA相关物质的水平可能因电离辐射而升高。

图1 SH-SY5Y细胞经不同剂量(0, 100, 200和500 mGy)X射线辐照后的拉曼光谱
灰色显示的拉曼峰值分别为725, 780, 1 093和1 580 cm-1Fig.1 Mean Raman spectra of SH-SY5Y cells irradiated at 0 (sham control), 100, 200, and 500 mGy
The spectra are shifted in intensity to allow the comparison. The grey bars indicate the peaks at 725, 780, 1 093 and 1 580 cm-1

表1 峰面积积分结果 Table 1 Spectral peak areas of Fig.1

将图1中三个辐照剂量的细胞拉曼图谱减去未接受辐照的对照细胞图谱, 获得3条差谱(图2)。 图2中灰色标记的拉曼峰均与DNA相关(表2), 结果同样提示DNA水平可能因电离辐射而升高。

图2 SH-SY5Y细胞经不同剂量(100, 200, 500 mGy)X射线辐照后相较于对照(0 mGy)的拉曼差谱Fig.2 Difference Raman spectra of SH-SY5Y cells irradiated at 100, 200, and 500 mGy compared to the sham controls. The spectra are shifted in intensity to allow the comparison. The grey bars indicate DNA

表2 已知DNA相关的拉曼峰[9] Table 2 Raman peaks related to DNA reported in the literature[9]
2.2 细胞周期分析显示辐照促进细胞G2期阻滞

SH-SY5Y细胞经X射线照射后继续培养6 h之后, 检测其细胞周期分布情况。 相较于未接受辐照的对照细胞, 三个剂量的电离辐射均造成细胞在G2期停滞(p< 0.01), 但三个剂量之间没有统计学意义的差别(p> 0.05)。 细胞G2期的DNA含量是G1期的2倍, 因此细胞周期分析结果与拉曼图谱分析结果一致, 均提示电离辐射引起DNA水平升高。

图3 SH-SY5Y细胞经不同剂量(0, 100, 200和500 mGy)X射线辐照后继续培养6 h后的细胞周期分析(n=3, * * p< 0.01)Fig.3 Cell cycle analysis of SH-SY5Y cells irradiated at 0 (sham control), 100, 200, and 500 mGy. Data were expressed as mean ± SD (n=3). * * p< 0.01 versus the controls (0 mGy)

2.3 细胞迁移分析显示辐照影响细胞迁移水平

细胞周期分析结果显示电离辐射导致细胞周期停滞, 我们通过划痕实验考察辐照后20 h之后SH-SY5Y细胞增殖和迁移水平(图4), 印证了之前的实验结果。 如图5所示, 相较于未接受辐照的对照细胞, 三个剂量的电离辐射均造成细胞迁移减缓(p< 0.01), 但三个剂量之间没有统计学意义的差别(p> 0.05)。

图4 SH-SY5Y细胞迁移分析的代表性显微照片
(a): 对照细胞辐照前; (b): 对照细胞培养20 h后; (c): 100 mGy剂量辐照前; (d): 100 mGy剂量辐照后培养20 h; 标尺: 200 μ mFig.4 Representative microscopy images of the migration analysis of SH-SY5Y cells
Scale bar: 200 μ m

图5 SH-SY5Y细胞经不同剂量(0, 100, 200和500 mGy)X射线辐照后继续培养20 h后的划痕面积相较于辐照之前的百分比(n=6, * p< 0.01)Fig.5 Ratios of the gap areas for SH-SY5Y cells cultured for 20 h post irradiation at 0 (sham control), 100, 200, and 500 mGy to those before irradiation. Data were expressed as mean ± SD (n=6). * p< 0.01 versus the controls (0 mGy)

3 结论

通过拉曼光谱分析发现低剂量X射线电离辐射引起人神经母细胞瘤细胞DNA水平变化, 其结果与细胞周期分析和迁移分析的结果相一致, 但检测时间大大提前。 拉曼光谱技术有助于及时而有效的检测低剂量电离辐射的早期细胞生物学效应。

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