试剂: 含牛肝微粒体细胞色素b₅水溶性片段基因质粒由美国西北大学Hoffman教授惠赠; 蛋清溶菌酶和Ampicillin(购于Sigma公司); BL21-DE3感受态细胞(购于宝生物有限公司); 酵母提取物和蛋白胨(购于OXOID公司); DEAE Sepharose^TM CL 6B(购于GE公司)、 Sephadex^TM G-100(购于Amersham公司)、 其他试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水。

仪器: V-560紫外-可见分光光度计(日本Jasco公司); RF-6000荧光分光光度计(日本岛津公司); J-810型圆二色谱仪(日本Jasco公司)。

(1)细胞色素b₅蛋白溶液的获得^[14]。

转化(将含Cyt b₅外源基因质粒通过热击转化至大肠杆菌BL21-DE3感受态细胞中)→ 筛选阳性克隆(选取在含Amp⁺的LB固体培养基上生长的红色菌落)→ 菌体培养和收集(含Amp⁺的LB液体培养基培养20~24 h后, 4 ℃、 5 000 r· min^-1、 10 min离心收集菌体备用)→ 蛋白获取(菌体经溶菌酶和超声裂解、 透析、 DEAE-CL-6B和Sephadex G-75柱层析、 最后收集、 浓缩)→ 纯度鉴定, 最终得到纯度在96%以上的Cytb 5蛋白浓缩液→ -196 ℃液氮保存。 Cyt b₅浓度测定: 根据摩尔消光系数ε ₄₁₂=117 mM^-1· cm^-1[14], 采用朗博-比尔定律进行定量分析。

(2)UV-Vis吸收光谱

Cyt b₅溶解于pH7.4, 0.05 mol· L^-1的PB缓冲液进行测定。 还原态Cyt b₅溶液为加入0.25 mol· L^-1 Na₂S₂O₄获得。 扫描波长: 220~700 nm, 扫描速率: 200 nm· min^-1, 取三次实验平均结果等。

(3)荧光光谱测定

Cyt b₅溶解于pH 7.4, 0.05 mol· L^-1的PB缓冲液进行测定。 扫描波长范围: 290~450 nm, 扫描速率: 200 nm· min^-1, 累计三次取平均结果。

(4)圆二色谱(CD)

Cyt b₅溶解于pH 7.4, 0.05 mol· L^-1的PB缓冲液进行测定。 扫描范围: 190~250 nm, 光径: 1 mm, 扫描速度: 50 nm· min^-1, 取3次平均结果。

Cyt b₅蛋白电子传递功能的完成通过其活性中心的血红素中心铁的价态变化来实现, 实验结果见图1。 Cyt b₅-Fe^Ⅲ 的特征吸收峰波长为412, 532和560 nm, 还原态的Cyt b₅-Fe^Ⅱ 的特征吸收峰波长423, 527和556 nm。 实验前对Cyt b₅进行UV-Vis光谱表征(图1), 可知样品Cyt b₅主要以氧化态形式存在。 光谱显示了350~700 nm范围内的三个吸收带, 412, 560和532 nm。 随后用Na₂S₂O₄还原, 产生红线所示的吸收光谱。 还原形式的Soret带红移11 nm, Q波段峰强度增加峰位置发生移动, 在527和556 nm处形成两个吸收峰, 说明以氧化态形式存在的Cyt b₅被还原。

图1

Fig.1

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	图1 细胞色素b5的紫外-可见吸收光谱Fig.1 Stationary absorption spectra of completely oxidized (black) and completely reduced (red) Cyt b5

图2(a)和(b)为氙灯分出的280 nm单色光照射Cyt b₅溶液的紫外-可见吸收光谱。 随着光照时间延长, Cyt b₅的Soret带412 nm处吸收峰强度逐渐降低并红移到421 nm处, 其Q带532和560 nm处吸收峰强度降低, 最终在527和556 nm形成新吸收峰, 同时在416和546 nm附近出现两个等吸收点。 与图3中的结果比较可发现Cyt b₅在280 nm氙灯光照后吸收光谱图与化学还原后的谱图变化趋势一致。 向Cyt b₅样品中加入不同浓度的Na₂S₂O₄溶液, 充分反应2 min后UV-Vis光谱表明, Cyt b₅样品412 nm处的特征吸收峰强度随着Na₂S₂O₄溶液浓度的增加而逐渐降低并红移至423 nm[图3(a)], 其Q带532和560 nm处的特征吸收峰逐渐增强[图3(b)]。 当加入过量Na₂S₂O₄时, 其Q带527和556 nm吸收峰不断增强, 最终在416和546 nm附近出现两个等吸收点。 UV-Vis光谱表明在室温条件下光照Cyt b₅可产生与上述化学还原过程类似现象。 光照还原Soret带峰位置未达最终还原态423 nm, 归因于少量的蛋白质发生变性。 即使在光还原Cyt b₅中加入还原剂Na₂S₂O₄其峰强度仍然比直接化学还原Cyt b₅的还原峰强度要小(数据未列出)。

图2

Fig.2

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	图2 Cyt b5光照前后的UV-Vis吸收光谱图 (a): 光照前; (b): 光照后Fig.2 UV-Vis absorption spectra of Cyt b5 with/without irradiation at 280 nm (a): Before illumination; (b): Upon illumination ccyt b5=5× 10-6 mol· L-1

图3

Fig.3

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图3 Cyt b5化学还原的UV-Vis吸收光谱 (a): 含有连二亚硫酸钠的Q带吸收峰; (b): 连二亚硫酸钠浓度从a→ e的光谱Fig.3 UV-Vis absorption spectra of chemical reduction for Cyt b5 with sodium dithionite (a): The absorption spectra of chemical reduction for Cty b5 in soret band with sodium dithionite; (b): The obsorption spectra of chemical reduction for Cty b5 in Q band with sodium dithionite ccyt b5=3× 10-6 mol· L-1, from a to e, cNa2S2O4=0, 3, 6, 9, 12× 10-6 mol· L-1, respectively

爱因斯坦光子理论阐述: 光能量与波长呈反比; 而物质结构不同, 会吸收不同波长的光。 为了探究波长对Cyt b₅光照还原的影响, 实验选用氙灯分出的不同定波长(254, 280, 412和423 nm)照射Cyt b₅溶液25 min。 经不同波长光照射后, Cyt b₅的Soret带412 nm处特征吸收峰强度均降低并红移, 其Q带527和556 nm处的特征吸收峰有明显增强。 在不同的波长光照射下, 随着光照时间延长527和556 nm处吸收峰强度发生变化, 但变化的趋势不同。 其中280 nm光照射时527和556 nm吸收峰强度增加的趋势最大, 即还原产物Cyt b₅-Fe^Ⅱ 最多。 图4(a— d)分别为四种波长光照射Cyt b₅对还原影响程度, 280 nm> 254 nm, 412和423 nm对光照还原没有影响。 由此说明Cyt b₅被紫外光诱导还原, 还原程度并非与光照射能量成正比。 Cyt b₅分子中有1个 Trp、 4个Tyr和3个Phe残基。 280 nm光照引起的还原反应现象最明显的原因是280 nm波长光易被Trp吸收。 光子被Trp大量吸收形成激发态, Trp通过激发能量传递至铁卟啉基团激发态, 进而引发光氧化过程。 280 nm光能被大量吸收, 能量比较高, 因此比254 nm更有利于光照氧化。 分析认为, 412、 423 nm不是芳香族氨基酸的特征吸收峰, 能量比较低, 难以激发铁卟啉基团至激发态, 与Consani 等^[15]提及的Trp在肌红蛋白Trp-to-Heme能量传递过程中起重要作用的结论相吻合; 另一方面, 这些波长引发的还原速率非常慢, 氧气可能会泄露到样品中, 从而阻止蛋白质发生光还原。

图4

Fig.4

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	图4 不同定波长氙灯光照Cyt b5(pH 7.4) 25 min后紫外-可见吸收变化光谱图 (a): 254 nm; (b): 280 nm; (c): 412 nm; (d): 423 nmFig.4 UV-Vis absorbance change of Cyt b5 irradiated by xenon lamp at different fixed wavelengths (a): 254 nm; (b): 280 nm; (c): 412 nm; (d): 423 nm

Cyt b₅蛋白在不同的pH缓冲溶液中显示不同的价态和构象。 研究了pH为5.4, 6.4, 7.4, 8.0和9.0缓冲溶液中的光还原情况。 在pH为5.4缓冲溶液中, 基线有明显的漂移现象, 为了分析数据的准确性, 采用峰面积对pH作图分析。 如图5(a, b)所示分别在五个不同pH条件下, 280 nm光照对Cyt b₅光还原的影响。 光照前, 560 nm处吸收峰面积随着pH的升高而略微增加, 但Soret带的特征吸收峰位置仍在412 nm处, 说明Cyt b₅未发生还原反应; 光照25 min后, 随着pH由酸性到碱性的变化, Cyt b₅溶液的Soret带和Q带的吸收峰面积逐渐增加, 实验范围内, 即pH值越大越容易发生光还原反应。 分析认为光还原过程中会产生部分H⁺, 碱性条件下OH^-会中和部分H⁺, 因此Cyt b₅在偏碱性条件下易于发生光照还原。

图5

Fig.5

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	图5 不同pH条件下Cyt b5溶液光还原峰面积的变化曲线 (a): 412 nm处吸收峰曲线变化; (b): 556 nm处吸收峰曲线变化Fig.5 Curve of irradiation reduction peak area of Cyt b5 solution under different pH conditions at 280 nm (a): The peak area changes at 412 nm; (b): The peak area changes at 556 nm

谷胱甘肽(GSH)在所有生物细胞中存在, 其还原性的巯基有很强的供电子能力, 可参与体内重要的氧化还原反应。 GSH的巯基有微弱的还原性, 黑暗条件下不会直接与蛋白相互作用, 采用氙灯280 nm光激发卟啉后, GSH开始参与反应并对Cyt b₅的还原反应起促进作用。 光照作用明显提高了GSH的还原能力(见图6)。 GSH巯基(— SH)上的S原子带有孤电子对, 可以提供电子给Fe^Ⅲ , 当Cyt b₅被光照后形成激发态的高铁血红素辅基, 电子从卟啉环转移到中心铁原子上形成亚铁血红素辅基阳离子自由基, S原子提供电子给亚铁血红素辅基, 促进了亚铁Cyt b₅的形成。 以上结果表明GSH和卟啉均非光照氧化还原过程中的氧化剂或者还原剂, 类似于叶绿素光反应过程, 它们都是电子传递的“ 中间人” , 整个反应是卟啉、 GSH和铁之间的能量和电子传递过程, 此链式超快电子转移过程是在溶液中光激发铁卟啉和GSH后进行的。

图6

Fig.6

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	图6 加入GSH (pH 7.4) 25 min后Cyt b5的 紫外-可见光谱图 a: Cyt b5未做处理; b: Cyt b5光照25 min; c: 加入GSH的Cyt b5光照25 minFig.6 UV-Vis absorbance change of Cyt b5added GSH under pH 7.4 a: Cyt b5; b: Cyt b5 irradiated at 25 min; c: Cyt b5-GSH irradiated at 25 min

图7中从Soret和Q带峰强度和峰位置可以判断出, 未加入Met时其Soret带峰位置没有发生明显变化仍为412 nm, 但是其峰强度有小幅度的下降, 其Q带在566 nm形成一个微弱的小峰; 加入Met时其Soret带峰位置发生明显改变由412 nm红移到420 nm处, 其Q带556 nm处形成一个非常明显的还原峰。 通过比较可以确定Met对光照还原有非常好的促进作用。 分析认为Met在Cyt b5被光照还原过程中产生的· OH自由基产物被Met清除, 进而促进了光照还原速率的提升^[16]。

图7

Fig.7

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	图7 加入Met (pH 7.4)5 min后Cyt b5的紫外-可见光谱图 a: Cyt b5未做处理; b: 暗处理30 min Cyt b5; c: 光照5 min Cyt b5-GSH; d: 加入Met后Cyt b5光照5 minFig.7 UV-Vis absorbance change of Cyt b5added Met under pH 7.4 a: Cyt b5; b: in dark 30 min; c: Cyt b5 irradiated at 5 min; d: Cyt b5-Met irradiated at 5 min

取2 μ L 0.02 mol· L^-1的咪唑溶液于2 mL Cyt b₅蛋白溶液中黑暗中放置30 min, 测其紫外-可见吸收光谱, 发现谱图基本没有发生变化。 图8(a, b)分别为Cyt b₅在光照射前后其412和556 nm处峰面积的变化图, 由图8可知: 咪唑可促进Cyt b₅光还原反应的发生。 咪唑加入Cyt b₅蛋白溶液后, 可以作为光还原电子供体促进光照还原反应的进行。 咪唑的五元芳杂环中含有两个间位的氮原子, 与组氨酸结构类似可结合血红素, 其1-位氮原子的未共用电子对参与环状共轭, 导致氮原子的电子云密度有所下降, 从而1-位氮原子上的氢易以H⁺形式离去。 咪唑残基上的给电子基团对还原速率具有显著促进作用。

图8

Fig.8

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	图8 加入咪唑(pH 7.4)25 min后Cyt b5的紫外-可见光谱图 (a): 420 nm峰面积变化; (b): 556 nm峰面积变化Fig.8 UV-Vis absorbance change of Cyt b5added imidazole under pH 7.4 (a): The peak area changes at 412 nm; (b): Area changes at 556 nm

为了进一步了解连续UV光照射对蛋白质构象方面的影响。 图9为280 nm照射25 min的Cyt b₅前后荧光发射光谱图。 Cyt b₅的333 nm是最大发射波长, 主要由生色氨基酸残基如Trp, Tyr和Phe周围环境变化引起^[16]。 随着光照时间的延长, 经280 nm单色光照射后的Cyt b₅在~333 nm处的荧光发射强度降低了38%, 且最大发射波长红移到了336 nm。 表明Cyt b₅芳香族氨基酸的微环境发生了改变。 Trp²²(Trp位于蛋白一级结构第22位)和Cyt b₅的血红素可以发生较强的能量转移过程, Trp的疏水环境遭到破坏, 亲水性越强, 能量越低^[17], 即连续280 nm照射25 min后, Cyt b₅中Trp的疏水区更加暴露于极性的水环境中。 这种三级构象的改变也可能是由于蛋白质二级结构的改变而引发的^[18]。 由紫外可见光谱的确可以发现Cyt b₅中有部分蛋白发生变性。

图9

Fig.9

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	图9 Cyt b5 在280 nm光照不同时间下的荧光光谱图 a→ f: 0, 5, 10, 15, 20, 25 min光照时间荧光谱图变化Fig.9 Fluorescene spectra of Cyt b5 at different irradiated time at 280 nm Frome a to f, the irradiation times were 0, 5, 10, 15, 20, 25 min, respectively

Cyt b₅的CD谱(350~700 nm)能够揭示蛋白质二级机构变化的信息^[19]。 如图10所示208和222 nm是Cyt b₅ α -螺旋结构的特征峰, 随着光照时间的延长Cyt b₅的CD谱图发生变化, 208和222 nm处负峰振幅明显减弱, CD谱图的峰强度发生一定变化, 但是形状和肩峰的位置未发生明显改变。 部分α -螺旋转变成β -折叠, 说明随着Cyt b5光照还原的发生, 蛋白质内部疏水残基基团的不断暴露, 与荧光光谱结果一致, 光照过程导致Cyt b₅二级结构发生了一定改变, 但是整个Cyt b₅的二级结构仍以α -螺旋为主, 说明光照时间内Cyt b₅蛋白未完全变性。

图10

Fig.10

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	图10 280 nm氙灯照射后Cyt b5的CD光谱图 光照时间从a→ c: 0, 10, 25 minFig.10 CD spectra of Cyt b5 after irradiation with xenon lamp at 280 nm From a to c, the irradiation times were 0, 10, 25 min, respectively